第十一節
蛋白質的“路牌”

真核細胞中各種細胞器的出現使得細胞中的生理功能有巨大的提升。不同的細胞功能在不同的細胞器中進行，不僅避免了互相干擾，效率也大大提高。例如細胞核可以按需要合成所需要的mRNA并對其進行加工，在內含子被剪切掉還“穿靴戴帽”以后，才被“釋放”到細胞質中指導蛋白質的合成。線粒體是細胞的“動力工廠”，燃料分子在這里被徹底氧化，變成二氧化碳和水，被釋放出來的能量則被用來合成ATP。葉綠體是進行光合作用，合成有機物的地方。而溶酶體是細胞的“胃”和“回收中心”。不過這種狀況也帶來一個問題：這些細胞器所需要的蛋白質是如何找到自己的“工作場所”的？原核細胞的內部是不分區間的，里面的分子可以在整個細胞里面跑來跑去。真核細胞的內部分區間后，如果沒有專門的機制讓各種蛋白質找到各自的“家門”，就會造成混亂。例如細胞核中的組蛋白跑到不需要組蛋白的線粒體中去，線粒體里面的蛋白質跑到葉綠體中去，那豈不亂套？可是細胞里面又沒交通警察來指揮蛋白質分子往哪里走，蛋白質分子怎么能夠找到自己的路呢？

為了讓蛋白質“各得其所”，真核細胞發展出多種復雜的機制來引導不同細胞器的蛋白質只去自己的目的地。機制雖然復雜，總的原則是讓這些蛋白質攜帶上自己的“路牌”，以便讓“有關單位”認識和放入。蛋白質分子到達自己的目的地主要通過兩條通路：通過細胞質運動和通過膜包裹的小囊運輸。在前一節中，我們已經簡要介紹了蛋白質被送往溶酶體、細胞表面以及分泌到細胞外的途徑，在這一節中，我們將系統地介紹蛋白質到達自己工作場所的機制。

目的地是細胞核、線粒體和葉綠體的蛋白質是走細胞質這條路的。這些蛋白質被游離在細胞質中的核糖體合成，然后被釋放到細胞質中。這些蛋白質合成后不會經過進一步的修飾（例如加上糖基或去掉一些氨基酸），但是常常在其他蛋白質的“護送”下，移動到所要去的細胞器。這些蛋白質本身所帶的信號（一些特殊的氨基酸序列）決定它們由哪些蛋白質護送到該去的細胞器中去。

細胞核

細胞核不合成任何蛋白質，所以細胞核里面的蛋白質都是在細胞質中合成，再進入細胞核的，包括與DNA結合的組蛋白、在核膜內面形成網狀結構的核纖層蛋白（lamin）、參與細胞核中各種結構形成的核質蛋白（nucleoplasmin）等。細胞核由兩層膜包裹，所以物質進出細胞核是通過橫穿兩層核膜的核孔（nuclear pore）這個通道進行的。核孔是由三十多種蛋白質，數百個蛋白質分子組成的環狀通道，外徑約129納米，內徑幾納米，可以讓小分子自由通過，但是許多蛋白質要進入細胞核就需要“路牌”，或“通行證”。

這個“路牌”，就是蛋白質分子氨基端（即蛋白質被合成時開始的那一端，帶有氨基酸的自由氨基）上一串特殊的氨基酸序列。這個序列可以是7個氨基酸殘基的序列，中間有5個連續的帶正電的氨基酸殘基，例如脯-賴-賴-賴-精-賴-纈（其中帶正電的氨基酸名稱用粗體字表示，“氨酸”兩個字省略），也可以是兩組由兩個帶正電的氨基酸殘基組成序列，中間被10個其他氨基酸殘基隔開，例如精-賴-天冬-谷-纈-天冬-甘-蘇-天冬-谷-纈-丙-賴-賴-賴-絲。改變這些帶正電的氨基酸，例如用不帶正電的氨基酸代替，蛋白質就會留在細胞質中，不再進入細胞核。反之，如果把這些信號序列引入到本來是位于細胞質中的蛋白質序列中去，例如丙酮酸激酶，這個蛋白質就會被轉運到細胞核中去，說明這些序列的確是蛋白質進入細胞核的“入核信號”，或“路牌”。

僅從這些氨基酸序列，還不容易看出這些信號的意義。但是如果我們看一下這些序列的空間結構，它們的特點就變得明顯了。蛋白質分子中氨基酸之間相互連接的肽鍵是由氨基和羧基之間脫去一個水分子形成的，結構是—CO—NH—。其中的氧原子帶一些負電，氮原子上面的氫原子帶一些正電。如果肽鏈能夠卷曲成為一個螺旋管，一個這樣的氧原子就可以和后面（羧基端方向）第三個肽鍵上的氫原子之間形成氫鍵。這樣形成的螺線管結構叫做 α 螺旋，其中每3.6個氨基酸單位旋轉一圈（參看圖2-5）。每個氨基酸殘基的側鏈向外伸出，好像狼牙棒上的“牙齒”。了解了α-螺旋的結構，上面說的蛋白質進入細胞核的“路牌”的結構就清楚了。連續5個帶正電的氨基酸的側鏈會在 α-螺旋外部形成一個帶正電的螺旋，是一個很明顯的空間特征。而被10個氨基酸單位隔開的正電氨基酸組在 α-螺旋中就是排列在螺旋同一側的兩處正電區域，因為11個氨基酸差不多正好轉3圈。這就好像圓柱的同一側有兩個相隔不遠的正電區域，也是一個明顯的空間信號（圖3-28左）。

光有“路牌”還不夠，還要有能夠認識這個路牌的機制。這是由一種叫做輸入蛋白-α（importin- α）來實現的。輸入蛋白-α 能夠識別蛋白質分子上的“入核信號”并且與之結合。接著，輸入蛋白-α 和輸入蛋白-β（importin-β）結合，輸入蛋白-β又會被核孔上的蛋白質“認識”，這樣要進入細胞核的蛋白質就在輸入蛋白-α和-β的“護送”下，經過核孔進入細胞核。到細胞核里面以后，一種叫做RanGTP（結合了GTP的Ran）的蛋白質結合于輸入蛋白-α和-β上，使它們離開被輸入的蛋白質，這個蛋白質就被釋放到細胞核里面了。在蛋白質進入細胞核以后，構成“路牌”的氨基酸序列仍然是蛋白質的一部分，不會被除掉。

和RanGTP結合的輸入蛋白-α和輸入蛋白-β在CAS 蛋白（cellular apoptosis susceptibility protein）的幫助下返回細胞質，在那里RanGTP把其中的GTP水解為GDP，使輸入蛋白-α和-β與Ran蛋白分開。輸入蛋白-α和-β又可以結合新的蛋白質分子并將其輸入到細胞核中去。RanGDP在得到高能磷酸鍵變回RanGTP后，又回到細胞核中解離更多的輸入蛋白-α和-β。雖然輸入蛋白-α和-β護送蛋白質通過核孔進入細胞核時不需要額外提供能量，但是RanGTP/RanGDP在運送輸入蛋白-α和-β回細胞質的循環中要消耗兩個分子的GTP，所以整個運輸過程還是需要能量的。通過這種機制，每對輸入蛋白每秒鐘可以輸送約1000個蛋白質分子進入細胞核。這個速度雖然快得令人難以想象，但是看一下細胞里面分子激烈運動的情形（見第二章第十四節，喧鬧中的秩序），這個效率就可以理解了。

線粒體

線粒體含有大約1000種蛋白質，其中99%為這些蛋白質編碼的基因都已經轉移到細胞核的DNA里面去，所以這些基因的產物（蛋白質）也就必須先在細胞質中合成，再輸送到線粒體里面去。而線粒體是由兩層膜包裹的，這些膜也不像細胞核的膜那樣上面有孔，否則為合成ATP所需要的跨膜氫離子濃度梯度就會散失。因此，在細胞質中合成的蛋白質要進入線粒體，就必須穿過兩層完整的膜，才能到達線粒體的內腔，即基質（matrix），這就需要這兩層膜上都有讓蛋白質穿過的通道，蛋白質自身也必須有某種“路牌”，才能被線粒體識別和接納。這個進入線粒體的“路牌”，就是在蛋白質的氨基端上另外加上的15~55個氨基酸單位長的信號肽。這些信號肽含有不連續的帶正電的氨基酸殘基，例如賴氨酸和精氨酸，它們之間被親脂的氨基酸殘基隔開。這樣的信號肽形成 α-螺旋時，帶正電的氨基酸側鏈都排列在螺旋的同一側，而親脂的側鏈排列在螺旋的另一側（圖3-29左下）。這種“雙重性質”的信號段也是一個很容易辨認的目標。為了使這個空間性質盡可能地明顯，這個信號段里不含有帶負電的谷氨酸和天冬酰胺。

線粒體的外膜上含有專門的蛋白質輸入通道，叫做外膜通道（TOM）。TOM由多個蛋白亞基組成，能夠識別輸入蛋白質的“路牌”并讓其通過。與核孔內徑有數個納米，可以讓已經卷曲的蛋白質進入不同，這些線粒體通道非常狹窄，不能夠讓已經卷曲成三維結構的蛋白質通過，所以要進入線粒體的蛋白質只能在未卷曲的狀態下像一根繩子那樣穿過通道。但是這樣一來，蛋白質的親脂區段就會暴露出來，容易彼此交纏形成沉淀。為了防止這種情況，這些蛋白質在進入線粒體之前，先要和一種伴侶蛋白（chaperone）結合，掩蓋其親脂的部分，使肽鏈保持伸展狀態而不因交纏而沉淀。由于溫度升高時，蛋白質也容易變性沉淀（一個極端例子是把雞蛋煮熟時的蛋白變性），這些伴侶蛋白可以起到防止其他蛋白質變性沉淀的作用，增加細胞的生存能力，所以這些蛋白也被稱為熱激蛋白（heat shock protein,簡稱Hsp）。保護要進入線粒體的蛋白質，并且將它們護送至線粒體的伴侶蛋白就是熱激蛋白Hsp70，其中的數字70是指蛋白質的相對分子質量，以千為單位，所以Hsp70的相對分子質量是70000。蛋白質在細胞質中合成后，它就立即與其結合，再向線粒體移動，從TOM進入線粒體。

線粒體的內膜上也有讓蛋白質進入的通道，叫內膜通道（TIM），TIM也由多個蛋白亞基組成，輸入蛋白質也只能以伸展的肽鏈的方式通過TIM。在一般情況下，線粒體的內膜和外膜是被膜際空間（intermembrane space）分開的。為了提高蛋白質進入線粒體內部的效率，內膜和外膜在一些地方彼此靠近接觸，位于外膜和內膜上的蛋白質轉運通道TOM和TIM可以彼此接觸和相互作用。這樣蛋白質在經過外膜通道后，可以立即再穿越內膜通道，進入基質（圖3-29上）。

蛋白質進入基質后，肽鏈仍然處于伸展狀態，因而是不穩定的。它們需立即結合在另一個Hsp70分子上，以防止交纏沉淀。Hsp70接著把肽鏈轉移給Hsp60。Hsp60是一個由14個蛋白亞基組成的圓筒形結構，將肽鏈裝在圓筒內。這14個亞基都結合有ATP分子，ATP的水解提供能量使肽鏈脫離Hsp60并且卷曲成三維結構。位于基質中的一種蛋白酶把信號肽從蛋白質分子上切掉，蛋白質進入線粒體基質的過程就算是完成了。位于基質中的蛋白質，例如醇脫氫酶，就是這樣進入的。

從這個過程可以看出，蛋白質進入線粒體基質和進入細胞核有相似之處，即都在細胞質中合成，都有伴侶蛋白護送至目的地，都要跨越兩層膜，都有自己的“路牌”，即位于氨基端信號區段。不同的是，蛋白質進入細胞核是在卷曲的狀態下，而進入線粒體的蛋白質必須在伸展的狀況下；伴隨蛋白質進入細胞核的輸入蛋白-α 和-β結合的作用僅僅是“引路”，而伴隨蛋白質進入線粒體的Hsp70則是穩定未折疊的結構，防止它交纏沉淀；進入細胞核的蛋白質信號區段不被切掉，而進入線粒體的蛋白質信號肽是要被切掉的。

進入線粒體的蛋白質不都是進入基質的。有的要進入線粒體外膜，有的要進入兩層膜之間，有的要進入內膜。這些蛋白質也都有各自的“路牌”。進入線粒體外膜的蛋白質在其跨膜區段也有專門的信號，在通過位于外膜上的TOM進入到兩膜之間后，再通過小蛋白分子的幫助，通過外膜上的分類組裝復合物（sorting and assemblymachinary,簡稱SAM）插入到外膜中去（圖3-29下）。進入內膜的蛋白質在其跨膜區段有進入內膜的信號，包括一連串親脂的氨基酸殘基。進入到兩層膜之間后，在一些小蛋白分子的幫助下通過內膜上另一個TIM插入內膜，這些親脂氨基酸組成的區段就是蛋白質穿越內膜的部分。進入兩層膜之間的蛋白質有富含半胱氨酸殘基的信號段，進入兩層膜之間后結合于膜間裝配復合物（mitochondrial intermambrane spaceimport and assembly，簡稱MIA），然后就停留在那里。因此蛋白質進入線粒體的不同部位是一個非常復雜的過程，牽涉到幾十種蛋白質，而且去每個目的地都有自己特殊的“路牌”。

葉綠體

和線粒體類似，葉綠體也是被吞入的原核細胞（藍細菌）演變成的細胞器，它的大部分基因也被轉移到寄主細胞的細胞核中，所以這些被細胞核DNA編碼的葉綠體蛋白質也必須先在細胞質中合成，再被轉移到葉綠體中。

和線粒體的蛋白質穿膜類似，要進入葉綠體的基質（stroma）區域也必須穿過兩層膜，即葉綠體的外膜和內膜。穿過兩層膜的地方也是這兩層膜能夠彼此接觸的點，在這里位于外膜上的轉運通道——葉綠體外膜轉運通道（TOC）和位于內膜上的轉運通道——葉綠體內膜轉運通道（TIC）能夠互相作用，快速將蛋白質連續轉運到基質中去。與線粒體內外膜的轉運通道TOM和TIM相似，TOC和TIC也由多個蛋白亞基組成。

進入葉綠體基質的蛋白質也必須以鏈伸展的形式通過膜上的轉運通道，所以它們在細胞質中被合成以后，并不卷曲成最后的三維結構，而是和伴侶蛋白Hsp70結合，在這些蛋白質的陪伴下向葉綠體移動，并且被膜上的轉運通道識別，再被轉移到葉綠體內的基質中去。

要進入葉綠體基質的蛋白質在其氨基端也有附加的信號肽，在進入基質后信號肽也被剪除。信號肽的長度為30個到100多個氨基酸殘基不等，而且不同蛋白質的信號肽彼此不同。迄今為止，科學家還沒有能夠找出這些信號肽的共同特點（圖3-30）。

和線粒體類似，進入葉綠體的蛋白質除了進入基質外，還有葉綠體的其他地方，例如葉綠體的外膜、內膜、兩膜之間。除此之外，葉綠體還有類囊體（thylakoid），即位于基質內，由膜包裹的囊狀物，是進行光合作用的地方，有些進入基質的蛋白質還要進入類囊體的膜和類囊體的腔（lumen）。所以進入葉綠體的蛋白質的去向比線粒體里面要多，更需要不同的信號和識別機制。例如進入類囊體的蛋白質除了在氨基端有附加的進入基質的信號肽外，還含有進入類囊體腔的信號肽。這些蛋白質在進入基質后，進入基質的信號肽被切除，進入類囊體腔的信號肽就成為新的氨基端，指導蛋白鏈通過內囊體膜進入類囊體腔。

葉綠體上負責識別“路牌”和轉運蛋白質的轉移通道在所有進行光合作用的真核生物中都是相同的：在葉綠體的外膜上是Toc75，在葉綠體內膜上是Tic20、Tic22、Tic110。如果不同生物中的葉綠體是各自形成的，這些基因轉入細胞核的蛋白質的轉運機制不會如此相同。這些蛋白質的基因，除了Tic110以外，都可以在藍細菌中找到，說明藍細菌有把光合作用所需要的蛋白質轉運到類囊體膜（thylakoid membrane）的機制，也說明葉綠體的確是從藍細菌衍生而來的。而Tic110是藍菌被真核細胞吞進后才出現的基因，為所有的葉綠體所共有。

真核細胞里面的蛋白質要到達目的地，除了通過細胞質外，還有另外一條道路，那就是進入細胞內的膜系統，在那里被修飾后，被膜包裹成小囊泡輸送到目的地。小囊運輸這種方式的出現，主要是因為真核細胞有三大類蛋白帶有糖基，都需要在內質網和高爾基體的腔內糖基化。進入內質網和高爾基體的腔內的蛋白質，它們的轉運必須通過小囊運輸。

蛋白質進入內質網的“路牌”

由于在蛋白質分子上添加糖基的酶都位于內質網和高爾基體內，要被糖基化的蛋白質必須先進入內質網的腔內，或者插入內質網的膜，使部分肽鏈位于內質網腔內。為此，這些蛋白質都具有進入內質網的“路牌”——一段位于蛋白質氨基端上的信號肽。這段信號肽含有一串親脂的氨基酸殘基，前面帶有一個或幾個帶正電的氨基酸殘基。在這段信號肽被核糖體合成并且伸出核糖體之外時，被細胞質中的信號識別顆粒（signal recognition particle，簡稱SRP）識別并且與之結合。這時蛋白合成暫時減緩，讓SRP帶著核糖體在內質網膜上尋找SRP受體。一旦SRP與內質網膜上的受體結合，已經合成的信號肽就會進入內質網膜上的蛋白轉運通道。這時蛋白質的合成過程恢復，新合成的肽鏈一邊合成一邊從蛋白轉運通道進入內質網腔內。信號肽會被腔內的信號肽酶切掉，所以信號肽不是蛋白質最終的組成部分，類似于進入線粒體和葉綠體的信號肽。（圖3-31）。

在蛋白質被轉運到內質網腔內的過程中，腔內的糖基轉移酶就會在肽鏈上尋找加糖基的信號，例如往天冬酰胺殘基上加糖鏈的“天冬—X—絲或蘇”（DXS/T）信號。一旦信號被找到，糖鏈就會被加到肽鏈上，而不等到整個蛋白質分子都被轉運完畢。在肽鏈被轉運過膜的過程中，進入腔內的肽鏈部分就開始卷曲折疊。被卷曲到蛋白質分子內部的“天冬—X—絲或蘇”信號就不再能夠被識別，所以不是所有的“天冬—X—絲或蘇”信號都會導致糖基化，只有那些暴露在蛋白質分子表面的“天冬—X—絲或蘇”信號才會導致糖基化。在高爾基體中，這個糖鏈再以各種形式被修飾，去掉一些單糖或加上更多的單糖，就要看該細胞的高爾基體中所含的糖鏈修飾酶的種類。O-糖基化沒有事先合成好的糖鏈被加到蛋白質分子上，而是每次加減一個糖分子，其識別信號目前還不清楚。

合成這些蛋白質的核糖體是附著在內質網膜上的，使這部分的內質網膜顯得粗糙，稱為糙面內質網，而合成經由細胞質轉運的蛋白質的核糖體是游離在細胞質中的。這種現象使人懷疑這兩種核糖體是否有什么不同。其實這兩種核糖體之間并無區別。核糖體是否附在內質網膜上，取決于被合成的蛋白質是否有進入內質網的信號肽。如果有，在蛋白質合成開始后，信號肽就會通過SRP把核糖體帶到內質網膜上。所以信號肽不但能夠決定自己進入內質網，還能通過能夠識別這個信號的SRP“指揮”核糖體附著在內質網膜上，把蛋白質合成-蛋白質跨膜轉運結合成為一個過程。

糖化的蛋白質的“路牌”

如前所述，進入內質網的蛋白質有三大類，分別是進入溶酶體的蛋白、去細胞膜的蛋白以及分泌到細胞外的蛋白。它們使用共同的“路牌”進入內質網被糖基化，那么它們后來不同的去向又是如何被決定的呢？這也是由蛋白質自身攜帶的信號決定的。

進入內質網腔的蛋白要被轉運出去，首先要保證它們不被留在內質網內。但是有些蛋白的最終目的地就是內質網腔，例如給進入內質網腔的蛋白質加上糖基的酶就需要在內質網腔中工作。這些留在內質網腔里面的蛋白質都有一個在那里工作的“工作證”，那就是蛋白質中由4個氨基酸殘基組成的序列“賴-天冬-谷-亮”（用氨基酸的單個字母表示就是KDEL）。有這個“工作證”的蛋白質會留在內質網腔內。沒有這個“工作證”的蛋白會被轉運出去。

這些蛋白質沒有在內質網中的“工作證”，在糖基化后被送到高爾基體中去。如前所述，這些蛋白質在高爾基體內會被做一個“記號”，這就是在糖鏈中甘露糖的第6位碳原子上加上一個磷酸根。形成的“6-磷酸甘露糖”，這就是進入溶酶體的“路牌”。它被位于高爾基體膜上的“6-磷酸甘露糖受體”識別，將它們與膜聯系在一起。這些蛋白質隨后聚集在反面高爾基體膜的一個小區域內，這部分膜再突起分裂出去形成輸送小囊，運送至溶酶體。小囊的膜與溶酶體的膜融合，就把這些蛋白質釋放到溶酶體腔里了。

插入內質網膜，但是停留在膜上的蛋白質除了氨基端的信號肽外，在后面還有由另一連串親脂氨基酸殘基組成的區段。這就是一個“停止轉運”的信號，肽鏈轉運到這里就會停止，讓蛋白質成為插入膜上的蛋白，再通過小囊運輸和與細胞膜融合，進入細胞膜。

有些蛋白質既沒有留在內質網中的“路牌”，又沒有去溶酶體的“路牌”。這些蛋白質即使被糖基化了，糖鏈上面也有甘露糖單位，這些甘露糖也不會被磷酸化，所以不會去溶酶體。這些蛋白質分子就被高爾基體“打包”，由小囊運輸到細胞膜，小囊的膜與細胞膜融合，這些蛋白質就被釋放到細胞外，成為細胞分泌的蛋白質。