檢測(cè)嵌合的基因標(biāo)記及實(shí)驗(yàn)室方法隨著造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展而演化發(fā)展。大致可分為生化方法、細(xì)胞遺傳學(xué)分析和分子生物學(xué)分析三大類方法。

迄今已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)血型系統(tǒng)，共400多種紅細(xì)胞血型，人類個(gè)體紅細(xì)胞血型表型至少在1×10 ⁹種以上，因而紅細(xì)胞血型表型可以作為植入證據(jù)，廣泛的紅細(xì)胞抗原檢測(cè)可以識(shí)別80%以上的同胞供、受者，交叉凝集和流式細(xì)胞儀檢測(cè)敏感性可達(dá)0.1%～0.5%。但檢測(cè)紅細(xì)胞抗原的方法有一定局限性，因?yàn)椋孩偌t細(xì)胞壽命較長(zhǎng)，紅細(xì)胞抗原系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果易受移植前和移植后輸血的影響；②在髓系植入良好的ABO血型不合的HSCT中，因溶血導(dǎo)致供者紅細(xì)胞在受者血液循環(huán)中延遲出現(xiàn)，此時(shí)不宜采用紅細(xì)胞抗原作為植入證據(jù)；③為了發(fā)現(xiàn)供、受者之間紅細(xì)胞抗原差異，常須進(jìn)行多個(gè)系統(tǒng)的紅細(xì)胞血型檢測(cè)。

僅適用于HLA不合的HSCT，但受移植后抗原表達(dá)及實(shí)驗(yàn)方法的限制，本方法的靈敏度僅可為25%～50%，且不能用于HSCT早期的檢測(cè)。

由于目前對(duì)免疫球蛋白同種異型認(rèn)識(shí)有限，其個(gè)體識(shí)別率尚低，此外，它僅能反映B淋巴細(xì)胞的植活狀態(tài)，受血漿及免疫球蛋白制品輸注的影響。

對(duì)某一個(gè)個(gè)體而言，來(lái)源于同一干細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)同工酶酶譜是穩(wěn)定的，因此，多種酶譜的組合可用于個(gè)體識(shí)別，而且可用于檢測(cè)各種細(xì)胞系的植活狀態(tài)。同工酶檢查具有快速、靈敏和重復(fù)性好等特點(diǎn)，但對(duì)個(gè)體識(shí)別率低，不能用于所有HSCT供、受者，而且也受輸血的影響。

傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析采用中期細(xì)胞分裂相檢測(cè)標(biāo)志染色體，可用于HSCT早期植入的監(jiān)測(cè)和多個(gè)細(xì)胞系的監(jiān)測(cè)，且不受輸血的影響。這種方法用于植入檢測(cè)有一定局限：①僅適用于患者具有腫瘤的遺傳學(xué)標(biāo)記（如Ph ⁺標(biāo)記染色體）或供、受者之間存在性別差異時(shí)；②費(fèi)時(shí)費(fèi)力；③染色體分析需要分裂細(xì)胞，而HSCT早期常找不到細(xì)胞分裂相。染色體檢查結(jié)果的可靠性及靈敏度在很大程度上取決于所檢測(cè)的分裂細(xì)胞數(shù)，如要獲得99%可信限，至少要查300個(gè)分裂細(xì)胞方能發(fā)現(xiàn)1%水平的嵌合狀態(tài)，而在HSCT后，尤其在移植早期，這幾乎是不可能的。常規(guī)檢查20～30個(gè)分裂細(xì)胞，只可獲得14%左右的靈敏度（95%可信限）。對(duì)于Y染色體的分析采用Q帶技術(shù)分析可以不需要分裂細(xì)胞，但假陽(yáng)性和假陰性率過(guò)高，影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

20世紀(jì)80年代分子生物學(xué)技術(shù)更新了基因標(biāo)記的應(yīng)用。到今天廣泛使用的兩種嵌合檢測(cè)方法為：一種是基于性別染色體特異探針的熒光原位雜交技術(shù)（FISH），另一種是基于可變數(shù)目重復(fù)序列（VNTR）及短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)性的DNA片段擴(kuò)增技術(shù)（STR-PCR）。FISH檢測(cè)可以精確到單個(gè)細(xì)胞水平，但只能用于供、受者性別不合或常染色體有特異標(biāo)記的病例。VNTR/STR多態(tài)性可以鑒別幾乎所有的異基因供-受者對(duì)，但不能精確到單個(gè)細(xì)胞水平。兩種方法都有較高的靈敏性和特異性，都能提供定量的結(jié)果。兩種方法都很適合臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，都可以分析存檔的標(biāo)本。最近隨著熒光定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)的推廣，出現(xiàn)了基于雙等位基因多態(tài)性位點(diǎn)的熒光定量高敏嵌合檢測(cè)的報(bào)道，該方法比STR-PCR及熒光原位雜交方法有更高的靈敏度，并且可以提供準(zhǔn)確定量結(jié)果。近年來(lái)隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了二代測(cè)序嵌合分析的報(bào)道，選取多個(gè)SNP位點(diǎn)或HLA中的多態(tài)性位點(diǎn)應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)分析嵌合度，具有較高的敏感性，但還未見大規(guī)模的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)報(bào)道。

采用Southern印跡雜交法檢測(cè)RFLP：目前已發(fā)現(xiàn)并克隆出多種具有高識(shí)別率（90%～99%）的DNA片段。用這些片段做探針與經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化并電泳分離的DNA雜交，可發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的DNA片段具有個(gè)體特異性。經(jīng)常應(yīng)用的多是單個(gè)位點(diǎn)特異性探針，靈敏度為1%～10%。由于HSCT供、受者常為同胞，同胞之間每個(gè)位點(diǎn)至少有25%的概率相同，因此各種單位點(diǎn)特異性探針用于HSCT，其識(shí)別率最多不超過(guò)75%，因此，為達(dá)到對(duì)幾乎所有BMT受者能進(jìn)行植活監(jiān)測(cè)，常需使用一系列位點(diǎn)特異性探針。多位點(diǎn)特異性探針可同時(shí)識(shí)別多個(gè)位點(diǎn)，形成可用于個(gè)體識(shí)別的RFLP，這一技術(shù)用于HSCT植活狀態(tài)監(jiān)測(cè)，幾乎可用于所有患者。與普通RFLP法相比，所形成圖譜條帶太多，分析比較困難，靈敏度也較前者為低。

基于性別染色體特異探針的FISH，相比較傳統(tǒng)的染色體中期分裂象細(xì)胞遺傳學(xué)分析有許多的優(yōu)點(diǎn)。FISH簡(jiǎn)單并且高度節(jié)省時(shí)間，可以對(duì)中期細(xì)胞及間期細(xì)胞同時(shí)分析。可以同時(shí)分析基因標(biāo)記，形態(tài)標(biāo)記及單個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記。可以同時(shí)分析大量細(xì)胞，有較高的準(zhǔn)確性和靈敏性。最初用于嵌合檢測(cè)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)報(bào)道了應(yīng)用Y染色體特異的DNA重復(fù)序列探針進(jìn)行FISH分析，男性出現(xiàn)假陰性的上限為5.6%，女性出現(xiàn)假陽(yáng)性的上限為2.7%。

該方法也存在一定的局限性：老年男性可能存在與年齡有關(guān)的Y染色體丟失，可能存在與腫瘤細(xì)胞核型相關(guān)的Y染色體丟失，還可能存在Y染色體探針靶序列部分的結(jié)構(gòu)性改變。由于以上缺陷，在檢測(cè)樣本前應(yīng)該用傳統(tǒng)的核型方法或熒光原位雜交法確定Y染色體的完整性。用Y染色體特異探針顯示沒有信號(hào)的細(xì)胞來(lái)自女性，由于技術(shù)錯(cuò)誤影響雜交也可能造成Y染色體特異探針沒有信號(hào)顯示。這一問(wèn)題可以通過(guò)混合應(yīng)用X和Y染色體特異探針進(jìn)行雙色檢測(cè)來(lái)解決。應(yīng)用雙色檢測(cè)，男性出現(xiàn)XX細(xì)胞假陽(yáng)性的上限為0.63%，女性出現(xiàn)XY假陽(yáng)性的上限為0.30%。這種應(yīng)用性染色體標(biāo)記的分子遺傳學(xué)方法主要缺點(diǎn)是只能用于性別不同的供-受者對(duì)。

人類基因的特定核心序列存在重復(fù)串聯(lián)序列，在某一特定位點(diǎn)不同個(gè)體串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目不同。VNTR序列的微衛(wèi)星核心長(zhǎng)度為8～50個(gè)堿基，STR序列的微衛(wèi)星核心長(zhǎng)度為2～8個(gè)堿基。某一位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目多態(tài)性的遺傳遵守孟德爾遺傳法則。人類基因中存在著大量的微衛(wèi)星位點(diǎn)，某些位點(diǎn)的等位基因大于25個(gè)。在少至6個(gè)位點(diǎn)時(shí)異基因同胞供-受者對(duì)就能找到有信息的供者及受者標(biāo)記。

VNTR及STR的多態(tài)性通過(guò)PCR擴(kuò)增特定的DNA片段可以很方便地確定。寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在互補(bǔ)鏈的非多態(tài)性的兩端，通過(guò)變性、退火及延伸的反復(fù)循環(huán)，供者及受者來(lái)源的DNA片段得到10 ⁶～10 ⁹的擴(kuò)增，能夠用溴化乙錠或銀染來(lái)分析。當(dāng)應(yīng)用熒光引物時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物可用毛細(xì)管電泳及熒光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)。通過(guò)在一管中同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)位點(diǎn)來(lái)提高檢測(cè)效率。同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增有利于找到有信息位點(diǎn)，在解釋結(jié)果時(shí)仍需要供者及移植前受者的標(biāo)本。多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)設(shè)計(jì)時(shí)采用信息度高的位點(diǎn)，位點(diǎn)的信息度與其在人群中的雜合頻率有關(guān)。

DNA擴(kuò)增法使得極其少量的起始樣本也能進(jìn)行嵌合分析，可以克服由于植入失敗或白細(xì)胞減少癥時(shí)起始標(biāo)本少的弊病。檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1%～5%，根據(jù)片段的長(zhǎng)度及擴(kuò)增效率有所不同，在某些病例可達(dá)到0.1%。DNA擴(kuò)增法會(huì)因污染產(chǎn)生干擾，通過(guò)同時(shí)擴(kuò)增移植后標(biāo)本，供者及移植前患者標(biāo)本，可以很清楚地確定供者特異或受者特異的擴(kuò)增，避免背景條帶引起的干擾。當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)，可以進(jìn)行定量分析。當(dāng)?shù)任换蜷L(zhǎng)度差別較大時(shí)會(huì)對(duì)結(jié)果有影響，因?yàn)槎唐螘?huì)優(yōu)先擴(kuò)增。技術(shù)本身的缺陷如重疊峰也會(huì)影響結(jié)果，重疊峰由于擴(kuò)增產(chǎn)物含有比正常片段少一個(gè)重復(fù)序列的片段引起。可以通過(guò)平均幾個(gè)有信息位點(diǎn)的結(jié)果來(lái)提高準(zhǔn)確性，文獻(xiàn)報(bào)道有專門描述結(jié)果的術(shù)語(yǔ)及相關(guān)的計(jì)算機(jī)軟件。STR多重?cái)U(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)是可以用于所有的供-受者對(duì)，不受供、受者性別的限制。這也是該方法優(yōu)越于性染色體熒光原位雜交法的地方。

當(dāng)某些Y染色體特異的序列用于熒光定量擴(kuò)增時(shí)，在女性受者中檢測(cè)到男性細(xì)胞的靈敏度達(dá)到0.01%。一些VNTR/STR以外的雙等位基因多態(tài)性位點(diǎn)也用于定量高敏嵌合檢測(cè)。有兩種類型的位點(diǎn)：第一種是針對(duì)單核苷酸多態(tài)性或幾個(gè)堿基插入及缺失多態(tài)性設(shè)計(jì)特異寡核苷酸引物來(lái)區(qū)分供、受者，分析條件需要嚴(yán)格控制確保特異引物只與一個(gè)等位基因結(jié)合，從而選擇性的擴(kuò)增有信息的供者或受者位點(diǎn)。第二種是針對(duì)長(zhǎng)片段的插入或缺失多態(tài)性或等位基因缺失設(shè)計(jì)特異引物來(lái)區(qū)分供、受者，文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用7～11個(gè)第一種位點(diǎn)，90%的供-受者對(duì)能找到有信息位點(diǎn)；應(yīng)用10個(gè)第二種位點(diǎn)，80%的供-受者對(duì)找到至少一個(gè)受者型位點(diǎn)。Willasch等報(bào)道應(yīng)用29個(gè)雙等位基因多態(tài)性位點(diǎn)，96%的受者型基因能夠得到鑒別（ n=317），平均有信息點(diǎn)數(shù)為2.5（1～7），在83.3%的分析中敏感度可達(dá)0.1%。Qin等應(yīng)用29個(gè)雙等位基因多態(tài)性位點(diǎn)，97%的受者型基因能夠得到鑒別（ n=101），平均有信息點(diǎn)數(shù)為2.5（1～7），敏感度可達(dá)0.1%。

應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增以上位點(diǎn)是在PCR擴(kuò)增指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，而VNTR/STR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物是在PCR擴(kuò)增平臺(tái)期分析，因此熒光實(shí)時(shí)定量法有極高靈敏度可達(dá)0.01%～0.1%，可信區(qū)間為+30%～-25%，當(dāng)供者細(xì)胞超過(guò)50%時(shí)，用受者特異位點(diǎn)檢測(cè)，當(dāng)受者細(xì)胞超過(guò)50%時(shí)，用供者特異位點(diǎn)檢測(cè)可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

近年來(lái)二代測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，二代測(cè)序技術(shù)有著高通量、自動(dòng)化程度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢測(cè)的各個(gè)方面得到了廣泛的應(yīng)用。Debeljak等選擇了HLA-A區(qū)域的18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行二代測(cè)序分析，方法的檢出限可達(dá)0.01%。Aloisio等報(bào)道應(yīng)用44個(gè)SNP位點(diǎn)組合進(jìn)行二代測(cè)序分析，能鑒別供受者的特異位點(diǎn)數(shù)均值為16個(gè)，方法的檢出限為1%，但目前還未見大規(guī)模的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)報(bào)道。