- 基因工程藥物研究與應用
- 李校堃主編
- 9字
- 2021-04-16 15:28:37
第五節 重組菌的篩選
一、根據篩選標記進行篩選
目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的,因而最后生長繁殖出來的細胞并不都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA,一個細胞只接受一個重組DNA分子。最后培養出來的細胞群中只有一部分,甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體(recombinant)。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆,所以篩選(screening)是基因克隆的重要步驟。
最常見的載體攜帶的標志是抗藥性標志,如抗氨芐西林( Ampr)、抗四環素 Tetr)、抗卡那霉素( Kanr)等。當培養基中含有抗生素時,只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖,這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活,這個抗藥性標志就會消失。例如質粒pBR322含有 Ampr和 Tetr兩個抗藥基因,若將目的序列插入 Tetr基因序列中,轉化大腸埃希菌,讓細菌放在含氨芐西林或四環素培養基中,凡未接受質粒DNA的細胞都不能生長;凡在含氨芐西林和四環素中都能生長的細菌是含有質粒pBR322的,但其pBR322未插入目的序列,凡在氨芐西林中能生長而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質粒。
載體含有 lacZ’的藍白篩選法,近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質粒pUC19的多克隆位點,轉化大腸埃希菌,放入含氨芐西林、IPTG、X-gal的培養基中培養,凡能生長并呈白色的菌落,其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質粒,這樣就很容易獲得目的序列的克隆。
根據重組載體的標志來篩選,可以篩去大量的非目的重組體,但還只是粗篩,例如細菌可能發生變異而引起抗藥性的改變,卻并不代表目的序列的插入,所以需要作進一步細致的篩選。
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