實驗六　使用圓二色光譜儀（CD）分析蛋白質溶液的二級結構

一、實驗原理

（一）圓二色性

手性物質對左右圓偏振光的吸收程度不同，出射時電場矢量的振幅不同。通過樣品后，再次合成的偏振光就不是圓偏振光，而是橢圓偏振光。圓二色性是研究分子立體結構和構象的有力手段。在一些物質的分子中，沒有任意次旋轉反映軸，不能與鏡像相互重疊，具有光學活性。電矢量相互垂直，振幅相等，位相相差1/4波長的左和右圓偏振光重疊而成的是平面圓偏振光。平面圓偏振光通過光學活性分子時，這些物質對左、右圓偏振光的吸收不相同，產生的吸收差值，就是該物質的圓二色性。圓二色性用摩爾吸收系數差ΔεM來度量，且有關系式：ΔεM=εL-εR。其中，εL和εR分別表示左和右偏振光的摩爾吸收系數。如果εL-εR＞0，則ΔεM為“+”，有正的圓二色性，相應于正Cotton效應；如果εL-εR＜0，則ΔεM為“-”，有負的圓二色性，相應于負Cotton效應。由于這種吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此圓偏振光通過介質后變成了橢圓偏振光。

圓二色性也可用橢圓度θ或摩爾橢圓度[θ]度量。[θ]和圓二色性用摩爾吸收系數差ΔεM之間的關系式[θ]=3300×ΔεM。圓二色光譜表示的[θ]或ΔεM與波長之間的關系，可用圓二色譜儀測定。若儀器測定的是橢圓度θ，則存在ΔεM=θ/（33c·l）的換算關系。其中，c表示物質在溶液中的濃度，單位為mol/L；l為光程長度（液池的長），單位為cm。

（二）圓二色光譜儀工作原理

圓二色光譜儀主要由光源、單色儀、起偏器、調制器、光探測器等單元組成。圓二色光譜儀一般采用氙燈作光源，調制器則受電壓信號控制，將平面偏振光調制成左、右圓偏振光。調制器輸出的光作為入射光照射在樣品上，如果樣品在此波長下有圓二色性，那么透射光的光強也隨著左、右旋圓偏振光的交替變化而變化。光電倍增管把光強轉換為電流，也將變化的光強信號轉換為交流信號。這個交流信號的強度就反映了樣品在這個波長下的圓二色性的數值大小，用θ表示，圓二色數值的單位是橢圓度。改變波長λ，測量不同波長處樣品的θ，就得到樣品的圓二色光譜。同時，測試時要通入氮氣趕走管路中的水蒸氣和光源產生的臭氧，防止臭氧腐蝕反射鏡（圖1-6-1）。

二、樣品準備

（一）溶液類樣品

把樣品加入分散性較好，并在測試波長范圍內沒有紫外吸收的溶劑中，加入一定光程的比色皿中，固定后置于樣品艙中等待測試。其中，需要注意溶劑和樣品濃度兩方面。

1.溶劑的選擇　在測試樣品時，首先要排除溶劑的紫外吸收對測試的影響，溶劑的最大吸收波長要小于物質的最大吸收波長。測試時一般選用高純水和光譜純的醇類溶劑。

2.確定溶液濃度的影響　一般吸收峰遵循朗伯·比爾定律：A=ε×l×c，其中ε為與波長有關的吸光系數，l為光程，c為樣品濃度。圓二色光譜測量的是兩種圓偏正光吸收的差值（Δε=εl-εd）（εl為左圓偏正吸收系數，εd為右圓偏正吸收系數）。雖然朗伯·比爾定律表明CD信號與濃度成正比，但并不是濃度越高，CD信號越好。因為Δε值非常小，濃度增加后可測光的強度則減少，此時吸光度的微小變化則被噪聲掩蓋，而且噪聲值隨光強而變，光強越小噪聲越大，出現逆濃度效應。所以樣品在測量CD以前一般先測量下UV/VIS吸收光譜，當樣品的UV/VIS吸收值在0.5～1.0時，會得到比較好的CD數據。當樣品的UV/VIS吸收值大于2.0時，將很難得到較好的CD信號。在波長確定的情況下，理想的濃度對應吸光度應在0.8左右。

（二）固體粉末類樣品

1.溶劑分散法　把樣品加入分散性較好，并在測試波長范圍內沒有紫外吸收的溶劑中，充分超聲分散后，放入測試槽，加入攪拌子，在攪拌分散狀態下測試。

2.壓片法　樣品與惰性介質（KBr或KCl）按一定的比例混合壓片，放入測試槽即可測試。

3.石蠟油混合法　樣品與適量的石蠟油混合研磨，均勻涂在石英片上。

4.成膜法　將樣品溶液滴加或旋涂在石英片上，待溶劑揮發成固體薄膜后檢測。在固體樣品的測試中，除單晶固體測試法外，其他幾種方法都需要找到合適的樣品與介質混合的比例。當比例太小時，CD信號有可能太弱；但比例過大時，吸收波長會紅移并會出現逆濃度效應，使CD信號失真。

（三）凝膠類樣品

有些高分子材料為凝膠狀，對于剛性較強的樣品只要涂在片狀比色槽里，即可測試。對于柔性高分子或超分子組裝體樣品可以加入比色皿中，把比色皿放入儀器，加熱到60℃，當樣品融為溶液狀態時，再調節到室溫待樣品自組裝成較均一的凝膠狀后進行測試。

三、實驗儀器簡介

本實驗采用的是日本JASCO公司J-815圓二色光譜儀（簡稱CD）。圖1-6-2為J-815儀器圖片及其光路圖，圖中，S1-S2：第一級單色器；S2-S3：第二級單色器；M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L：透鏡；F：濾光器。常見配件包括PTC-423S/15變溫、Stop-flow停留、熒光光譜配件等。

該儀器具有高的掃描速度、廣泛的波長領域，可以同時多通道測定。儀器有高亮度的點光源，色溫接近6000K。同時具有顯色指數＞95的高顯色性，能夠使儀器在整個壽命期內維持光色特性；儀器具有熱重啟能力，且啟動后即能達到接近最大光輸出；電弧光斑小、易聚光。

四、實驗操作步驟

（一）開機

打開N2，等待N2打開5min后，打開主機電源，確認聽見光柵移動的聲音后依次打開水循環、電源開關和計算機主機。

（二）聯機

雙擊桌面“Spectra Manager”圖標，進入操作界面。雙擊J-815目錄下“Spectra Manag-er”，等待聯機完成（圖1-6-3）。

（三）參數設置

點擊“Specta Measure”，進入General界面，點擊“Parameter Settings”，設置通道數、起始及結束波長、掃描方式、掃描速度、靈敏度、光譜帶寬并選擇控制器（圖1-6-4）。

1.通道選擇　J-815可以設置三個通道，包括CD信號、HV信號、Abs信號。

2.波長測量范圍選擇　J-815可測量的波長范圍為163～900nm。一般先測量待測樣品的紫外吸收光譜，圓二色光譜的波長檢測范圍一般可在有紫外吸收波段兩端再各加50～100nm。

3.數據采集時間間隔　在全譜掃描時，數據采集時間間隔通常選擇0.2nm；若掃描模式設置為[step]，數據采集時間間隔通常設置為1nm。

4.掃描速度　掃描速度一般隨響應時間改變而改變。通常，測量時將掃描速度設置在20～100nm/min，響應時間在0.25～2s。表1-6-1列舉了常見掃描速度與響應時間的對應關系。

表1-6-1　常見掃描速度與響應對應表

5.光譜帶寬　標準操作時，光譜帶寬選為1nm。當樣品的CD信號很小時，若想保持測試的CD信號，就需要足夠的樣品濃度及較寬的狹縫寬度。若采用高分辨率測量時則需要用較窄的狹縫寬度，但此時光電倍增管電壓較高，信噪比差。

（四）設置比色皿寬度

點擊“Cell Length”，填寫石英比色皿的寬度。高度均勻的熔融石英比色皿，不會帶來附加的圓二色性。為了降低溶劑對測試結果的影響，一般選用短光程、寬度為0.01～1cm的石英比色皿。

（五）基線校準

點擊軟件操作界面上“B”，將裝有待測樣品溶劑的比色皿放入儀器中，關好艙門，進行基線測試。

（六）樣品測試

基線校準完成后，將樣品裝入比色皿中，表面擦干后，打開機器艙門放入比色皿，蓋上艙門。點擊軟件操作界面上“S”，進行樣品測試。測試過程中，若HV信號值大于600 mV時，立即點擊“Stop”，暫停此次測試。取出樣品，重新調節樣品濃度及容量，重復上述步驟。測試完畢后，立即取出樣品，關好艙門，勿關氮氣（圖1-6-5）。

（七）數據傳輸

點擊“Measure”，進入Data界面，在Send to Analysis目錄下選擇“Send Data to Spectra Analysis”，完成測試后將數據自動發送到Spectra Analysis目錄，進行數據分析處理（圖1-6-6）。

（八）數據處理

單擊“Open”，打開剛剛測試完畢的圖譜，進行譜圖分析。依次單擊“Processing”“Smoothing”進行曲線平滑。依次單擊“Processing”“Peak Processing”“Peak Find”，進行主峰尋找（圖1-6-7）。

（九）數據保存

右擊J-815目錄下的該文件，Save As保存原始文件及.txt文本。格式化后的U盤進行數據拷貝。

（十）關機

依次關閉軟件、水循環、電源開關及J-815主機電源。通氮氣5min后再關閉氮氣。

五、實例分析

（一）研究物質的手性情況

圓二色光譜是與化合物的光學活性相關的光譜，可以提供許多分子的結構信息。一方面，利用圓二色光譜儀可以對手性分子的結構進行測定，根據CD信號值的不同可以判斷手性物質為左旋或右旋，區別異構體，也可以作為定性鑒定物質的依據；另一方面，樣品的吸光度則與濃度成正比，可作為定量分析的參考依據。圖1-6-8是不同構型的苯丙氨酸的CD光譜圖。從圖中可以看出，苯丙氨酸D型[圖1-6-8（a）]和L型[圖1-6-8（b）]的CD光譜圖有顯著區別，其中D型的CD值大于零，而L型的CD值小于零。利用CD圖譜，可以快速簡便地辨別苯丙氨酸的構型。

（二）鑒別物質種類

不同波長的CD譜能夠反映物質的不同結構信息。190～240nm波長范圍內，主要反映肽鏈的結構；240～330nm波長范圍內，能夠反映蛋白質芳香族及二硫鍵結構信息；330～750nm波長范圍內，主要表現出血紅素、輔基及金屬離子的情況，這一波段CD譜常用于研究金屬離子的氧化態、配位體以及鏈—鏈相互作用；而大于750nm波長的信號，主要是分子振動的信息。如圖1-6-9所示，色氨酸在290nm及305nm處有精細的特征CD峰，酪氨酸在275nm及282nm有CD峰，苯丙氨酸在255nm、260nm及270nm有弱尖銳的峰。利用CD特征吸收光譜，可以簡單便捷地對芳香氨基酸殘基中這幾種特征氨基酸進行區別。

（三）研究蛋白質的二級結構

近幾年來，圓二色光譜在蛋白質結構研究中的應用越來越廣泛。通過對遠紫外圓二色光譜的測量，可以推導出稀溶液中蛋白質的二級結構，進而分析和辨別蛋白質的三級結構類型；通過對近紫外圓二色光譜的測量和分析，可以推斷蛋白質分子中芳香氨基酸殘基和二硫鍵的微環境變化，研究介質與蛋白質結構間的關系；通過測定實驗參數和環境條件變化時的圓二色光譜，可以研究蛋白質構象變化過程中的熱力學和動力學特性。圖1-6-10為蛋白質二級結構CD特征吸收光譜。