傳統的細菌學研究方法包括顯微鏡技術、培養和鑒定技術，這些技術存在著很大的限制，首先是他們的敏感性不高，對不能培養的細菌和未知的菌種無法檢測；其次是需要的時間長，受多種因素的影響，重復性和定量差；此外由于各個菌種的生長速率和需要的條件不同，定量的準確性不高。為了克服這些障礙，基于檢測細菌16S rDNA基因的分子生物學技術應運而生，目前已經成為微生態學研究的主要方法之一。

細菌16S rRNA由1500個核苷酸組成，分子量相對適中，具有保守區和可變區交錯排列的獨特結構，是理想的靶分子。保守區核苷酸序列具有高度保守性，存在于所有細菌中，不同科、種、屬間細菌16S rRNA基因同源性達97%以上；可變區存在9個變異區（V1～V9），不同科、種、屬間都具有一定的差異，這些差別構成了研究細菌群進化分類的依據，16S rRNA基因被認為是細菌分類和鑒定的金標準（gold standard）。目前，幾乎所有的已知細菌的16S rRNA基因的堿基序列都已被測定并保存于基因庫中。由于RNA易于降解，因此多采用檢測16S rRNA所對應染色體上的DNA序列（16SrDNA）。16S rRNA可直接從DNA中轉錄直接測序，因此通過設計針對不同科、種、屬的16S rRNA 的特異引物進行PCR擴增，綜合多種分子生物學的分析方法，可以實現對腸道菌群中某些細菌甚至整個微生態系統的動力學變化進行監測，揭示腸道微生物系統種群的多樣性、數量和動力學，能對這個復雜的微生態系統進行更加全面的分析，這些技術擴展了我們對那些已證實難以培養但對胃腸道生理學有重要意義的微生物的認識。

聚合酶鏈式反應技術（polymerase chain reaction，PCR）即聚合酶鏈式反應，是1985年由美國化學家Kary Mullis發明的，因此他獲得了1993年諾貝爾化學獎。PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性（denaturation）：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）（annealling）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸（extension）：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。以上述三個步驟為一個循環，每一循環的產物均可作為下一個循環的模板，經過n次循環后，目的DNA以2 ⁿ的形式增加。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參加PCR反應的物質主要有五種，即模板DNA （Template）、引物（Primers）、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）、Taq DNA聚合酶（Taq polymearse）和含有Mg ²⁺的反應緩沖液。其中引物是PCR特異性反應的關鍵，所謂引物就是與待擴增DNA片段兩翼互補的寡聚核苷酸，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制，模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環節之一。

PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA，具有特異性強，靈敏度高，簡便、快速，對標本的純度要求低等特點。已經廣泛用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等許多方面，也廣泛地應用于臨床診斷。以PCR技術為基礎針對16S rRNA基因的檢測已經被用于糞便中各種細菌的檢測和研究。

基因指紋圖譜是用PCR擴增環境微生物樣品總DNA的標記序列，然后用合適的電泳技術將其分離而成的具有特定條帶特征的圖譜?；蛑讣y模式的不同反映種群結構的不同。按分離依據不同，基因指紋圖譜可分為變性梯度凝膠電泳圖譜和DNA長度多態性分析圖譜。

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術是由Fischer于1979年提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術。1993年，國外學者Muyzer等將DGGE技術應用于微生物生態學研究，證實了該技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優越性。DGGE通過核酸信息對微生物群落進行表征，較傳統的菌種分離培養技術更快捷并能鑒定出不可培養細菌，是研究腸道菌群的最普遍的指紋方法。其原理是從胃腸道標本中提取總DNA，在引物的5′端加入30～50bp的GC片段（GC-clamp），對16S rRNA基因進行PCR反應，把帶有較高解鏈溫度GC片段的擴增產物放到有梯度的尿素和甲酰胺作為變性劑的聚丙烯凝膠中進行電泳，部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低，而且序列不同的DNA分子的解鏈速度和程度不同，它們在凝膠的不同位置停止遷移，從而使不同序列的DNA分子分開，產生細菌群體的圖譜，理論情況上，在恰當的條件下，只要有一個堿基對的差異即可將細菌群體相互分開。Jens W等用PCR-DGGE法分析人類糞便中的乳酸菌（ Lactobacillus）、微球菌（ Pediococcus）、明串珠菌（ Leuconostoc）以及魏斯菌（ Wessella），實驗表明，lac1、lac2 GC這對引物可以很好地分離不同的DNA片段，該法提供了檢測腸道微生物菌群狀態以及演替的簡便、快捷又可靠的方法。但Vallaeys等發現，DGGE并不能對樣品中所有DNA片段進行分離，只能對微生物群落中數量超過1%的優勢種群進行分析，但是通過使用屬或種的特殊引物可檢測到胃腸中數目較少的菌屬，比如雙歧桿菌，尤其是乳酸桿菌的敏感性。因此該方法有可能用于測定攝入的益生元和益生劑，如雙歧桿菌等原籍菌以及測定益生菌菌種自身，有報道顯示，DGGE圖譜顯示同時攝入益生元和益生劑（合生元）并不能增加益生菌在受測個體胃腸中的定植。

溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是利用不同構象的DNA分子具有不同的變性溫度（Tm）來進行分離。與DGGE不同的是凝膠中所采用的是溫度梯度以及在引物的5′端加入30～50bp的GC片段。16S rRNA基因進行PCR后擴增產物帶有較高解鏈溫度GC片段，在不同溫度梯度的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，由于序列不同的DNA分子的解鏈速度和程度不同，它們在凝膠的不同位置停止遷移，從而使不同序列的DNA分子分開并留下指紋印跡。LIONETT等運用該技術對兒童克羅恩病患者的腸道營養和微生物群落進行了研究。

限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是利用特定的限制性內切酶切割擴增產物，再將產生的長短、種類、數目不同的限制性片段，用瓊脂糖凝膠電泳分開它們，從而生成一特征性的限制性片段長度多態性。由某一限制性內切酶產生的片段大小和數目在不同個體中即表現出差異，對每一個DNA限制性內切酶組合來說，所產生的片段都是特異性的，該方法適合于復雜菌群的研究，是一種快捷且具有可重復性的方法，可以被用于跟蹤復雜菌群如腸道中特定細菌的動力學變化。末段限制性長度多態性（termina1-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）與16SrDNA相結合進行分析的方法已經廣泛應用于糞便菌群的分析。柳欣源等收集18名成年志愿者新鮮糞便采用T-RFLP技術特異性地分析柔嫩梭菌類群的組成，其結果與DGGE的分析結果具有較好的一致性，而且顯示T-RFLP方法重復性高，最低能檢測到群落中1%的細菌，能夠對大量腸道樣品中柔嫩梭菌類群的結構進行快速、有效的篩查和比較。Leser等采用T-RFLP的方法對飼喂不同日糧的生長豬的腸道菌群進行指紋分析發現，給豬飼喂標準日糧或補充高纖維的日糧，2周后不同處理的豬結腸中菌群的結構不同。同時這項技術還用于鑒定人類糞便中的雙歧桿菌以及益生菌乳酸菌種的示蹤觀察與抗生素介導的腸道菌群的變化。

隨機擴增多態性技術（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是通過隨機設計的短的引物來隨機擴增基因組DNA片段，由于非特異的引物可以結合在模板DNA的多個位點，產生多個PCR產物，經電泳分離開和溴化乙錠染色，即可直接檢測DNA多態性，用于DNA指紋分析。一些研究中認為RAPD適合于作為篩查工具，而RFLP適合于確診方法。

擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一種新的指紋圖譜技術。AFLP是利用PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態性可做為一種分子標記。

16S rRNA靶寡核苷酸探針雜交已成為對天然樣品中個體細胞鑒定非培養的直接方法，該項技術提高了人們對復雜的微生態系統細菌匯編程序和菌群的動力學的認識。16S rRNA分子具有遺傳穩定性，由保守區和可變區組成，其高保守區域可用于設計特異性區域探針，比如EUB338/EUBⅡ/EUBⅢ可以用于絕大多數細菌，最常用于雜交技術的生物標記物，而針對每個分類學的特定探針，在細菌和原核生物之間，以至屬特異性和種特異性，均可按照16S rRNA高度可變區進行設計，隨著16S rRNA序列的可用性增加，其非常有助于雜合方法的發展和其在不同微生態系統中的應用。

斑點雜交（dot-blot hybridization）是檢測未經分離核酸樣品中特異DNA序列的簡便方法。目的DNA通過加熱和堿變性后將其水溶液（如基因組DNA和總RNA）直接點樣于硝酸纖維膜或尼龍膜上，使之干燥。然后與含有單鏈標記探針的雜交液雜交適當的時間，洗去游離探針后，放射自顯影。若檢測其放射強度，則可定量檢測標本中目的DNA的量。在一項細菌RNA的研究中，應用分離的糞便RNA標本，與兩張尼龍膜上一系列的放射性標記的寡核苷酸探針的混合物進行雜交（每一個探針代表一個特殊的菌群）?？偟臉吮镜腞NA的量用能雜交到大多數細菌的保守rRNA序列的通用探針作為參考，與其他探針的雜交結果相比較，這個方法提供了一個計算不同細菌占所有細菌中的比例的一個方法。

熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是將帶有熒光標記的寡核苷酸探針直接與固定在載玻片上的經過處理后的細胞進行雜交，固定過程中要使短的探針滲透到細胞內的核酸，用熒光顯微鏡即可觀察到帶有雜交熒光標記探針的細胞，熒光原位雜交為研究腸道菌群的組成提供了新的更為方便的方法。Franks等設計了6種針對人的糞便中主要幾種細菌的16S rRNA的寡核苷酸探針，采用FISH方法定量檢測了幾種細菌的數量。該方法優點是在保持組織結構和細胞的原貌情況下能特異性顯示檢測目標與組織細胞的結構關系，為研究腸道細菌之間、腸道細菌與腸道組織的結構功能提供了途徑。FISH在應用中也存在一些問題，探針對于不同類型細胞壁的穿透能力不同，可能會對革蘭陽性細菌的檢測出現低估，并且探針結合目標位點的特異性依賴于雜交和洗滌的條件。

DNA芯片（DNA microarray，DNA chips）技術為檢測和評價復雜微生態系統中微生物的多樣性提供了快速、高效的方法，其原理是基于分子雜交技術，從樣品中分離出總DNA或rRNA，粉碎后采用PCR方法與已經標記的核苷酸同時進行擴增或直接進行化學標記，標記的片段與固定于表面的探針進行雜交，雜交片段經洗膜后進行熒光標記。將芯片技術應用到人腸道菌群的研究正在進行中。徐曉靜等利用16S rRNA的保守區和可變區設計制備的基因芯片在4小時內就能完成沙門菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬和耶爾森菌共4個菌屬的23株腸道菌及相關細菌的雜交檢測，每種細菌均呈現出具有各自特征的雜交結果，而且無其他探針產生陽性信號。

競爭性PCR（competive PCR）的原理是通過在模板中加入一種特殊的已知濃度的模板一起進行PCR擴增，根據兩者擴增產物的長度不同利用瓊脂糖電泳檢測灰度，從而達到定量的目的。Pintado等發現，將競爭性PCR與DNA指紋技術（DGGE）結合也可用于菌群定量分析，這種技術的優點是待測模板與競爭性模板的PCR擴增產物可以有相同的長度，而且可以在菌株水平上定量。

熒光定量PCR（FQ-PCR）是美國于1996年推出的一種新的核酸定量技術。它可以在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增產物量的變化，再通過最后得到的ct值和建立的標準曲線，對起始模板進行定量分析。目前最常用的方法是SYBR Green熒光染料和Taqman熒光探針兩種方法。FQ-PCR技術融合了PCR技術和DNA探針雜交技術的優點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化使PCR的擴增及其分析過程均在同一封閉系統下完成，并在電腦分析軟件支持下實現對PCR擴增產物的動態監測和自動定量，具有良好的靈敏性、特異性、精確性和重復性，且降低了標本和產物的污染，無復雜的產物后續處理過程，高效、快速等優點。Malinen E對SYBR Green熒光染料和Taqman熒光探針兩種方法在靈敏性方面進行比較，并沒有發現明顯差異，在特異性方面Taqman熒光探針因為具有特異性引物和特異性探針，表現出了更高的特異性。另外Taqman探針結合不同的熒光基團，用于一個反應體系的多重檢測，也表現了較高的特異性，且步驟簡潔、高效，可以用于大規模樣本的研究。

國內楊美芬等應用SYBR Green熒光染料方法對輪狀病毒性腸炎患兒腸道的雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸埃希菌進行了定量分析，并和同年齡同性別的正常兒童菌群進行比較，其結果和其他文獻報道的用培養的方法得到的結果接近。馬卓婭等通過設計大腸埃希菌和雙歧桿菌特異性Taqman探針，利用FQ-PCR方法比較濕疹患兒與正常兒童糞便中腸道菌群雙歧桿菌和大腸埃希菌的差別，結果顯示濕疹患兒糞便中雙歧桿菌的含量明顯少于正常兒童，而大腸埃希菌較正常兒童增多。

克隆文庫分析法是PCR擴增環境微生物樣本DNA的帶有進化信息（或其他標記基因）的片段，將這些片段克隆進合適的載體，構建克隆文庫以分離不同的序列，然后對分離的序列采用測序技術或PCR/RFLP進行定性分析。對于測得的序列，可以通過與GeneBank數據庫中已有數據的對比鑒定其分類地位，許多序列可以鑒定到種的水平。通過分析rRNA片段的類型和出現頻率，可以得到微生物群落結構和多樣性的信息?？寺∥膸旆治龇ㄖ挥性诜治龅目寺的孔銐蚨嗟那闆r下，才可以比較完整地認識種群組成的情況，并且PCR和克隆策略引入的誤差會對克隆出的rDNA序列及其鑒定產生重要影響，因此，種群多樣性從總體上講并不真實。另外，克隆文庫分析法成本高，工作量大，分析時間長，不適合對微生物群落結構變化進行動態跟蹤研究。

總之，應用16S rRNA作為研究對象，采用以PCR為基礎的多種分子生物學分析手段的聯合應用，可以快速、微量、準確地對腸道微生物進行檢測，不僅可以對腸道細菌組成及數量進行測定，還能對細菌的活性進行分析。目前雖然由于受條件限制這些技術尚未廣泛常規開展應用于臨床，相信隨著時間推移，這些檢測分析技術將很快開展并服務于臨床工作?；跈z測細菌16S rDNA基因的分子生物學技術見表4-1。選用何種方法取決于研究的目的，PCR-DGGE/PCR-TGGE以及T-RFLP等指紋圖譜技術可以最大限度顯示復雜菌群的概貌，主要用于菌群結構的動態變化研究，但通常不能定量；而FISH和定量PCR能夠對一種或幾種細菌進行定量，但受到檢測數量的限制，不同的菌種具有不同的16S rDNA基因；并且上述基于PCR的技術均存在分辨率低的缺點，因為PCR僅能夠對菌群中含量高的細菌進行擴增；基因芯片技術能夠檢測各種細菌的標記基因，但只能夠檢測已知的參考序列。值得注意的是所有基于PCR的研究技術，由于引物的特異性和反應條件的差別，均存在PCR偏倚。