外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鍵。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鍵。但如果質粒DNA已去磷酸化，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸埃希菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在載體連接反應中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。因為它能有效地將平端DNA片段連接起來。

DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產生黏端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體DNA，再加作用的底物。如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大（因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。這樣，在DNA濃度低時，質粒DNA重新環化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接反應的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等從理論上探討了DNA濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決于兩個參數：j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的DNA呈隨機卷曲。這樣，j與DNA分子的長度成反比（因為DNA越長，某一給定分子的兩末端越不可能相互作用），因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數，與DNA深度無關。j=［3/（3πlb ₀）］3/2，其中l是DNA長度，以厘米（cm）計，b是隨機卷曲的DNA區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而后者可影響DNA的剛度。i是溶液中所有互補末端的深度的測量值。對于具有自身互補黏端的雙鏈DNA而言，i=2NoM×10 ^-3末端/ml。這里No是阿佛加德羅常數，M是DNA的摩爾濃度（單位：mol/L）。理論上，當j=i時，給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j＞i時，有利于重新環化；當i＞j，則有利于產生多聯體。DNA區段的大小與連接反應混合物中j∶i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關系（Dugaiczyk等，1985）。現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對于一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響，而且還受質粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。當i是j的2～3倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）時，有效重組體的產量可達到最大。這些條件下，連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源DNA所形成的嵌合體。

涉及帶黏端的線狀磷酸化質粒DNA的連接反應包含：①足量的載體DNA，以滿足j∶i＞1和j∶i＜3。對一個 pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體 DNA為20～60μg/ml。②末端濃度等于或稍高于載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在有效連接產物的數量會很低，這樣就很難鑒別小部分帶重組質粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒DNA以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。

1.用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段和（或）用堿性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚∶三氯甲烷抽提和乙醇沉淀來純化DNA，然后用TE（pH7.6）溶液使其濃度為100ng/ml。

2.按如下所述設立連接反應混合物

（1）將0.1μl載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源DNA。

（2）加水至7.5μl，于45℃加溫5分鐘以使重新退火的黏端解鏈，將混合物冷卻到0℃。

（3）加入：10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液1μl；T4噬菌體DNA連接酶0.1Weiss單位；5mmol/L ATP 1μl。于16℃溫育1～4小時。其中10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液包括：200mmol/LTris.Cl（pH7.6）、50mmol/LMgCl ₂、50mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ⅴ，Sigma產品）（可用可不用），該緩沖液應分裝成小份，貯存于-20℃。

另外，再設立兩個對照反應，其中含有：①只有質粒載體；②只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個連接反應可用50～100ng質粒DNA，并盡可能多加外源DNA，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數制造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等對該酶進行標化。1個Weiss單位是指在37℃下20分鐘內催化1mmol 32P從焦磷酸根置換到［γ，β-32P］ATP所需酶時，1個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman，1970）或者60個黏端單位（如New England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液（1～5U/μl），可用20mmol/L Tris.Cl（pH7.6）、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘油稀釋成100U/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬菌體DNA連接酶于-20℃保存3個月可保持穩定。③每個樣品各取1～2μl轉化大腸埃希菌感受態細胞。

T4噬菌體DNA連接酶不同于大腸埃希菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接（Sgaramella和Khorana，1972；Sgaramella和Ehrlich，1978），由于DNA很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何DNA分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下4個條件：①低濃度（0.5mmol/L）的ATP；②不存在亞精胺一類的多胺；③極高濃度的連接酶（50Weiss單位/m l）；④高濃度的平端。