第二部分 禽 病

高致病性禽流感診斷技術(shù) （GB/T 18936—2003）

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高致病性禽流感（HPAI）病毒分離與鑒定技術(shù)、血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA）的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的高致病性禽流感病毒分離與鑒定技術(shù)適用于各種禽類高致病性禽流感的病原分離和鑒定；AGID和間接ELISA適用于A型禽流感病毒的型特異性檢驗(yàn)；HA-HI試驗(yàn)適用于禽流感病毒的血凝素亞型鑒定。

2 病毒分離和鑒定技術(shù)

2.1 材料準(zhǔn)備

2.1.1 病料的采集：死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦等組織樣品，進(jìn)行分別處理或者同時(shí)處理；活禽病料應(yīng)包括氣管或泄殖腔拭子，尤其是以采集氣管拭子更好；小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可采集新鮮糞便。

2.1.2 病料的保存：病料應(yīng)放在含有抗生素的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）內(nèi)（無PBS可用25%～50%的甘油鹽水）。抗生素的選擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素（2 000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）和制霉菌素（1 000IU/mL），但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍，加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0～7.4。在室溫放置1h～2h后樣品應(yīng)盡快處理，沒有條件的可在4℃存放幾天，也可于低溫條件下保存（-70℃貯存最好）。

2.1.3 病料的處理：將棉拭子充分捻動、擰干后棄去拭子；糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10%～20%（g/mL）的懸液。樣品液經(jīng)1 000r/min離心10min，取上清液作為接種材料。

2.2 病毒分離

2.2.1 樣品接種：取處理好的樣品，以0.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡～11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于35℃～37℃孵化箱內(nèi)孵育，18h后每8h觀察雞胚死亡情況。2.2.2 病毒收獲：無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測血凝活性，陽性反應(yīng)說明可能有正黏病毒科的流感病毒；若無血凝活性或血凝價(jià)很低，則用尿囊液繼續(xù)傳2代，若呈陰性反應(yīng)，則認(rèn)為病毒分離陰性。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 A型流感病毒的型特異性鑒定：樣品接種雞胚后，若雞胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性雞胚的絨毛尿囊膜（CAM）制成抗原，與A型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行AGID試驗(yàn)，檢測樣品中是否含有A型流感病毒。

2.3.1.1 抗原制備：從具有血凝活性的雞胚中取出絨毛尿囊膜，用pH7.2的PBS沖洗后，將CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反復(fù)凍融3次～4次，以1 000r/min離心10min后取上清，按終濃度為0.1%的量加入甲醛溶液。置37℃溫箱滅活36h做滅活檢驗(yàn)后即可作為AGID試驗(yàn)用抗原，用禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行型特異性鑒定，若被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間出現(xiàn)清晰的沉淀線即可判定樣品中含有A型禽流感病毒。

2.3.1.2 AGID試驗(yàn)方法：按本標(biāo)準(zhǔn)第4章中的方法進(jìn)行。

2.3.2 血凝素亞型鑒定：當(dāng)雞胚尿囊液具有血凝活性時(shí)，首先應(yīng)排除血凝活性是否由新城疫、減蛋綜合征等病毒引起，同時(shí)要注意是否有禽流感病毒與其他病毒混合感染。雞胚尿囊液具有血凝活性或證明含有A型流感病毒存在后，采用HA-HI試驗(yàn)方法（按本標(biāo)準(zhǔn)第3章中的方法進(jìn)行），用禽流感病毒15種血凝素（H1～H15）亞型分型血清對樣品進(jìn)行病毒亞型鑒定。血凝素亞型鑒定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在國家指定的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.4 致病性測定

禽流感病毒致病性測定應(yīng)在具有高度生物安全性的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，有以下兩種方法，任選其一。

2.4.1 靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）測定法

2.4.1.1 試驗(yàn)雞：6周齡SPF雞，10只。

2.4.1.2 接種材料：感染雞胚的尿囊液，血凝價(jià)在4log2以上，未混有任何細(xì)菌和其他病毒。

2.4.1.3 接種方法：將感染雞胚尿囊液用生理鹽水1：10稀釋，以0.1mL/羽的劑量翅靜脈接種。

2.4.1.4 每日觀察每只雞的發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10d，計(jì)算IVPI值。計(jì)算方法參見附錄A。

2.4.1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)IVPI值大于1.2時(shí)，判定此分離株為高致病性禽流感（HPAI）病毒株。

2.4.2 致死比例測定法

2.4.2.1 試驗(yàn)雞：4周齡～8周齡SPF雞，8只。

2.4.2.2 接種材料：感染雞胚的尿囊液，血凝價(jià)在4log2以上，未混有任何細(xì)菌和其他病毒。

2.4.2.3 接種方法：將感染雞胚尿囊液用生理鹽水1﹕10稀釋，以0.2mL/羽的劑量翅靜脈接種。每日觀察雞的死亡情況，連續(xù)觀察10d。

2.4.2.4 判定方法

2.4.2.4.1 接種10d內(nèi)，能導(dǎo)致6只～7只或8只雞死亡，判定該毒株為高致病性禽流感病毒株。

2.4.2.4.2 分離物能使1只～5只雞致死，但病毒不是H5或H7亞型，則應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：將病毒接種于細(xì)胞培養(yǎng)物上，觀察其在胰蛋白酶缺乏時(shí)是否引起細(xì)胞病變或形成蝕斑。如果病毒不能在細(xì)胞上生長，則分離物應(yīng)被考慮為非高致病性禽流感病毒。

2.4.2.4.3 對低致病性的所有H5或H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的細(xì)胞上能夠生長時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行與血凝素有關(guān)的肽鏈的氨基酸序列分析，如果分析結(jié)果同其他高致病性流感病毒相似，這種被檢驗(yàn)的分離物應(yīng)被考慮為高致病性禽流感病毒。

3 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)技術(shù)

3.1 材料準(zhǔn)備

3.1.1 96孔V型微量反應(yīng)板，微量移液器（配有滴頭）。

3.1.2 阿氏（Alsevers）液、雞紅細(xì)胞懸液，配制方法見附錄B。

3.1.3 pH7.2、0.01mol/L PBS。

3.1.4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型血清以及陰性血清。

3.2 操作方法

3.2.1 血凝（HA）試驗(yàn)（微量法）

3.2.1.1 在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。

3.2.1.2 吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第1孔，混勻。

3.2.1.3 從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。

3.2.1.4 每孔再加入0.025mL PBS。

3.2.1.5 每孔均加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）見附錄B。

3.2.1.6 振蕩混勻，在室溫（20℃～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下）。對照孔紅細(xì)胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底。

3.2.1.7 結(jié)果判定：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。

3.2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）

3.2.2.1 根據(jù)3.2.1試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1﹕256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1﹕64（256除以4）。

3.2.2.2 在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。

3.2.2.3 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。

3.2.2.4 1孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min。

3.2.2.5 每孔加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。

3.3 結(jié)果判定

以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于3log2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于4log2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于5log2為陽性。

4 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)

4.1 材料準(zhǔn)備

4.1.1 硫柳汞溶液、pH7.2、0.01mol/L PBS溶液，配制方法見附錄C。

4.1.2 瓊脂板：制備方法見附錄D。

4.1.3 禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清。

4.2 操作方法

4.2.1 打孔：在制備的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔（中間1孔，周圍6孔），孔徑約5mm，孔距2mm～5mm，將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向?qū)傊舫觯饌吘壔蚴弓傊瑢用撾x皿底。

4.2.2 封底：用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要熔化為止，封閉孔的底部，以防側(cè)漏。

4.2.3 加樣：用微量移液器或帶有6～7號針頭的0.25mL注射器，吸取抗原懸液滴入中間孔（圖1的⑦號），標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別加入外周的①和④孔中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個(gè)外周孔（圖1的②，③，⑤，⑥號孔）。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個(gè)樣品應(yīng)換一個(gè)滴頭。

4.2.4 作用：加樣完畢后，靜置5min～10min，然后將平皿輕輕倒置放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中作用，分別在24h、48h和72h觀察并記錄結(jié)果。

4.3 結(jié)果判定

4.3.1 判定方法

將瓊脂板置日光燈或側(cè)強(qiáng)光下觀察，若標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（圖1的①和④號孔）與抗原孔之間出現(xiàn)一條清晰的白色沉淀線，則試驗(yàn)成立。

4.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

4.3.2.1 若被檢血清（如圖1中的②號孔）與中心抗原孔之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀線，且該線與抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間沉淀線的末端相吻合，則被檢血清判為陽性。

4.3.2.2 若被檢血清（如圖1中的③號孔）與中心孔之間雖不出現(xiàn)沉淀線，但標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（如圖1中④號孔）的沉淀線一端向被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲，則此孔的被檢樣品判為弱陽性（凡弱陽性者應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，仍為弱陽性者，判為陽性）。

4.3.2.3 若被檢血清（如圖1中的⑤號孔）孔與中心孔之間不出現(xiàn)沉淀線，且標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陰性。

4.3.2. 4 若被檢血清（圖1中的⑥號孔）與中心抗原孔之間沉淀線粗而混濁或標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間的沉淀線交叉并直伸，被檢血清為非特異反應(yīng)，應(yīng)重做，若仍出現(xiàn)非特異反應(yīng)則判為陰性。

5 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA）

5.1 材料準(zhǔn)備

5.1.1 酶標(biāo)板、加樣器（帶滴頭），酶標(biāo)測定儀。

5.1.2 使用溶液的配制：方法見附錄E。

5.1.3 間接ELISA抗原，間接ELISA酶標(biāo)抗體。

5.1.4 抗原包被板制備：方法見附錄F。

5.2 操作步驟

5.2.1 樣品準(zhǔn)備：將被檢血清用稀釋液（見附錄E.5）做1﹕400稀釋。

5.2.2 加樣：取出抗原包被板，倒掉孔內(nèi)包被液，用洗液洗3次。除A1、B1、C1和D1孔不加樣品，留作空白調(diào)零，陰性血清和陽性血清做對照各占1孔外，其余孔加1﹕400稀釋的被檢血清，每孔100μL ，將加樣位置做好記錄，將反應(yīng)板蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。

5.2.3 洗滌：倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上控干，每孔加滿洗液，靜置1min～2min后倒掉，控干，再重復(fù)洗2次。

5.2.4 加酶標(biāo)抗體：除A1、B1、C1和D1孔外，其他每孔加酶標(biāo)抗體液100μL ，蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。

5.2.5 洗滌：洗滌方法同5.2.3。

5.2.6 加底物：加底物使用液（見附錄E.6），每孔90μL ，置室溫避光顯色2min～3min。

5.2.7 終止：加中止液（見附錄E.8），每孔90μL ，使其終止反應(yīng)。

5.3 結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔在490nm波長的光密度值（即OD值），OD ≥0.2者判為陽性，0.18≤OD＜0.2需重復(fù)測試1次，若仍在此范圍則判為陽性，OD＜0.18者判定為陰性。

附錄A

（資料性附錄）

高致病性禽流感病毒IVPI測定計(jì)算方法

A.1 記錄方法

根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法每天進(jìn)行記錄：正常雞記為0，病雞記為1，重病雞記為2，死雞記為3（病雞和重病雞的判斷主要依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn)。一般而言，“病雞”表現(xiàn)有下述一種癥狀，而“重病雞”則表現(xiàn)下述多個(gè)癥狀，如呼吸癥狀、沉郁、腹瀉、雞冠和/或肉髯發(fā)紺、臉和/或頭部腫脹、神經(jīng)癥狀。死亡雞在其死后的每次觀察都記為3）。

A.2 IVPI值計(jì)算

IVPI值計(jì)算見式（A.1）。

如指數(shù)為3.00，說明所有雞24h內(nèi)死亡；指數(shù)為0.00，說明10d觀察期內(nèi)沒有雞表現(xiàn)臨床癥狀。

列舉一個(gè)假設(shè)試驗(yàn)來說明IVPI的計(jì)算方法見表A.1。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

HA和HI試驗(yàn)用溶液的配制

B.1 阿氏（Alsevers）液配制

葡萄糖 2.05g

檸檬酸鈉 0.8g

檸檬酸 0.055g

氯化鈉 0.42g

加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa、15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B.2 1%雞紅細(xì)胞懸液制備

采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2、0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1 000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

附錄C

（規(guī)范性附錄）

AGP試驗(yàn)用溶液的配制

C.1 1%硫柳汞溶液的配制

硫柳汞 1.0g

加蒸餾水至 100mL

溶解后，置100mL瓶中蓋塞存放備用。

C.2 pH7.2、0.01mol/L PBS的配制

a） 配制25×PB：稱量2.74g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至100mL。

b） 配制1×PBS：量取40mL 25×PB，加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1 000mL。

c） 用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH值至7.2.

d） 滅菌或過濾。

e）PBS一經(jīng)使用，于4℃保存不超過3周。

附錄D

（規(guī)范性附錄）

瓊脂板的制備

稱量瓊脂糖1.0g，加入100mL的pH7.2、0.01mol/L PBS液中在水浴中煮沸充分溶化，加入8g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL。冷至45℃～50℃時(shí)，將潔凈干熱滅菌直徑為90mm的平皿置于平臺上，每個(gè)平皿加入18mL～20mL，加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發(fā)，放普通冰箱中保存?zhèn)溆茫〞r(shí)間不超過2周）。

附錄E

（規(guī)范性附錄）

高致病性禽流感間接ELISA使用溶液的配制

E.1 碳酸鹽緩沖液（0.05mol/L、pH9.6，CBS）

碳酸鈉 1.59g

碳酸氫鈉 2.93g

用雙蒸水溶解至1 000mL，于4℃保存，不超過1個(gè)月。

E.2磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）

氯化鈉 8g

磷酸二氫鈉 0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 2.9g

氯化鉀 0.2g

加蒸餾水至 1 000mL

E.3洗液（含0.05%Tween-20的0.01mol/L，pH 7.4的PBS，即PBST）

Tween-20 0.5mL

加0.01mol/L、 pH7.4的PBS 1 000mL

E.4封閉液（含0.5%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA） 0.5g

加洗液至 100mL

4℃存放，避光

E.5稀釋液（含0.1%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA） 0.1g

加洗液至 100mL

4℃存放，避光。

E.6間接ELISA底物緩沖液（磷酸氫二鈉-檸椒酸，pH5.4）

0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HP04·12H2O） 26.7mL

0.1mol/L檸檬酸 24.3mL

雙蒸水 49mL

準(zhǔn)確稱量40mg鄰苯二胺（OPD），溶解后置暗處保存，臨用前加入30%過氧化氫150μL 。

用時(shí)現(xiàn)配，避光。

E.7三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCI）緩沖液（0.05mol/L、pH7.6）

0.1mol/L Tris 250mL

0.1mol/L鹽酸 192.5mL

雙蒸水 57.5mL

E.8間接ELISA終止液

濃硫酸 11.1mL

蒸餾水 88.9mL

附錄F

（規(guī)范性附錄）

高致病性禽流感間接ELISA抗原包被板制備

抗原包被板也稱診斷板，將高致病性禽流感抗原用0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液（見附錄第E.1章）稀釋成3μg/mL（全病毒抗原）或6μg/mL（重組核蛋白抗原），包被40孔聚苯乙烯微量板，每孔100μL ，置4℃冰箱過夜，用洗液洗滌（見附錄第E.3章）3次，用封閉液（見附錄第E.4章）于37℃濕盒內(nèi)封閉60min，用洗滌液洗滌3次，干燥后即為診斷板，置4℃冰箱備用。