17世紀下半葉，荷蘭人安東·列文虎克（Antony van Leeuwenhoek）于1676年最先制作了能放大200～300倍的顯微鏡，觀察了齒垢、污水、人和動物的糞便，發現了許多肉眼看不見的微小生物，第一個描述了細菌的主要形態：球形、桿形和螺旋形，開創了微生物學的形態學時期。19世紀初期，法國微生物學家、化學家，路易·巴斯德（Louis Pasteur）發現了發酵與腐敗都是由于微生物的作用引起的，為了防止酒類的變質，創造了加溫處理的巴斯德消毒法，最早證實了細菌的存在。19世紀后期，德國醫師兼微生物學家羅伯特科赫（Robert Koch）發明了固體培養基（土豆、明膠），創造了細菌分離和純培養技術，至此進入了微生物分離培養的黃金時代，在短期內人類陸續發現了許多傳染病的病原體，并且提出了判斷疾病病原體的依據——科赫法則，科赫被視為細菌學之父。

與對致病菌的研究一樣，涂片染色及細菌純培養技術對正常菌群的認識和發展，微生態制劑的研制和臨床應用起到了決定性的作用。傳統對正常菌群的多樣性及群落結構的分析大多是將細菌進行分離培養計數，然后通過一般生物化學性狀或特定表型來分析，如果選擇的選擇性培養基的特異性強，可以將腸道菌群定位到種的水平，并可以對其菌落計數。但由于厭氧菌是人體正常菌群的主要組成部分，目前所知腸道正常菌群中99.9%是厭氧菌，口腔和女性陰道中90%以上也是厭氧菌，因此在厭氧菌培養技術出現之前人們對正常菌群的認識存在著很大的局限性。

1950年美國微生物學家亨蓋特（Hungate）在進行瘤胃厭氧微生物研究時，首次發展出一種獨特的厭氧培養技術，即亨蓋特厭氧滾管技術。他利用可密封的試管（hungate tube），把試管以氮氣與二氧化碳充填，并把融化的洋菜培養基放入，趁著洋菜還沒固化，不停的轉動試管，使得培養基平鋪于管壁，如此厭氧微生物便能在無氧的環境生長。這項發明拓展了另一個微生物研究領域，即厭氧性細菌。

厭氧性細菌的生長依賴于一個無氧的環境，通過在培養基中加入還原劑，或用物理、化學方法去除環境中的游離氧，以降低氧化還原電勢，即可達到這一目的。目前培養厭氧微生物的技術包括：厭氧培養箱技術、厭氧罐培養技術、厭氧袋培養技術及亨蓋特厭氧滾管技術。

厭氧手套箱（anaerobie glove box）亦稱厭氧工作站，是迄今為止國際上公認的培養厭氧菌最佳儀器之一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個有機玻璃做的透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內進行操作，故命名為厭氧手套箱。厭氧手套箱由真空取樣室、恒溫厭氧操作室、氣路、電路控制系統等部分組成，取樣室用于操作室內外物品的傳遞，操作室用于厭氧分離和培養。其厭氧環境主要是依靠反復抽氣和換氣，使用氮氣和混合氣體（N ₂，H ₂，CO ₂）置換空氣而實現的，厭氧操作室內還有鈀粒除氧劑，可以進一步催化消除殘余氧，保持箱內厭氧狀態。該箱可調節溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其內，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細菌的大量培養研究，大量培養基可放入作預還原和厭氧性無菌試驗。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環境和溫度等均系自動調節。

厭氧手套箱的特點是全部操作過程（接種和培養）均在完全無氧的情況下進行，避免了其他方法在接種時厭氧菌暴露于空氣過久，致使部分厭氧菌的死亡。另外厭氧手套箱還具有厭氧環境好、密封性能好、溫控精度高，穩定性好、工作安全可靠等優點。

厭氧罐的厭氧原理與厭氧手套箱類似。使用時將欲培養的平皿或試管放入厭氧罐內，放入鈀粒催化劑和厭氧指示劑，進行3次抽氣和換氣，將整個厭氧罐放37℃孵育箱培養。

厭氧罐操作簡便、占用空間小、成本低，但不能提供操作全過程的厭氧環境，并且因容量的限制而無法實現靈活的厭氧培養操作，故其應用有一定的限制。

厭氧袋（Bio-bag）即在塑料袋內造成厭氧環境來培養厭氧菌。塑料袋透明而不透氣，內裝氣體發生管（碳酸氫鈉，硼氫化鈉以及5%檸檬酸溶液）、亞甲藍指示劑管、鈀催化劑管、干燥劑。其厭氧原理是化學除氧，硼氫化鈉和水反應生成氫氣，在鈀粒的作用下氫氣和氧氣反應生成水，從而除去氧氣，此外檸檬酸和碳酸氫鈉反應生成枸櫞酸鈉、二氧化碳和水，提供厭氧環境。使用時放入已接種好的平板后，盡量擠出袋內空氣，然后密封袋口。按說明書依次操作，達到厭氧狀態以后，放入37℃孵育箱培養。

厭氧袋無需連接氣瓶，加厭氧產氣袋即可，具有操作方便，節約空間，成本較低的優點，但可處理樣品量較小。

滾管技術是Hungate教授于1950年首創的，經歷了幾十年的不斷改進，該技術日趨完善，已經發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，經過多年來的實踐證明，它是研究專性厭氧菌的一種極為有效的技術。包括培養基預還原和在無氧環境中進行的菌株分離和培養操作技術。將盛有無氧無菌瓊脂培養基的試管加熱至100℃，使瓊脂熔化，并保溫在50℃左右的水浴中，備用。

滾管技術的主要原理是利用除氧銅柱來制備高純氮，并用高純氮驅除小環境中的空氣，使培養基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及菌種的接種、培養、觀察、分離、移種和保藏等過程始終處于高度無氧條件下，從而保證了嚴格厭氧菌的存活。用這種方法制備成的培養基稱為預還原無氧滅菌培養基（PRAS培養基，pre-reduced anaerobically sterilized medium）。在進行嚴格厭氧菌的分離時，可用Hungate的“無氧操作”把菌液稀釋，并接種到融化后的PRAS瓊脂培養基中，然后將此試管用丁基橡膠塞嚴密塞住后平放，置冰浴中均勻滾動，使含菌培養基布滿在試管的內表面上，凝固成一薄層。適溫培養后，在瓊脂層內或表面形成菌落。滾管技術的優點是：①試管口與空氣接觸面積小；②經滾動后，試管的內表面上有大面積的固體培養基可供長出單菌落。

滾管技術是現代研究厭氧菌最有效技術，但其操作繁雜。

涂片法是采取新鮮糞便厚涂片，革蘭（G）染色后在顯微鏡下計數細菌總數，計算G ⁺桿菌：G ^-桿菌：G ⁺球菌：G ^-球菌的比例，并且觀察各種細菌的形態學特征，來估計腸道菌群是否正常的方法。正常糞便中G ⁺桿菌（絕大多數為厭氧菌，主要為雙歧桿菌、擬桿菌、優桿菌等）占絕對優勢、其次是G ^-桿菌或球菌、有少量酵母樣真菌。涂片法的參考值為：G ⁺桿菌＞90%為正常型，G ⁺桿菌10%～90%為中間型，G ⁺桿菌＜10%為異常型。在重度菌群失調時，涂片法可以見到大量的酵母菌、葡萄球菌、梭菌等。

糞便標本涂片法具有直接、簡便、快速的優點，是目前臨床廣泛應用的方法，但該方法比較粗糙，結果判斷需要一定的經驗，常用于篩查。認真規范的細菌涂片報告會給臨床帶來有價值的信息。細菌涂片是觀察菌群平衡的窗口。

糞便細菌定量培養法又稱為腸道菌群分析，具體過程為：收集新鮮糞便標本，定量稀釋后接種于各種細菌的選擇性培養基，進行厭氧和需氧細菌培養24～72小時，然后通過菌落形態和涂片革蘭染色鑒定（必要時進行生化鑒定），最終計算出每克糞便中含有多少個某種細菌的菌落形成單位（colony forming units，cfu）。通過比較各種細菌的cfu，可以精確的得出糞便中各種細菌的數量和比例。在所檢測的細菌中，可以選擇厭氧菌中的雙歧桿菌、擬桿菌、優桿菌、消化性球菌、乳桿菌及梭菌和需氧菌中的腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌和酵母菌等。正常參考值為：雙歧桿菌：10 ⁷～10 ¹⁰cfu/g，擬桿菌：10 ⁸～10 ¹¹cfu/g，優桿菌：10 ⁷～10 ¹⁰cfu/g，消化性球菌：10 ⁷～10 ⁹cfu/g，乳桿菌：10 ⁵～10 ⁸cfu/g，梭菌；10 ⁴～10 ⁶cfu/g，腸桿菌：10 ⁵～10 ⁸cfu/g，腸球菌：10 ⁴～10 ⁷cfu/g，葡萄球菌：10 ³～10 ⁷cfu/g，酵母菌：10 ²～10 ⁴cfu/g。在臨床上，為了簡便，有時僅計算雙歧桿菌/腸桿菌（B/E）值，來評估腸道菌群的狀況，B/E＞1表示正常，B/E＜1表示菌群失調，B/E值越低，提示菌群失調越嚴重。

腸道菌群分析是經典的腸道菌群檢測方法，但操作復雜、成本較高，所需時間較長，在臨床上沒有廣泛應用。目前多用于研究和作為評價其他檢測方法時的標準。另外腸道菌群分析法不能分離培養標本中不可培養的細菌，而目前認為糞便標本中可培養細菌僅占到細菌總數的30%～40%。

鑒于涂片法觀察結果不準確，定量培養法操作復雜、成本較高，需要時間長的問題，應用分子生物學技術檢測標本中菌群變化是具有廣闊前景的方法。目前應用于檢測正常菌群的分子生物學技術有細菌16S rDNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳，生物芯片技術、熒光原位雜交等，但是這些方法存在對技術要求高，費用高的缺點，在一定程度上限制了在臨床上應用，而聚合酶鏈式反應技術（PCR）及定量PCR技術具有敏感、準確、安全、快速的特點，已經廣泛用于臨床病原學診斷。但特別值得注意的是在建立分子生物學技術檢測腸道菌群時，除要求具有高敏感性和特異性以外，還需要滿足多重檢測和定量檢測的特點，這樣才能夠反映腸道菌群中各種細菌的種類及數量上的改變，這一點與一般的分子診斷技術不同。目前從對技術的要求和臨床適用性出發，只有熒光定量PCR可能成為臨床常規檢測技術。

實時熒光定量PCR（rea1-time fluorescent quantitative-PCR，FQ-PCR）是美國于1996年推出的一種新的核酸定量技術。它可以在PCR反應體系中加入熒光基團，最常用的是SYBR Green熒光染料和Taqman熒光探針兩種。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增產物量的變化，在通過最后得到的ct值和建立的標準曲線，對起始模板進行定量分析。FQPCR具有良好的靈敏性、特異性、精確性和重復性，且降低了標本和產物的污染，無復雜的產物后續處理過程，高效、快速等優點。關于擴增靶基因的設計，目前可以采用細菌16S rRNA或某種細菌的特異性核酸片段，因細菌16S rDNA具有在細胞中相對穩定，分子大小適中，具有保守區和可變區交錯排列的獨特結構，是目前理想的靶分子。在實時熒光定量PCR實驗過程中，反應條件的選擇和優化對于反應的成功與否非常關鍵，對于在反應過程中所需要的各種條件如引物、Mg ²⁺的濃度、Taq酶、SYBR Green及模板等物質的量和濃度都需要不斷摸索，找出最佳的條件，尤其是引物二聚體和產物的解鏈溫度（TM）值需要反復的實驗，才能在以后的PCR反應過程中消除引物二聚體所產生的熒光信號達到對產物的準確定量。