2001年的WHO淋巴瘤分類標志著淋巴瘤的病理診斷進入了“綜合時代”，即將臨床特征、組織形態學、免疫表型、分子遺傳學特征進行綜合評價來作出淋巴瘤病理學診斷和分類的時代。目前認為，淋巴瘤的每一種亞型都是一個獨立的疾病，都有著自己獨特的臨床表現、形態學特征、免疫表型及分子遺傳學特點。

淋巴瘤不同的亞型有著不同的預后，需要不同的治療，即使是相同亞型的腫瘤由于攜帶不同的分子遺傳學異常對治療的反應也可能不同。因此，淋巴瘤正確的診斷與分型是治療的關鍵。雖然多數造血與淋巴系統腫瘤綜合臨床特征、組織形態學、免疫表型特征可得到正確診斷，但很多情況下，分子遺傳學的檢測可以提供更多普通病理學檢查所不能提供的信息，從而有助于腫瘤的診斷、預后判定、治療指導、微小殘余病變的監測。把分子遺傳學的檢測（染色體/基因異常）納入淋巴瘤的分類或視之為部分病理亞型分型的重要依據，說明了其地位的重要性。

分子遺傳學在很大程度上已經揭示了免疫系統的正常發生和起源于免疫系統的腫瘤的發病機制。應用分子生物學的基本方法，以常規的病理標本為材料，通過檢測分子遺傳學異常，可以對絕大多數淋巴瘤作出精確診斷。分子遺傳學異常作為一個獨特的腫瘤分子標記可用于淋巴瘤的分類、預后判定、治療指導、微小殘余病變監測。而且，分子遺傳學的異常改變要遠遠早于其他常規方法可檢測到的異常。本章我們將介紹分子遺傳學的基本知識及如何應用分子生物學的基本方法檢測淋巴瘤的分子遺傳學異常。

淋巴瘤是一個淋巴細胞（單）克隆性（clonal）增殖性疾病。在絕大多數淋巴瘤中，基因組DNA重排往往發生于克隆性增殖之前，因而一個淋巴瘤通常由遺傳學特征完全一致的一個前體細胞的子代細胞組成，即淋巴瘤為（單）克隆性起源。在每一個子代細胞中至少含有一個完全相同的遺傳標記物。正常細胞中不存在而腫瘤細胞中存在的獨特的DNA重排（rearrangement）可以作為一個獨特的腫瘤標記物，用來區分腫瘤細胞和正常細胞。

DNA或基因重排（gene rearrangement）可以是生理性的，也可以是病理性的。前者如B細胞抗原受體基因免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）基因和T細胞抗原受體基因（T cell receptor，TCR）的重排，后者則是由于染色體異常，如染色體易位而導致的基因重排。

免疫球蛋白和T細胞受體基因重排發生在幾乎所有相應的B和T淋巴細胞上，故為生理性重排。雖然該重排事件本身與腫瘤轉化無關，卻可用于克隆性分析，以幫助區別良性淋巴組織增生和淋巴瘤。

淋巴細胞有別于其他造血細胞的特點之一是存在抗原受體基因的重排，即IG和TCR基因的重排。每個淋巴細胞都具有特定的基因重排方式，因而形成獨特的IG和TCR基因序列，產生獨特的IG和TCR蛋白分子，即抗原受體，以應對內外環境中多種多樣的抗原而進行免疫反應。后天獲得性適應性免疫系統的首要效應分子就是抗原受體，IG和TCR基因的功能和結構獨特且非常復雜。

Ig分子由B淋巴細胞產生，各種Ig分子均具有相似的由四條多肽鏈構成的Y字形結構，即由兩條相同的重鏈（immunoglobulin heavy chain，IgH）和兩條相同的輕鏈（immunoglobulin light chain，IgL）構成。根據免疫原性的差異，IgH有五種亞單位，即α、δ、ε、λ和μ鏈，它們決定了Ig或抗體的類別，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；IgL有κ鏈（Igκ）和λ鏈（Igλ）兩種，通常一個Ig分子只能具有兩種IgL中的一種，即或為κ鏈或為λ鏈。

不同的Ig分子中，IgH和IgL的N端部分的氨基酸序列變化較大，因而稱之為可變區（variable region，V區）；其余部分氨基酸序列相對恒定，故稱之為恒定區（constant region，C區）。V區氨基酸序列的差異性主要體現在3個氨基酸多變的超變區（hypervariable region，HV），即互補決定區（complementarity determining region，CDR）。CDR才是真正的抗原結合位點。在V區內相對保守的氨基酸序列不與抗原結合，稱之為骨架區（framework region，FR）。

TCR分子是T細胞特有的表面標志。TCR具有四個亞單位，即α、β、γ和δ四種肽鏈。每條肽鏈也由可變區（V區）和恒定區（C區）組成。TCR的V區氨基酸的主要差異性體現在3個CDR和第四個高變（hypervariable，HV4）區。3個CDR 和HV4區共同決定TCR的特異性抗原識別。

根據其異源二聚體組成的不同，TCR可分為αβ型和γδ型兩種，大多數T細胞上的抗原受體為αβ型TCR（95%），僅少部分為γδ型TCR（5%）。

人類IG中的IGH、IGκ和IGλ基因分別定位于染色體14q32 （1Mb）、2p12（1.8Mb）和22q11（0.8-3Mb）上。各基因在除B細胞以外的體細胞及淋巴細胞的最初始階段是不連續的，它們分別由分散在不同位置上的基因片段（segment）組成（胚系結構）。在淋巴細胞分化早期，各個分隔的片段組合在一起才可形成一個連續的完整基因。這種基因片段重新組合的過程即所謂基因重排（gene rearrangement）。

IGH基因的胚系結構由V（variable，V _H）、D（diversity，D _H）、J（joining，J _H）和C （constant，C _H）四個不連續的區域（region）構成，每個區域又由多個片段（segment）組成。目前已發現人V _H區有66個片段（分為7個家族V _H1～V _H7）；D _H區有27個片段（分為7個家族D _H1～D _H7）；J _H區有6個片段J _H1～J _H6；C _H區有11個片段。一個IGH基因即是由V _H-D _H-J _H-C _H四個片段相連而成（圖2-1）。

IGκ和IGλ基因的胚系結構不含D區。IGκ基因由V _κ-J _κ-C _κ構成，V _κ區有76個片段（分為7個家族V _κ1～V _κ7）；J _κ區有5個片段J _κ1～J _κ5；C _κ區只有1個。IGλ基因由V _λ-J _λ-C _λ構成，V _λ區有38個片段（分為10個家族V _λ1～V _λ10）；J _λ區和C _λ區各有7個基因片段，其分布與IGH和IGκ不同，J _λ和C _λ成對排列（圖2-1）。

整條鏈的基因由不同的V、D、J和C基因簇經隨機重排后重組而形成。其中IGH的V區由VDJ重組組成，IGκ及IGλ的V區則僅由V和J基因片段組合而成。

編碼人TCR的α/δ鏈、β鏈和γ鏈的基因位點分別定位于染色體14q11（1Mb）、7q34（700kb）和7p15（150kb），編碼TCR的δ鏈的基因位于編碼TCR的α鏈的基因之中。與編碼Ig各鏈的基因結構相似，α鏈和γ鏈是由V、J、C基因片段編碼的肽鏈，V、J基因編碼可變區，C基因編碼恒定區。β鏈和δ鏈是由V、D、J、C基因片段編碼的肽鏈，V、D、J基因編碼可變區，C基因編碼恒定區。

TCRα的V _α區有54個片段（分為32個家族V _α1～V _α32），J _α區有61個片段，C _α只有1個片段；TCRβ的V _β區有67個片段（分為30個家族V _β1～V _β30），J區有13個片段，D區和C區各有2個片段；TCRγ的V _γ區有9個片段（分為4個家族V _γ1～V _γ4），J區有5個片段，C _γ區有2個片段；TCRδ的V _δ區有8個片段，D區和J區各3個片段，C _δ區只有1個片段，δ鏈基因比較特殊，整個基因位于α基因位點的V _α基因和J _α基因群之間。

人類有效的免疫反應取決于每一個B細胞和T細胞都可產生自己獨特的Ig和TCR分子。人體內，Ig分子大約有2×10 ⁶種，TCRαβ分子大約有3×10 ⁶種，TCRγδ分子大約有5×10 ³種。Ig和TCR分子總的種類可超過10 ¹²種。

Ig和TCR分子種類的多樣性除與胚系基因的多樣性（V、D、J片段的數量）有關外，另外也與基因重組的多樣性［V-（D）-J重組的數量］和連接的多樣性（V、D和J片段間連接時堿基的丟失和插入）有關。在免疫反應過程中，B細胞的Ig組分還可通過同型轉換組合（isotype switching recombination）、體細胞超突變（somatic hypermutation）以及受體編輯和校訂（receptor editing and revision）等進一步多樣化和精確化。但T細胞的TCR基因是否存在體細胞超突變目前尚無定論。目前認為T細胞也存在受體編輯和校訂。

淋巴細胞在骨髓（B細胞）或胸腺（T細胞）發育過程中，為了通過V-（D）-J片段的結合而形成一個完整的可變區結構域，編碼IgH鏈、Igκ鏈、Igλ鏈和TCR（α、δ、β、γ）鏈的7個基因位點均要經歷體細胞水平的基因重排。V-D-J重組（發生于IGH、TCRβ 和TCRδ）首先發生的是1個D片段和1個J片段的連接（重組），形成D-J復合物，然后，1個V基因的5′端與D-J復合物連接，產生1個特異的重組V-D-J復合物（V區基因）；V-J重組（發生于IGL、TCRα和TCRγ）由于沒有D片段，直接由1個V片段和1 個J片段連接重組，產生1個特異的重組V-J復合物（V區基因）。最后，產生的特異性的V-（D）-J基因片段與下游的C片段連接（圖2-2）。重排期間，位于重排基因片段之間的DNA被切除，從而形成1個單鏈連續的抗原受體基因，然后轉錄為mRNA，最終翻譯成肽鏈，相應的不同肽鏈組合形成抗原受體蛋白質，即Ig和TCR，從而產生特異的免疫分子。

抗原受體基因重排的發生高度有序。在B細胞分化發育過程中，IGH基因重排開始于祖B（pro-B）細胞，隨著B細胞的發育IGL重排開始。首先進行κ鏈的重排，如果兩條染色體κ鏈重排均失敗，才啟動λ基因重排。這就決定了一個B細胞只表達兩種類型輕鏈中的一種。在T細胞分化發育過程中，TCRδ和TCRγ首先發生重排，TCRβ和TCRα隨后發生重排。此外，由于TCRδ基因位于V _α和J _α基因片段之間，在重排過程中，TCRα基因重組導致了TCRδ基因被刪除，所以TCRα的成功重組將排除TCRδ基因表達的可能。TCRδ基因的刪除在決定前T細胞定向于TCRγδ或TCRαβ細胞系分化中起重要作用。

綜上所述，每個淋巴細胞抗原受體各條鏈的基因經過功能性重組，都表現為一種獨特的V-（D）-J基因片段組合。不同的V、（D）、J基因片段組合導致不同特異性分子的產生，由于各種基因片段的數目較多，這些基因片段及不同肽鏈的不同組合會產生大量多種不同的組合，從而產生多種類型的Ig和TCR分子。此外，各片段連接之前，在V與D、D與J或V與J之間都有核苷酸的“隨機”丟失或插入，也增加了抗原受體基因多樣性，從而使具有同樣V、（D）、J基因片段的抗原受體基因在連接處有不同氨基酸序列而形成更多不同的Ig和TCR分子。

染色體易位是另一種形式的基因重排。與抗原受體基因重排不同，染色體易位不發生或極少發生在正常細胞，因此屬于病理性的基因重排。

染色體易位所涉及基因的功能蛋白包括幾個類別：絲蘇氨酸蛋白激酶、細胞表面受體和生長因子。然而這些蛋白中最多的蛋白類型是轉錄調節蛋白——轉錄因子。轉錄因子調控基因轉錄的起始，它們識別并與位于基因調節元件的靶序列或其他DNA結合蛋白結合，轉錄因子的調控通常具有組織特異性。

染色體易位導致相應基因功能改變，其機制有兩種。第一是質變，即由于染色體易位使兩個位于不同染色體上的基因A和基因B斷裂并發生部分基因相互交換，形成融合基因AB，表達新的并有致瘤潛能的融合（chimeric）蛋白。這一蛋白在正常組織細胞中不存在，因而具有腫瘤特異性。這樣的融合基因或蛋白的檢測在診斷和微小殘留病變或腫瘤復發監控中具有重要意義，而且也可能是腫瘤個性化治療的重要靶標。造血與淋巴組織腫瘤中許多類型可以見到這種獨特的染色體易位。如MALT淋巴瘤的特異性染色體易位t（11；18）（q32；q32）導致API2和MALT1基因相互交換，形成融合基因API2-MALT1，表達有致瘤潛能的融合蛋白API2-MALT1。

染色體易位導致基因功能改變的第二種機制是量變，即染色體易位未破壞原癌基因B結構上或轉錄本的完整性，但將之移位至正常生理條件下轉錄活性高的基因A，如抗原受體（IG或TCR）基因的轉錄調控域內，導致基因B的異常高表達。如Burkitt淋巴瘤中的染色體易位t（8；14）（q24；q32），將C-MYC基因移至IGH基因的轉錄調控域內，導致C-MYC基因的異常高表達。這一機制僅導致原癌基因表達失控（過表達或正常情況下不表達的組織中出現異常表達），而其蛋白結構不改變，這種染色體易位常是淋巴瘤中染色體易位的特點。

許多淋巴瘤攜帶有一種或數種染色體易位（表2-1）。這些染色體易位導致的基因異常直接或間接地影響了細胞的正常增殖與凋亡的調控，進而導致了腫瘤細胞的轉化。這些染色體易位的發生不僅具有重現性（recurring），而且具有病理形態學類型的特異性。因此，染色體易位可視為相應腫瘤在基因水平上的標志物。研究還發現，即便是同一病理亞型的腫瘤，因其所攜帶的染色體易位不同也可有不同的預后和對治療有不同的反應。如攜帶t（2；5）（p23；q35）的間變性大細胞淋巴瘤預后好于不攜帶者；攜帶t（11；18）（q32；q32）的MALT淋巴瘤，對抗HP治療無效。

總之，染色體易位不僅在淋巴瘤的發病機制中有著重要意義，而且還為淋巴瘤的分子診斷、分型提供了標記物，染色體易位的檢測有助于淋巴瘤治療方案的選擇和預后的判定，此外這些遺傳學異常也有可能成為治療的靶標。

濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）是來源于生發中心B細胞的一種低度惡性、具有惰性臨床進程的腫瘤。t（14；18）（q32；q21）是FL的特征性分子遺傳學改變，大于90%的FL攜帶該染色體易位。這一染色體易位導致位于18號染色體（18q21）上的原癌基因BCL-2與位于14號染色體（14 q32）上的IGH基因易位，導致BCL-2基因的蛋白產物過量表達。

BCL-2是一個25kDa的線粒體內膜蛋白，具有抑制細胞凋亡、延長細胞存活的作用。BCL-2正常表達于次級淋巴濾泡套區和邊緣帶的小B細胞，許多T細胞也表達。正常濾泡中心細胞不表達BCL-2蛋白，而FL的腫瘤細胞因攜帶t（14；18）（q32；q21）導致BCL-2蛋白的異常表達。

極偶然的情況下，t（14；18）也可出現于正常個體的扁桃體或外周血中，表明該染色體易位本身并不導致腫瘤發生，只有再次發生了遺傳學改變如C-MYC基因重排時，才有可能發生腫瘤。

此外，t（14；18）陰性的FL存在涉及3號染色體（3q27）上的BCL-6基因的染色體易位。

套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是一種B細胞淋巴瘤，主要見于老年人。其假定起源細胞為濾泡套區CD5陽性的淋巴細胞。其特征性的分子遺傳學改變是t（11；14）（q13；q32）。95%的MCL中可檢出此種易位。

這一染色體易位導致位于11號染色體（11q13）上的BCL-1（CCND1）基因與位于14號染色體（14q32）上的IGH基因易位，導致CCND1基因的蛋白產物cyclinD1的過量表達。除MCL外，在少數其他淋巴瘤如多發性骨髓瘤、幼稚淋巴細胞白血病中也存在此種易位。

cyclinD1的過度表達可促進細胞增生，在體外可引起細胞轉化并在動物模型中促成B細胞淋巴瘤的生成。這表明t（11；14）（q13；q32）在MCL的發生發展過程中起著重要作用。

MALT淋巴瘤是結外低度惡性B細胞淋巴瘤。其發生部位廣泛，最常見的部位為胃腸道。發生在胃的MALT淋巴瘤與幽門螺桿菌（Hp）感染相關。

MALT淋巴瘤中存在的第一個特異性染色體易位為t（11；18）（q21；q21）。這一染色體易位使11號染色體（11q21）上的API2基因與18號染色體（18q21）上的MALT1基因重組為一個新的融合基因API2-MALT1，進而轉錄翻譯成具有致瘤活性的融合蛋白API2/MALT1。

不同部位的MALT淋巴瘤，該染色體易位的發生率不同。在肺及胃的發生率最高，分別為38%及24%；其次為結膜及眼眶，分別為19%及14%；在涎腺中的發生率僅為1%；而在甲狀腺、皮膚、肝臟及其他少見部位的MALT淋巴瘤及免疫增生性小腸病（immunoproliferative small intestinal diseas，IPSID）中缺乏這一染色體易位。攜帶t（11；18）的胃MALT淋巴瘤對抗Hp治療不敏感。

MALT淋巴瘤中還存在另一個特異性染色體易位——t（1；14）（p22；q32）。這一染色體易位將1號染色體（1p22）上的BCL-10基因置于14號染色體（14q32）上的IGH基因增強子的下游，因而致使BCL-10蛋白過度表達。這一染色體易位的發生率大約為4%，在肺MALT淋巴瘤中為最高（12%）。攜帶t（1；14）的胃MALT淋巴瘤對抗HP治療也不敏感。

MALT淋巴瘤中還存在的第三個特異性染色體易位為t（14；18）（q32；q21）。該染色體易位涉及18號染色體（18q21）上的MALT1基因，而不是BCL2基因。該染色體易位的發生率大約為5%，關于t（14；18）存在的臨床意義目前尚不清楚。

近來，在MALT淋巴瘤中又發現了第四個染色體易位，即t（3；14）（p14.1；q32）。這一染色體易位將3號染色體（3p14.1）上的FOXP1基因易位到了14號染色體（14q32）上的IGH基因下游，導致了FOXP1蛋白的過表達。但該染色體易位并非MALT淋巴瘤所特有，在DLBCL中也有發現。

除以上染色體易位外，MALT淋巴瘤還存在其他遺傳學異常。3號、8號、12號及18號染色體3體常出現在MALT淋巴瘤中。

Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）是多發于兒童和青少年、與EB病毒（Epstein Barr virus，EBV）感染相關的侵襲性淋巴瘤。

從分子遺傳學角度來講，BL是一個同質性疾病。所有病例都存在涉及C-MYC基因重排的分子遺傳學異常。約85%的病例存在t（8；14）（q24；q32）/C-MYC-IGH，該染色體易位導致8號染色體（8q24）上的C-MYC基因與14號染色體（14q32）上的IGH基因發生相互易位；10%的病例存在t（2；8）（p12；q24）/IGκ-C-MYC，該染色體易位導致8號染色體（8q24）上的C-MYC基因與2號染色體（2q24）上的IGκ基因發生相互易位；5%的病例存在t（8；22）（q24；q11）/C-MYC-IGλ，該染色體易位導致8號染色體（8q24）上的C-MYC基因與22號染色體（22q11）上的Igλ基因發生相互易位。以上3種染色體易位均不導致C-MYC基因的編碼區破壞，只是引起其表達失控，致使C-MYC蛋白持續高表達。

在流行性BL中，8號染色體的斷裂點位于MYC基因5′方向約100kb處，IGH基因的斷裂點位于其J區或D區，表明流行性BL發生于發育早期B細胞。在散發性BL中，8號染色體的斷裂點位于C-MYC基因的第一個外顯子或內含子，IGH的斷裂點位于其C區，提示散發性BL來源于發育晚期的B細胞。

正常情況下，在B細胞的增生和分化過程中，C-MYC的表達受到嚴格的調控。C-MYC基因表達失控被認為是細胞增殖、分化和凋亡異常，進而導致腫瘤轉化的中心環節。少數彌漫大B細胞淋巴瘤也攜帶C-MYC基因的易位。

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuses large B cell lymphoma，DLBCL）是淋巴瘤中最常見的類型。不論是從形態學還是分子遺傳學變化來看，它都是一種高度異質性的腫瘤。

在約30%的DLBCL中存在涉及3號染色體q27（3q27）區域的BCL-6基因的染色體易位。其中t（3；14）（q27；q32）最為常見，導致3號染色體（3q27）上的BCL-6基因與14號染色體（14 q32）上的IGH基因發生相互易位。此外，與BCL-6基因發生易位的伙伴基因還有IGκ基因、IGλ基因等，涉及十多條染色體，如2、22、11、12、8等。3號染色體的斷裂點聚集區在BCL-6 5′端第1個外顯子前后。上述染色體易位把位于3號染色體（3q27）上的BCL-6基因的編碼區完整地移到了編碼Ig重鏈和輕鏈基因活躍的啟動子之后，通過啟動子替換，導致BCL-6基因的過表達。

BCL-6基因是一個原癌基因，其編碼產物是一個由706個氨基酸組成的磷蛋白，功能上是一個轉錄抑制因子，屬于鋅指蛋白家族。BCL-6蛋白在生發中心的發育和T細胞依賴的免疫反應中發揮重要作用。高水平表達見于生發中心B細胞而不表達于B細胞前體或成熟的漿細胞。

約25%的DLBCL中存在t（14；18）（q32；q21）/IGH-BCL-2。該染色體易位導致14號染色體（14q32）上的IGH基因與18號染色體（18q21）上的BCL-2基因發生相互易位。有研究表明，t（14；18）多與生發中心B細胞樣（germinal center B-cell-like， GCB）DLBCL相關，且多表現為預后較好。DLBCL中，攜帶t（14；18）的病例，部分是原發的DLBCL，部分則可能是由攜帶有t（14；18）的FL轉化而來的DLBCL。

約10%的DLBCL中存在t（8；14）（q24；q32）/G-MYC/IGH，該染色體易位導致8號染色體（8q24）上的C-MYC基因與14號染色體（14q32）上的IGH基因發生相互易位，從而導致C-MYC蛋白持續過表達。

約3%的DLBCL中存在t（3；14）（p14；q32）/FOXP1-IGH，這一染色體易位使3號染色體（3p14）上的FOXP1基因易位到了14號染色體（14q32）上的IGH基因下游，導致了FOXP1蛋白的過表達。

在DLBCL中，除存在上述諸多染色體易位之外，還存在多種基因擴增。其中最為常見的是BCL-2基因的擴增。此外，還有部分DLBCL中存在BCL-6、C-MYC及MALT1基因的擴增。

間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是T/裸細胞非霍奇金淋巴瘤的一個獨特亞型。ALCL可分為原發系統性和原發皮膚性。

目前發現的與ALCL有關的遺傳學異常有t（2；5）（p23；q35）/ALK-NPM及其變異型t（1；2）（q25；p23）/TPM3-ALK、t（X；2）（q11-12；p23）/MSN-ALK等染色體易位。其中，以t（2；5）（p23；q35）最為常見，約占40%～60%。該染色體易位導致2號染色體（2p23）上的ALK基因與5號染色體（5）上的NPM基因融合。以上染色體易位以累及2號染色體上的ALK（anaplastic lymphoma kinase）基因為共同特點，即將ALK基因與另外一個伙伴基因相互易位而導致ALK基因的重排。

ALK基因編碼一個酪氨酸激酶受體，在正常情況下此受體在淋巴樣細胞中是靜止的，當發生易位時，ALK基因即被激活而可能參與腫瘤轉化。目前，在ALCL中陸續鑒定的與ALK基因易位的伙伴基因有10個，這些染色體易位均可導致ALK基因與相應伙伴基因的融合而形成融合基因及其相應的轉錄本（transcript），并有不同分子量的X-ALK（X代表不同的伙伴基因）融合蛋白表達。X-ALK融合蛋白則可通過免疫組化方法檢測。

正常情況下，ALK蛋白僅在胚胎發育組織及中樞神經系統中表達。出生后，如果在中樞神經系統以外的其他組織中檢測到ALK蛋白，表明ALK有反常表達，ALK蛋白可能以某種融合蛋白的形式存在。高度特異性單克隆抗體ALK-1的產生，使融合蛋白X-ALK的檢測變得方便、準確而快捷。t（2；5）（p23；q35）及其變異型均可通過ALK-1抗體而識別，依據分子遺傳學異常的不同，陽性信號可為核漿型、漿膜或細顆粒狀漿型。但攜帶t（2；5）（p23；q35）的ALCL與攜帶其他變異型染色體易位的ALCL之間，并無臨床特征及形態學的不同。

53%～89%的ALCL攜帶有t（2；5）（p23；q35）及其變異型而表達ALK蛋白，且預后較好。然而，在ALCL中，除ALK陽性ALCL外，有很大一部分ALCL不表達ALK，關于ALK陰性ALCL的遺傳學改變目前尚不清楚。

外周T細胞淋巴瘤-非特異型（peripheral T cell lymphoma-unspecified，PTCL-U）是來源于胸腺后不同階段T細胞的一類惡性淋巴細胞腫瘤，其病理形態學、生物學行為及臨床表現有著明顯異質性。

最近Streubel等發現，17%的PTCL-U攜帶有一種新的染色體易位——t（5；9）（q33；q22）/ITK-SYK。該染色體易位導致5號染色體（5q33）上的ITK基因5′端和9號染色體（9q22）上的SYK基因3端融合，形成一種新的融合基因ITK-SYK。

ITK與SYK基因的產物均為非受體酪氨酸激酶，在淋巴細胞的抗原受體信號傳導中起一定的作用。因此，從理論上ITK-SYK融合蛋白似乎具有連續激活酪氨酸激酶的作用。

在淋巴瘤中，DNA重排（包括生理性與病理性重排）往往發生于克隆性增殖之前。正常細胞中不存在而在腫瘤細胞中存在的獨特的基因重排，包括生理性和病理性者，均可以作為一個獨特的腫瘤標記物，用來區分淋巴瘤腫瘤細胞和正常細胞。

通常用于淋巴瘤分子病理學診斷中的常用靶標有抗原受體（IG和TCR）基因重排及染色體異常，如染色體易位。

導致淋巴細胞抗原受體（Ig/TCR）多樣性的基因重排不僅僅是一個令人感興趣的學術問題，同時我們也可以通過IG/TCR基因重排的克隆性分析，將這一理論應用到淋巴組織增生性疾病的診斷和研究中。

在抗原受體基因的生理性重排過程中，由于不同的V、（D）、J基因片段組合及核苷酸的“隨機”丟失或插入，導致每一個不同的B或T細胞有不同（長度和堿基序列）的IG或TCR基因。在正常淋巴組織及淋巴組織反應性增生病變中，淋巴細胞為多克隆性的，因而B或T細胞的IG或TCR基因也表現為多克隆性重排。當某一個B細胞發生惡性轉化后，其特殊的IG或TCR基因編碼序列可遺傳給所有子代腫瘤細胞，腫瘤性增生的細胞即表現為（單）克隆性的IG或TCR基因重排。因而，IG或TCR基因重排的（單）克隆性就可作為區別淋巴瘤和正常或反應性淋巴組織增生性病變的一個分子標記物。

Southern印跡法（以這一技術的發明者Edwin Southern命名）分析被視為檢測淋巴細胞抗原受體基因克隆性重排的金標準。其原理和基本步驟為：首先提取細胞DNA，然后以一種或多種限制性內切酶消化（最終片段最好為2～15kb，且避免多態限制性位點作為酶切位點）。對于一個特定的基因，利用一定的限制性內切酶可將其切割為特征性的、一定大小或一定大小范圍內的片段，這些片段被定義為胚系片段。胚系片段的大小是特定的，而發生過基因重組的細胞DNA的酶切位點有所改變，因此會產生有別于胚系的酶切片段。轉膜后，與已標記的DNA探針（最好是J基因片段的下游區）雜交，以檢測酶切后相應的DNA片段。當有一定數量的克隆性增生的淋巴細胞存在時（＞1%～5%），與胚系的DNA片段所產生的條帶相比，在含有克隆性基因重排的樣本中，就會產生一條額外的特異性的條帶，而正常或多克隆性的淋巴細胞增生則因重排片段大小各異而呈彌散狀，僅可能出現一條胚系DNA片段大小的條帶。

這一技術有兩個關鍵點：第一是通過高分辨凝膠電泳分離限制性內切酶消化的DNA片段；第二是利用特異性DNA探針與DNA片段進行雜交，然后利用放射自顯影來定位探針，以確定限制性片段的大小。

盡管Southern印跡法分析具有高度的可靠性，被認為是識別克隆性基因重排的“金標準”，但因其需要新鮮組織、費時（通常需要1周～2周）、成本昂貴并使用放射性物質等缺點，逐漸被聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術所取代。

PCR是一種體外試管內合成DNA的反應，這一反應混合物包括樣本DNA（模板）、一對寡核苷酸引物、四種脫氧核苷酸、熱穩定DNA合成酶及含有Mg ²⁺的緩沖液。在熱循環儀上，反應經過變性、退火、延伸三個步驟的多次循環，在幾個小時內將單一拷貝的DNA增加幾百萬倍，使得合成的產物可經過凝膠電泳而檢測和分析。通常的PCR產物分析可使用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠。但瓊脂糖凝膠分辨力較差，因此不能用于IG/TCR基因重排克隆性分析時PCR產物的分析。

在胚系構象中，IG/TCR基因中的V、（D）、J片段相隔甚遠，不能通過PCR進行擴增。IG/TCR基因通過重排，將分布在不同區域的V、（D）、J片段結合在一起，利用PCR方法，通過采用針對重排片段V-（D）-J結合區的特異性或共有引物，V-（D）-J結合區得以擴增。因此，PCR檢測IG/TCR基因重排克隆性的基礎是，胚系構象中相隔甚遠的V、（D）、J片段經過重排而結合在一起。

正常淋巴組織或反應性淋巴組織增生性病變中，淋巴細胞為多克隆性，因而V（D）J結合區的PCR產物多樣，是大小不同、序列各異的片段，凝膠電泳顯示產物呈涂抹片狀（smear）或細密的階梯狀（ladder）。在淋巴瘤組織中，增生的細胞是腫瘤性即單克隆性的，因而V-（D）-J結合區的PCR產物單一，大小一致、序列相同，凝膠電泳顯示產物呈一個或兩個（雙等位基因重排）單一性條帶（band）。

可用于PCR檢測IG和TCR基因重排克隆性的樣本多樣。肝素或EDTA抗凝的外周血（5ml）及骨髓抽吸物、骨髓活檢標本、新鮮組織、石蠟包埋組織中提取的DNA均可用于PCR檢測IG和TCR基因重排的克隆性，甚至經過組化或HE染色的切片刮取組織中提取的DNA也能利用。

利用PCR技術檢測IG/TCR基因克隆性的方法簡便、快速、成本較低、敏感性較高（1%～5%），因而優于Southern印跡法。其業已取代Southern印跡法的一個重要因素是這一方法所需DNA量少，對DNA質量要求不高，常規甲醛溶液（福爾馬林）固定、石蠟包埋組織中提取的DNA即可滿足這一技術要求。

然而，PCR方法也有不足之處。首先，由于PCR的高敏感性及具體方法學上的不同或結果解釋標準的不同而有可能導致假陽性的出現，也有可能因標本污染而出現假陽性結果；其次，如果DNA質量過差（如斷為小于100bp的片段）或體細胞超突變、特定區域的刪除、染色體易位（translocation）或倒位（inversion）引起缺失或靶序列方向錯誤而導致的引物結合失敗，均可導致假陰性的出現。如DLBCL、FL、MALT可由于存在體細胞超突變引起引物結合失敗出現假陰性（多克隆重排）的結果。此外，當被分析組織中淋巴樣細胞過少，可能會出現由僅一個淋巴細胞而產生PCR產物，出現相似與克隆性重排的結果（寡克?。?，此時應結合形態學來判斷，以避免假陽性結果。

在以往的實際工作中，IGH、TCRβ和TCRγ基因常被用作檢測IG或TCR基因重排克隆性分析的目標基因。利用PCR方法檢測IGH基因重排時，一般在V區相對保守的骨架區FR（包括FR1、FR2、FR3）及J區設計引物，擴增FR1、FR2、FR3到J區的（FR/J）片段，因FR3/J的擴增片段較小，可應用于已降解為較小片段的DNA，故較為常用。在大約70%～80%的B細胞腫瘤中，通過FR3/J的擴增，可檢測出其單克隆性。用PCR方法檢測TCR基因重排主要以TCRβ和TCRγ基因為靶目標。因為TCRα基因結構復雜而TCRδ基因在成熟T細胞中常常被刪除，因而不或很少作為檢測TCR基因重排的靶目標。在大約70%的T細胞腫瘤中，通過PCR擴增TCRβ和TCRγ基因，可檢測出其單克隆性。TCRδ基因的擴增可應用到前驅T細胞性腫瘤的研究中。

但通過多重引物的應用，可提高T和B細胞腫瘤的單克隆性檢出率。van和Langerak 等2003年發表了一個歐洲合作性研究報告：標準化的檢測克隆性IG和TCR基因重排的BIOMED-2 PCR方案。利用這一方案，在理論上可檢測出100%的T和B細胞腫瘤的單克隆性。以下將重點介紹這一方案。

“標準化的檢測克隆性IG和TCR基因重排的方案”——BIOMED-2 PCR方案（以下簡稱BIOMED-2方案）是歐洲7個國家（荷蘭、比利時、西班牙、葡萄牙、英國、德國和法國）的47個研究所約90個研究人員合作進行的一項大規模的研究。這些研究人員包括了在分子生物學、免疫學、血液病學及病理學領域中具有豐富實驗室研究經驗的專家。所用組織標本（所有診斷困難及10%的隨機抽取病例）經過由7個國家的病理學家組成的國際病理學專家組進行復習核實。

BIOMED-2方案的主要目的是研發標準化的多重PCR試管和標準化的PCR方案，為早期可疑（惡性）淋巴組織增生性疾病提供可靠而簡便的克隆性檢測方法。為達到這一目的，BIOMED-2方案需要解決的問題有兩個。其一，防止假陰性結果：通常由于不恰當的引物復性（常因體細胞超突變所致）所導致；其二，防止假陽性結果：主要由于不恰當的（單克隆和多克隆性重排）結果解讀造成。BIOMED-2方案通過設計針對每個Ig和TCR分子位點的、覆蓋所有IG和TCR基因重排方式的多種引物來解決第一個問題；通過使用雙鏈PCR產物的異源雙鏈分析和熒光標記單鏈PCR產物的基因掃描兩種不同的技術，辨別單克隆和多克隆性IG和TCR基因重排，避免假陽性結果，以解決第2個問題。

目前，在歐洲，BIOMED-2方案已被成功地應用于可疑（惡性）淋巴組織增生性疾病的克隆性分析中。

BIOMED-2方案將107種不同的引物組合在18個試管中，其中一些引物用于1個以上的試管中（表2-2）。這些引物組合在一起，在檢測克隆性重排上具有互補性，但引物本身不發生交叉復性（退火）。所用引物有家族性引物（識別一個特殊家族的大多數或全部基因片段）和通用引物（識別存在于許多或全部相關基因片段的保守序列）兩種類型。

BIOMED-2方案的18個多重引物試管中，8個用于IG基因重排的克隆性分析，其中包括5個用于檢測IGH基因重排（包括完全性V _H-J _H和不完全D _H-J _H重排）的試管（IGH tube A、IGH tube B、IGH tube C、IGH tube D、IGH tube E）；2個用于檢測IGκ基因重排（包括V _κ-J _κ和Kde）的試管（IGK tube A、IGK tube B）；1個用于檢測IGλ基因重排的試管（IGL tube）。

此外，BIOMED-2方案的多重引物試管中，還包括4個檢測兩個染色體易位的試管。其中1個用于檢測t（11；14）（BCL1-IGH）的試管［t（11；14）tube］和3個用于檢測t（14；18）（BCL2-IGH）的試管［t（14；18）tube A、t（14；18）tube B、t（14；18）tube C］。檢測t（11；14）和t（14；18）的試管，除可檢測兩個染色體易位的存在與否外，也可作為B細胞克隆性的檢測靶標。

BIOMED-2方案的多重引物試管中，用于TCR基因克隆性重排分析者有6個，其中包括3個用于檢測TCRβ基因重排（包括完全的V _β-J _β和不完全的D _β-J _β重排）的試管（TCRB tube A、TCRB tube B、TCRB tube C）；2個用于檢測TCRγ基因重排者（TCRG tube A、TCRG tube B）；1個檢測TCRδ基因重排者（TCRD tube）。

此外，BIOMED-2方案中，為評估石蠟包埋組織所提取DNA的質量（完整性和可擴增性），特設計包括5對對照基因引物組成的1個多重引物試管。利用這一試管可擴增出包含100bp、200bp、300bp、400bp和600bp的產物。通常，如果獲得300bp以上的PCR產物，可基本滿足克隆性重排的分析。如果擴增產物片段過小，則說明DNA質量較差，不能保證克隆性重排的檢出。

A. 反應液配制：以一個反應25μl為例

若使用InVivoScribe Technologies公司的IG和TCR基因重排克隆性分析的試劑盒，則反應液配制如下：

B. PCR擴增程序

C. PCR產物的分析方法：用于PCR產物的分析方法有多種。BIOMED-2方案主要采用兩種分析法——異源雙鏈分析（heteroduplex analysis）和基因掃描（gene scanning）。

a. PCR產物的異源雙鏈分析（heteroduplex analysis）：異源雙鏈分析是將PCR產物（以未標記引物擴增）在高溫下變性（94℃，5分鐘），然后在低溫下（4℃，1小時）快速隨機復性再次形成雙鏈結構。經過這樣的處理，在多克隆性淋巴組織增生病變中，產生許多擁有不同遷移速度的異源雙鏈；但是在單克隆性病變中，則產生擁有同一遷移速度的同源雙鏈。在6%的聚丙烯凝膠電泳中，同源雙鏈形成預知大小范圍的單一條帶，而異源雙鏈則在較高位置呈現為彌散片狀。

異源雙鏈分析是一個快速、簡單且價格便宜的技術，其檢測敏感性可檢測出大約為5%的克隆性淋巴細胞。異源雙鏈的形成也消耗一部分單克隆性PCR產物，所以檢測限度受單克隆性增生的淋巴細胞所占比例的影響。

由于異源雙鏈分析以PCR產物的長度或大小和連接區域多樣性為基礎，對于分析連接區域多樣性有限的位點尤為重要。

b. PCR產物的基因掃描（gene scanning）：不同于異源雙鏈分析法，基因掃描法基于單鏈PCR產物、僅利用結合區域長度的不同進行分析檢測，而且用于基因掃描檢測的PCR產物其引物需熒光標記，以便自動測序儀檢測。

變性后熒光標記的單鏈PCR產物，通過變性聚丙烯酰胺測序膠或毛細管測序聚合物分離，然后利用激光自動掃描進行檢測。在多克隆性淋巴組織增生的病例中，由于含有許多長度不同的PCR產物，因此會產生多個峰組成的高斯正態分布，但是在一個單克隆性增生病例中，由于僅包括一種長度的PCR產物，因此會產生一個單峰。

一般來講，基因掃描比異源雙鏈分析更加敏感，其敏感性可檢測出0.5%～1%的克隆性淋巴細胞?；驋呙铏z測PCR產物快速、簡便，精確測定的PCR產物大小，可用于隨訪期間監測克隆性增生。但其缺點是需要昂貴的設備。

對于結合區異質性較大的IGH（V _H-J _H）和TCRB的PCR產物，基因掃描和雜交雙鏈分析的效果是相同的，而對于結合區異質性有限的IGH（D _H-J _H）、IGK和TCRG的PCR產物分析，應優先選擇異源雙鏈分析法。此外，盡管TCRD的PCR產物的多色基因掃描對TCRD基因重排的類型識別非常有益，但是異源雙鏈分析法在IGL和TCRD的PCR產物的分析中具有極大的優勢。

由于各種BIOMED-2方案多重引物管的互補性，使用引物組合進行克隆性重排的檢出率空前的高。聯合應用IGH （VH-JH和DH-JH）和IGK試管能夠檢測幾乎所有的克隆性B細胞增生（包括攜帶高水平體突變的B細胞淋巴瘤）。聯合使用TCRB和TCRD試管可檢測幾乎所有的克隆性T細胞群。TCRD試管在可疑TCRγδ陽性T細胞增生病例中具有重要價值。

BIOMED-2 PCR以盡可能少的引物管檢測盡可能多的基因重排，大大地促進了克隆分析在臨床中的應用。不僅如此，如果按照一定的順序選擇引物，可以大大節約時間和試劑，提高其在臨床檢測中的應用價值。英國劍橋大學Addenbrooks醫院的Liu等使用BIOMED-2 PCR方法對125例新鮮/冰凍組織和316例石蠟包埋組織進行檢測，通過各種引物管對于克隆性增生檢出率的總結，對引物的選擇進行了優化。這一優化方案可作為臨床應用BIOMED-2方案進行IG和TCR基因克隆性重排檢測的參考。

一般而言，PCR產物分析呈現彌散片狀（異源雙鏈分析）或正態分布（基因掃描）代表多克隆性，意味著相應病變為反應性淋巴組織增生；而PCR產物分析呈單一條帶（異源雙鏈分析）或單峰（基因掃描）代表克隆性，意味著相應病變為淋巴瘤。但克隆性分析的結果需結合臨床資料、形態學改變、免疫組化而進行解釋。同時要注意以下事項：①首先，IG和TCR基因克隆性重排分析一定要設定多克隆性對照、（單）克隆性對照、無DNA模板空白（H ₂O）對照。如果各個對照的結果不正確，則無法進行樣本結果的報告。②當克隆性增生的淋巴細胞數在正常淋巴細胞中所占比例小于1%時，BIOMED-2方案檢測結果不可靠。

在淋巴瘤的診斷中，盡管通過廣泛的免疫表型檢測，仍有大約5%～10%的病例診斷困難。此時，IG和TCR基因重排克隆性分析將有助于診斷的確定。通常，需要進行IG 和TCR基因重排克隆性分析的情況如下：①通過形態學和免疫組化檢測未能診斷的可疑性（惡性）B細胞增生性病變；②所有可疑性（惡性）T細胞增生性病變；③免疫缺陷患者，包括器官移植后患者的淋巴組織增生性病變；④判定一個患者身上發生的兩個淋巴瘤之間的克隆關系，或區別淋巴瘤的復發還是第二次發生的淋巴瘤；⑤淋巴瘤的分類，是B細胞還是T或NK細胞性腫瘤。

克隆性分析的檢測敏感性隨所用技術的不同通常在1%～10%之間，如果腫瘤細胞過少（＜5%～10%）可能會檢測不出。

盡管，IG和TCR基因克隆性重排與淋巴瘤顯著相關，但克隆性分析的檢測結果為（單）克隆性并不總是意味著惡性腫瘤的出現。當進行分子遺傳學分析時，一定要清楚患者的免疫狀況。當患者存在先天性免疫缺陷、自身免疫性疾病、器官移植后免疫抑制和AIDS病時，即使沒有惡性淋巴瘤的存在，也可能檢測到克隆性增生的淋巴細胞。很顯然，免疫系統功能失調可導致淋巴細胞在抗原刺激或分裂原（如EBV）誘導下，不受正常免疫系統的約束反復分裂。這些分裂的細胞群體存在著繼發性的遺傳物質損傷（可能為染色體易位）的高危性，從而導致細胞轉化形成淋巴瘤。這一現象的早期表現是寡克隆性淋巴細胞增生，并可自行消退。但晚期寡克隆中的一個克隆呈優勢生長，可形成淋巴瘤。

臨床上，常見的一些呈（單）克隆性增生的良性病變有CD8（有時CD4）陽性T細胞增多癥、良性單克隆性γ病、免疫缺陷患者的EBV感染性淋巴組織增生性病變的初始階段（通常是寡克隆性）及良性皮膚T細胞增生（如淋巴瘤樣丘疹病等）。因此，分子克隆性檢測結果應該結合臨床、形態學、免疫組化資料來進行綜合分析。

盡管絕大多數IG基因重排發生于B淋巴細胞，TCR基因重排發生于T淋巴細胞，近十年的研究已經清楚，IG和TCR基因重排并不一定代表相應B細胞和T細胞起源。有時可見二者的交叉。如在不成熟的B細胞性腫瘤中，交叉性的TCR基因重排時有發生，特別是前B細胞性急性淋巴細胞性白血?。˙前-ALL），90%以上有交叉性的TCR基因重排，而且急性髓細胞性白血?。ˋML）和成熟B細胞腫瘤也可出現交叉性的TCR基因重排。交叉性IG基因重排（主要涉及IGH位點）在T細胞性腫瘤和AML中也有發生，但發生率很低。

此外，幾乎所有的（＞98%）的TCRαβ陽性T細胞腫瘤均有TCRG基因的重排（通常是兩個等位基因），而TCRγδ陽性T細胞腫瘤有TCRB基因的重排，因此檢測到TCRB和TCRG基因的重排并不意味著一定是TCRαβ陽性或TCRγδ陽性T細胞起源。

由于PCR敏感性高，如果被檢測組織中淋巴細胞數量較少，其中個別B或T細胞的IG或TCR基因被擴增，可形成假克隆性結果。特別是在小的細針吸取組織或高腫瘤負荷的B細胞非霍奇金淋巴瘤標本中所存在的少量反應性T細胞，可形成寡克隆性的PCR產物（通常產物量較少），尤其是TCRG基因作為PCR靶點時更為顯著。對于這種情況，要對同一標本同時擴增2～3份，然后將所獲得的PCR產物混合后進行分析，這樣將有助于明了表面上像克隆性的PCR產物是否實際上來自不同的淋巴細胞。

此外，由于抗原選擇作用，一些亞克隆顯著占優勢會導致反應性淋巴組織增生的Ig 或TCR成分的多樣性減少，尤其在攜帶活性EBV或CMV感染的病人淋巴結或血液標本中，可顯示TCR基因的寡克隆性，例如在器官移植后患者或毛細胞白血病患者中。

最后，需要強調的是，可靠的分子克隆性診斷，不僅僅取決于PCR引物和方案的質量，PCR產物的基因掃描和異源雙鏈分析結果的經驗同樣重要。足夠的知識和經驗可在一定程度上避免問題的出現，但同時克隆性分析的結果一定要結合臨床、形態學、免疫組化資料進行綜合分析，然后作出最后的診斷和分類。

染色體是細胞遺傳學的基礎。非霍奇金淋巴瘤存在許多遺傳學方面的改變，可表現為染色體數量異常和（或）結構改變。不同類型的惡性淋巴瘤有其特有的細胞遺傳學和分子遺傳學改變，涉及不同類型的染色體異常，其中包括染色體的易位、缺失、獲得、三倍體以及染色體片段的擴增等。這些染色體的異?？梢酝ㄟ^分子生物學或細胞遺傳學的方法進行檢測。目前用于染色體異常的檢測方法主要有以下4種。

20世紀60年代建立了一系列染色體顯帶技術，包括C帶、G帶、Q帶、R帶和T帶等，其中應用最廣的是G顯帶技術。后來出現的高分辨G帶技術能進一步提高分辨率，可以將染色體的細微變化準確地定位在一個特定染色體的某一個區帶上。早期淋巴瘤的細胞遺傳學研究均采用染色體核型分析來完成，并通過該方法發現了一系列淋巴瘤特異性的染色體異常。染色體核型分析是細胞遺傳學不可缺少的基本手段，但該方法結果的可靠性取決于收獲的中期有絲分裂象數量、染色體分散和顯帶質量，并且費時費錢。這一技術應用受限的最主要原因是不能用于石蠟包埋組織。

比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）技術是由Kallioniemi在1992年首先提出。該技術通過單一的一次性雜交對某一腫瘤全基因組的染色體拷貝數量的變化進行檢查。其基本原理為利用不同熒光素分別標記腫瘤組織的基因組DNA（通常采用綠色熒光素標記）和正常細胞或組織的基因組DNA（通常采用紅色熒光素標記）作為探針，與正常人的分裂中期染色體進行共雜交，通過比較兩種探針雜交后染色體上顯示的腫瘤組織與正常對照組織的熒光強度，來判斷腫瘤組織的DNA是否存在缺失、獲得或擴增。該技術已被廣泛應用于惡性腫瘤，包括淋巴瘤的研究。通過該技術可用于染色體異常的檢測，尋找與淋巴瘤發生、發展及預后判定有關的遺傳學異常。

本技術的優點是單一的一次性雜交即可對腫瘤全基因組的染色體拷貝數量的變化進行檢查，所需DNA量較少，且研究材料不僅可以是外周血、培養細胞和新鮮組織，也可是石蠟包埋組織。其缺點為分辨率低，僅可檢測到較大范圍的DNA缺失與獲得（3～5Mb），小于2Mb的DNA獲得和缺失不能被發現，且檢測不出平衡染色體易位，不能將DNA拷貝數變化與基因或基因標記物直接聯系起來.

近來發展起來的高分辨微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，a-CGH）技術，將DNA克隆或cDNA作成微陣列，代替中期染色體作為雜交靶，不僅使分辨率提高，結合生物信息學分析，甚至可以確定腫瘤相關基因，并提供精確的定位。盡管a-CGH問世不久，但已廣泛用于各種腫瘤的研究。但通過a-CGH發現的基因異常，通常需要間期FISH、實時定量PCR和免疫組化等來進一步證實。

利用PCR及RT-PCR技術可檢測染色體易位的存在。其基本原理是染色體易位將兩個特定基因結合在一起，通過在兩個基因斷裂點附近或以融合轉錄本為目標設計引物，以合成融合基因或融合基因轉錄本的方式來判定染色體易位的存在與否。如果有染色體易位存在，染色體易位將兩個遠隔在兩條染色體上的基因結合到了一起，則有PCR產物出現；如果沒有染色體易位，兩個基因分別在不同的染色體上，則不會出現PCR產物。

利用PCR檢測染色體易位受斷裂點分布的影響。如果染色體易位的斷裂點分布比較集中，則通過PCR檢測染色體易位是一種相對簡便易行的方法，但有時染色體易位的斷裂點分布較散，有的易位涉及多個染色體，這樣若要采用PCR檢測就需要設計很多對引物來檢測，因此這時PCR方法顯然不是最好的。目前PCR檢測染色體易位的技術正在被熒光原位雜交技術所取代。

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術是近年發展起來的一種分子遺傳學分析技術。FISH有中期FISH（metaphase FISH）和間期FISH（interphase FISH）兩種。中期FISH因需要新鮮組織和細胞，并需要制備中期染色體，故在應用上受到很大限制。而間期FISH技術不僅適用于新鮮組織，也可應用于經甲醛溶液固定的組織，并可以將組織細胞學形態和遺傳學改變相互聯系，因而在日常分子病理學診斷工作中，是一個非常有用的手段。

許多淋巴瘤中的染色體易位斷裂點分布很廣或樣本DNA/RNA質量較差，在很多情況下無法利用PCR方法進行檢測。而間期FISH檢測不受斷裂點變化的影響，對樣本DNA/ RNA的質量要求不高，因此已被廣泛應用于淋巴瘤染色體異常的檢測。

基于DNA雙鏈互補的特性，將熒光標記的DNA片段（探針）特異性雜交于靶基因，然后通過熒光顯微鏡觀察結合到靶目標上的探針，從而判定相應染色體數目和結構的狀況。間期FISH則是利用上述原理專門檢測處于細胞分裂間期的細胞染色體數目和結構異常的技術。

目前FISH技術在淋巴瘤方面的臨床應用主要有以下幾個方面：①有助于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷；②判定淋巴瘤的預后和指導其治療；③監測淋巴瘤的復發和對治療的反應。

例如，檢測到t（11；18）/API2-MALT1和t（1；14）/IGH-BCL10的意義：①明確MALT淋巴瘤的診斷。以上兩個染色體易位是MALT淋巴瘤的特異性染色體易位，在MALT淋巴瘤相關良性病變及其他類型淋巴瘤中尚未發現；②判定胃MALT淋巴瘤的預后并對其治療進行指導。t（11；18）/API2-MALT1或t（1；14）/IGH-BCL10陽性的病例，通常處于晚期階段，預后較差，且對于HP根除治療不反應，常需要放化療；③監測MALT淋巴瘤的復發。

甲醛溶液固定、石蠟包埋組織切片（涂有APES的膠片），該技術在胃活檢組織、針吸組織等較小組織標本中也可應用。

常用于檢測染色體異常的探針有3種。

雙色分離重排探針均含有以綠色和橙色熒光素標記的兩個探針，其分別與所檢測靶基因的兩端（telomeric 和centromeric）雜交。在相應雙色濾光片下觀察，正常間期細胞核中存在橙色熒光和綠色熒光融合而成的兩個黃色融合信號。當相應基因出現斷裂時（如與另一染色體上的基因發生易位），間期細胞核中出現一個黃色的信號、一個單獨的橙色和一個單獨的綠色信號。當所檢測靶基因出現拷貝數增多時，細胞核內出現多于2個的黃色融合信號。雙色分離重排探針既可檢測基因的數量也可檢測基因結構的改變。但此探針用于檢測涉及某一基因的染色體易位時，無法確定與其發生相互易位的伙伴基因。

雙色雙融合易位探針以綠色熒光標記一個基因，以橙色熒光標記另一個基因。正常情況下，細胞核中顯示兩個單獨的橙色信號和兩個單獨的綠色信號；當存在染色體易位時，細胞核中出現陽性信號，典型類型為一個黃色的融合信號、一個單獨的橙色和一個單獨的綠色信號。若某個基因有擴增，則細胞核內出現多于2個的橙色或綠色信號。

雙色雙融合易位探針同樣既可檢測基因數量也可檢測基因結構的改變。此探針用于檢測染色體易位，并可確定發生相互易位的伙伴基因。

染色體計數探針以橙色或綠色熒光標記整個著絲粒，故又稱著絲粒特異性探針。正常的情況下，在細胞核中顯示兩個橙色或兩個綠色信號，當存在染色體數量異常時，細胞核中則顯示多于或少于兩個的橙色或綠色信號。

染色體計數探針用于檢測染色體單體、三體等數目異常的變化。

FISH實驗中，要設定相應基因異常的陰性和陽性對照。其步驟簡述如下：

（1）4～5μm厚的石蠟切片常規脫蠟、水化。

（2）高壓鍋內沸水煮3分鐘。

（3）0.1%的胃蛋白酶37℃消化25分鐘。

（4）梯度酒精脫水、空氣干燥。

（5）加FISH探針。

（6）80℃水浴箱中孵育25分鐘，以使DNA及探針變性。

（7）45℃避光雜交2～3天。

（8）雜交結束后，以梯度SSC液清洗。

（9）用含有DAPI的抗熒光衰退的封片劑封片。

（10）熒光顯微鏡下觀察結果，并采集圖像。

陽性和陰性的診斷依賴于所使用的探針。在分析解釋臨床樣本之前，要先觀察對照。如果對照的結果不正確，那么檢測無效，臨床樣本結果不能解釋。

兩個清晰的綠色和橙色融合（黃色）信號。

一個清晰的橙綠融合信號（黃色），一個分離的綠信號和一個分離的橙信號。

提示染色體非整倍性或者基因擴增或缺失。需要進一步的研究。

獨立而清晰的兩個綠色信號和兩個橙色信號。

兩個清晰的橙綠融合信號（黃色），一個獨立的綠色信號和一個獨立的橙色信號。

兩個分開的同色信號（綠色或橙色）。

非整倍數量：一個、三個或者多個分離的綠色或橙色信號。

（1）間期FISH無法確定基因在染色體中重排的斷裂點。

（2）信號會受組織切片質量（如組織固定不好或者切片過厚）的影響。

最后，像在IG和TCR基因重排分析中強調的一樣，利用間期FISH進行分子遺傳學異常的檢測，需要以分子生物學、遺傳學知識和病理形態學作為基礎。結果的解釋一定要結合臨床、形態學、免疫組化資料進行綜合分析，然后對淋巴瘤作出最后的診斷和分類。

分子遺傳學分析為病理醫生和臨床醫生提供了淋巴瘤診斷和分類強有力的手段。對于一個特定的可疑惡性的病理診斷來講，分子遺傳學異常的檢出可以提供有力的惡性證據。

特異性的遺傳學異常的檢測，有助于淋巴瘤的診斷和分型，從而有助于臨床醫生選擇正確的治療方式、預測臨床過程和其對治療的反應。具有較好預后特征的患者受益于標準化的治療；而那些具有較差臨床或分子遺傳學特征的患者，則可能需要強化治療或探索性治療。一種腫瘤中，染色體異常的消失是治療后腫瘤完全緩解的重要標志，染色體異常的再次出現預示著腫瘤的復發。

分子遺傳學異常的研究，對于腫瘤分子生物學研究有著重要影響。染色體易位的分子分析使得許多新基因得以鑒定，也使對調節正常細胞生長、分化和惡性轉化的過程有了新的認識。越來越多的高通量檢測技術和基因組范圍的數據庫可以應用到臨床實驗室的工作中，已完成的人類基因組測序、基因表達芯片和對細胞信號傳導通路的深入理解正在改變著我們對淋巴瘤細胞的認識方式。

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