實驗五　使用顯微拉曼光譜儀分析纖維分子結構

一、實驗原理

（一）拉曼光譜基本原理

具有一定波長的光照射到氣體、液體或透明晶體的樣品上，大部分按原來的方向透射而過，小部分按照不同的角度散射開來，這種現象稱為光的散射。散射是光子與物質分子相互碰撞的結果，由于碰撞方式不同，光子和分子之間會有多種散射形式。

若光子和分子之間在碰撞時發生能量交換，不僅使光子改變了其運動方向，也改變了其能量，使散射光頻率與入射光頻率不同，這種散射稱為非彈性散射，也叫拉曼散射，強度很弱，大約只有入射光的百萬分之一。

許多物質經光照后會產生熒光，熒光和拉曼散射是有區別的。從圖1-5-1的能級示意圖上來看，處于基態的電子經光照后躍遷到激發態，然后從激發態落到最低激發態，再進一步回落到基態，這個過程所釋放出來的能量就叫作熒光。拉曼散射則不同，它是電子基態受激躍遷到一個虛態（并不是實際的電子激發態），然后回落到電子基態，整個過程所釋放出來的能量叫作拉曼散射。拉曼散射包括斯托克斯散射和反斯托克斯散射。散射光頻率小于入射光頻率的散射被稱為斯托克斯散射；而散射光頻率大于入射光頻率的散射則被稱為反斯托克斯散射。拉曼散射中大部分研究的是斯托克斯散射，即激發波長比發射波長短。由于熒光之間的能級差是固定的，在實際測試過程中，可通過改變激發波長來確定是拉曼散射還是熒光。不管用哪個激發波長去激發樣品，如果樣品能發射熒光，熒光的波長不會改變；但如果是拉曼散射，波長會發生改變。

拉曼光譜表征的是物質的本質特征，也就是表征化學鍵之間的結構，所以不同物質之間即使只有很微小的差別，拉曼的譜峰都會有非常明顯的變化。以同素異構體為例，雖然元素相同，但結構不同，拉曼譜峰就明顯不同。對于普通的物質，如果受到擠壓，它的拉曼譜峰會發生位移，這是由于物質本身的結構受到應力作用而產生變化。拉曼光譜的譜峰中有半寬高這個參數，不同物質具有不同的結構，所測得的拉曼譜峰的半寬高有的偏窄有的偏寬，這個寬窄表征的是物質的結晶度，半寬高越窄，結晶度越高。此外，拉曼光譜中還包含一個重要的信息——譜峰強度。某一樣品若包含幾種不同的物質，則可通過譜峰強度對其進行定量分析。拉曼光譜還可以對樣品進行成像分析，在樣品的某個區域內做成像，用不同的顏色來表示不同的物質，反映物質的分布情況。

（二）顯微拉曼光譜儀工作原理

圖1-5-2給出了顯微拉曼光譜儀的整體構造。激光器發射出激光線，但其本身不是很純，激光線中含有一些雜線，因此需要加設一個干涉濾光片來過濾雜線，起到純化激光線的作用。純化后的激光線經過功率衰減片，其作用是調節激光強度至合適的功率，以免太強功率的激光把樣品燒壞，影響測試。衰減后的激光經過兩個反射器，激光光路發生改變，打到瑞利濾光片上。普通濾光片是讓光路緩慢上升，而瑞利濾光片可以讓光路以非常陡的坡度上升。瑞利濾光片不會讓激光透過去，而是將其反射出來打到樣品上。樣品放置于顯微鏡下方，通過顯微鏡對焦，可以確定所需測試的樣品位置。激光打到樣品上，樣品發出拉曼信號，瑞利濾光片會讓拉曼信號通過，再經過一個反射器改變拉曼信號方向，使其通過共聚焦針孔。共聚焦針孔的大小決定了樣品上收集信號的區域。狹縫的作用是抑制雜散光，拉曼信號通過狹縫后到達光柵上進行分光。最后拉曼譜圖呈現在CCD（Charge-coupled Device，電荷耦合元件）上。

二、樣品準備

顯微拉曼光譜儀對樣品的形狀、狀態沒有特殊要求，因此制樣比較簡單。由于玻璃不會吸收拉曼散射光，因此可以將試樣放置在各種玻璃制成的樣品池中進行拉曼光譜測試。

1.固體　固體樣品，不管是粉末狀、片狀、纖維狀，或者其他不規則形狀，都可直接用雙面膠固定在載玻片上。特別說明一點，粉末狀樣品考慮到顆粒間空氣的信號可能會呈現在樣品中，建議壓片后固定到載玻片上，這樣也能防止粉末污染物鏡鏡頭和其他樣品。

2.液體　液體樣品的制備相對復雜一點。對于有毒、易揮發的液體，為了保護物鏡鏡頭，最好封裝在毛細管或者比色皿中；其他的液體可以滴到金屬表面，也可以放置于石英比色皿、96孔板或液體樣品池。

3.氣體　氣體樣品最好能壓縮后封裝在密閉的樣品池中，因為氣體分子太疏松，不易被激光打到，產生的拉曼信號也相對較弱，檢測起來較為困難。

三、實驗儀器簡介

本實驗使用的儀器為日本HORIBA的顯微拉曼光譜儀，如圖1-5-3所示。該儀器主要由激光器、干涉濾光片、功率衰減片、反射器、顯微鏡、樣品臺、瑞利濾光片、共聚焦針孔、狹縫、光柵和CCD組成。

本臺拉曼光譜儀配備了3個激光器，分別是532nm、638nm、785nm。激光器和干涉濾光片是配套的，每個激光器都有它固定的干涉濾光片。顯微鏡配備了3個物鏡，分別是10倍的物鏡、50倍的長焦和100倍的物鏡。共焦針孔和狹縫均設定了3個可選值，共焦針孔大小分別為100μm、300μm和500μm；狹縫大小分別可選50μm、100μm和200μm。本儀器還有4個光柵可選，分別為600gr/mm、1200gr/mm、1800gr/mm和2400gr/mm。

四、實驗操作步驟

（一）光譜校準

由于拉曼光譜儀的光路十分精細，也很容易受到環境溫濕度、測試操作等的影響，每天首次測試前必須先對光柵進行校準。硅片的拉曼譜峰只有一個，并且譜峰強度很高，因此選為校準光柵的標準品。

1.制樣　將硅片用雙面膠粘到載玻片上，放置于樣品臺上，并用樣品夾固定。

2.對焦　雙擊打開計算機桌面上的軟件LabSptc6，選擇Viewing模式，此時軟件上顯示顯微鏡下的樣品圖片（圖1-5-4）。選擇10倍的物鏡，粗略對焦；切換到50倍場焦，并對焦至圖像清晰。顯微鏡下的圖像可在右側Display選項卡中按需設置圖像的顯示屬性。確定好測定位置后點擊軟件右上方紅色的“Stop”按鈕，切換到Raman測試模式。Viewing模式和Raman模式的相互切換在儀器上會有相應指示。

3.參數設置　Raman模式下進行參數設置，設置界面見圖1-5-5。在右側的選項卡中選擇Acquisition，該選項卡下主要設定文件名稱、光譜采集模式、采集時間、采集次數等。采集模式有單窗口模式（Spectro）和譜段模式（Range）兩種，單窗口模式中輸入譜峰的位置，呈現出來的譜圖是以輸入的譜峰為中心位置的；譜段模式則是輸入譜峰起始位置和終止位置，可以輸入多個譜段，最后都會呈現在譜圖上，譜段模式的總范圍是50～4000cm-1。硅片只在520.7cm-1的位置出現很強的譜峰，因此選擇單窗口模式，直接在Spectro后的文本框中輸入520.7。采集時間分兩種，單次采集時間Acq.time（s）和實時采集時間RTD time（s），其中實時采集只對單窗口模式有效。光柵校準選用實時采集，因此在RTD time（s）文本框中輸入1。采集次數Accumulation文本框中輸入1；物鏡Objective的選擇根據實際使用的物鏡來選擇，此處對應選擇“×50LWD”；選擇功率衰減Filter，硅片通常選擇25%；激光器Laser選用532nm；共焦針孔Hole選擇100μm；狹縫Slit選擇100μm。光柵Grating，一共有4個，600gr/mm、1200gr/mm、1800gr/mm和2400gr/mm，每一個都要進行校準，先選定600gr/mm。

4.校準　全部參數設定好之后，點擊軟件上方的三角形按鈕，即為實時采集。此時頁面上顯示硅片的拉曼譜圖，實時采集時間為1s，因此每隔1s就會采集一次。在軟件左側一列中選擇單線光標，硅峰的理論位置在520.7cm-1，將單線光標移動到520.7。然后在軟件右上方選項卡中選擇“Maintenance”，然后調節左右按鈕移動峰的位置，使得單線位置在峰的中間，即完成了該光柵的校準。點擊“Stop”按鈕停止實時采集，切換到下一個光柵1200gr/mm。其他參數按照之前設定的不需改變，再點擊實時采集，同樣的方式校準光柵。再依次校準光柵1800gr/mm和2400gr/mm即可。

（二）樣品測試

1.制樣　固體樣品用雙面膠固定在載玻片上；液體樣品用樣品池或毛細管封裝后固定在載玻片上；氣體樣品建議濃縮后再封裝在氣體樣品池，并固定在樣品臺上。

2.對焦　雙擊打開計算機桌面上的軟件LabSptc6，選擇Viewing模式，此時軟件上顯示顯微鏡下的樣品圖片。固體樣品對焦步驟如下：選擇10倍的物鏡，粗略對焦；切換到50倍場焦，并對焦至圖像清晰，在軟件右上方點擊紅色的“Stop”按鈕，切換到Raman測試模式。Viewing模式和Raman模式的相互切換在儀器上會有相應指示。液體樣品和氣體樣品在顯微鏡下難以聚焦，需采用激光聚焦。打開激光器，激光打到樣品上，旋轉調焦旋鈕至樣品上的激光光斑最小，此時即為對焦清晰，關閉激光器，切換到Raman測試模式。

3.參數設置　設置過程與硅片校準光柵時參數的設置過程相似，只需稍作改變。例如，樣品的測試模式較多選擇譜段模式，可以在Range文本框中輸入起始和終止位置，并選中后方的正方形圖標，顯示綠色即表示選中譜段模式。在Acq.time（s）文本框中輸入采集時間，采集時間越長，信號越強，但要保證激光不會打壞樣品，因此每次測試結束后應返回到Vie-wing模式下觀察樣品是否受損。采集次數根據實際情況作出改變，次數越多，信號越強，但采集時間相應增加。功率衰減的選擇，在未知的情況下從小到大選擇，在保證激光不打壞樣品的情況下可選擇較高功率，信號相應較強。激光器根據需要選擇532nm、638nm或785nm；共焦針孔常選擇100μm；狹縫常選擇100μm；光柵常選擇1200gr/mm。這些參數都可根據樣品的實際情況作出調整。

4.測試　設定好參數后點擊軟件上方的圓形按鈕，即為單次采集按鈕，采集完成后頁面上呈現拉曼譜圖。一般情況下需要進行多次調試才能確定最佳測試條件，確定好最佳測試條件后點擊單次采集，得到的譜圖可進行下一步的數據處理和保存。

（三）數據處理

測試得到的樣品的拉曼譜圖通常需要做一定的處理。這里主要介紹扣背底和標峰位兩種常用的譜圖處理方式。扣背底包括背底擬合法和手動添加背底線法。

1.扣背底方式

（1）背底擬合法步驟。打開一條測試譜圖（圖1-5-6），點擊軟件右側“Processing”選項卡，選擇基線校準Baseline correction。基線校準中需要設定一些參數，背底線類型Type包括Line（線性，適合背底較平的譜圖）和Poly（多項式，適合背底是曲線的譜圖），根據譜圖背底的實際情況選擇，多項式較為常用；階次Degree，可以直接輸入階次數，也可以拖動滑條改變階次；擬合最大點數Max points，同樣可以直接輸入點數，也可以拖動滑條改變點數；噪聲點數Noise points，當譜線噪聲較大時選用較多的噪聲點數，運用此項時必須先激活Correct noise，點擊該選項前的正方形圖標，顯示綠色即已激活。點擊“Fit”進行擬合，可以嘗試選擇不同的參數再點擊“Fit”，多次重復后找到合適的背底線，圖1-5-6中箭頭標注的曲線即為擬合的背底線。點擊“Sub”扣除背底，獲得基線平整的譜圖。

（2）手動添加背底線。可以直接選用來獲得背底線，也可在背底擬合效果不佳時手動添加背底點來優化背底線。

手動添加背底線步驟：在左側一列圖標工具欄中單擊“Add/remove baseline points”圖標添加背底線。手動添加背底線時背底線的形狀會受到Baseline correction下參數的影響，如果不希望受到這些干擾，可以選擇“Line”，并將Degree設為0。在使用手動方法時，一般會勾選“Attach to curve”選項，如果不勾選該選項，則鼠標點擊哪里，點就會出現在哪里；而勾選該選項時，添加的點會自動挪到譜線上。如果添加的點不合適，可點擊“Remove baseline”清除背底線；如果只想取消其中某個點，可以把鼠標放到該點上，在彈出的窗口中選中“Re-move”移除該點，或選擇“Remove all”移除所有點。添加完畢后，點擊“Sub”扣除背底。

2.標峰位方式　標峰位包括自動標峰位及手動標峰位，兩種方法可任選其一或綜合使用。

（1）自動標峰位步驟。打開一條需要標峰位的光譜（圖1-5-7），點擊軟件右側“Anal-ysis”選項卡，選擇標峰Peaks，點擊尋找Find，譜圖上會出現峰值的標注，改變其中一些參數可以調節所需要標注的峰值。Ampl（%）：強度閾值，在文本框中輸入數值0～100，則小于最大強度的（0～100）%的峰將不會被標出。Size（pix）：間隔閾值，若文本框中輸入數值10，則當兩個峰之間的間隔小于10個像素時，該峰將不會被標出。這兩個參數均可直接在文本框里輸入數值，也可拖動滑條改變強度閾值和間隔閾值，調整所要標的峰位，完成標峰。圖1-5-7中箭頭標注的曲線是標峰擬合后的曲線。

（2）手動標峰。手動標峰可直接使用來標記某些特定的峰，也可以在自動標峰位無法獲得一些需要標記的峰位時，通過手動方法來實現。

手動標峰位步驟：在左側一列圖標工具欄中單擊“Add/remove/edit peaks”圖標，將鼠標移到需要標記的峰位上，點擊鼠標左鍵添加峰位。若點擊的地方不是很準確，可通過微調來移動峰位，方法是將鼠標移到待修改峰位的標記上停留，使鼠標變成十字，然后移動鼠標使峰位標記在正確的位置。如果想要去除某個標記的峰位，則將鼠標移到該標記上，點擊右鍵，選擇“Remove”即可；如果要取消所有標記，則選擇“Remove All”。

（四）數據保存

處理完的譜圖保存，可以點擊軟件上方的保存按鈕，其中有兩種保存方式。一種是Save to group file，就是將所有測試的譜圖都打包保存到一個文件中；另外一種是單個譜圖保存，在右側選中一個譜圖點擊保存即可。保存的格式選擇.txt，后期可用其他畫圖軟件畫出譜圖。

五、實例分析

選擇某一由未知纖維組成的織物為測試對象。

將織物剪至合適的尺寸并用雙面膠固定在載玻片上，放置于載物臺上。物鏡放大倍數先選擇10倍進行粗略對焦，再選擇50倍的場焦進行精確對焦，選擇合適的測試點。

測量范圍先選定500～2500cm-1，在調試階段測量范圍不宜選擇過寬，否則譜圖無法一次呈現在CCD上，需要2次才能完整呈現譜圖，會導致測試時間加倍。可在確定好采集時間、采集次數、激光功率、光柵刻線數、共焦針孔、狹縫等參數后再增加測量范圍。輸入采集時間1s，采集次數1次，激光功率選擇1%，光柵刻線數選擇1200gr/mm，共焦針孔100μm，狹縫100μm，點擊單次檢測。

根據譜圖情況調整各參數以確定最佳測試參數。最后測試條件確定為：測量范圍200～2200cm-1（2200cm-1之后的譜段未出現明顯特征峰）、采集時間2s、采集次數20次（采集次數多，最后得到的20次疊加的譜圖效果更好）、激光功率25%、光柵刻線數1200gr/mm、共焦針孔100μm、狹縫100μm。點擊單次采集，得到最終的拉曼譜圖。

數據處理與保存：選擇測試得到的拉曼譜圖，點擊軟件右側Processing（處理）選項卡，選擇基線校準Baseline correction，背底線類型選擇Poly（多項式），階次Degree輸入2，點擊Fit進行擬合，適當增減擬合點數以得到較好的譜圖質量，然后點擊Sub扣除背底，獲得基線平整的譜圖，將譜圖保存為txt格式的文件。

重新繪制拉曼譜圖：將保存好的txt文件打開，復制數據到軟件Origin 75中，重新繪制譜圖，并標注特征峰位置。

測得的織物的拉曼光譜圖如圖1-5-8所示。從譜圖上可以看出，該織物在1617cm-1有很強的譜峰，該處主要是苯環的振動峰（1610cm-1附近），由此可以判斷出組成織物的纖維中含有苯環。在常規的化學纖維中，聚酯纖維含有苯環。此外，該織物在1290cm-1和1731cm-1處也存在明顯的特征峰。酯基中C=O雙鍵的伸縮振動在1680～1780cm-1處，與羰基相連的C—O鍵的伸縮振動峰，脂肪族出現在1160～1240cm-1處，芳香族出現在1270～1290cm-1處，由此可以判斷，該織物在1731cm-1處的峰是酯基中C=O雙鍵的伸縮振動峰，在1290cm-1處的峰是芳香族物質中與羰基相連的C—O鍵的伸縮振動峰。由此基本可以判斷該織物中所含的化學纖維是聚酯纖維。聚酯纖維中還存在C—C鍵，C—C鍵的伸縮振動峰主要出現在1040～1160cm-1處。從拉曼譜圖中也可以看到在1096cm-1處有特征峰。綜上所述，可以判斷組成該織物的纖維是聚酯纖維。

對于單一種類的纖維或由單一纖維組成的織物，通過拉曼光譜可以比較快速和準確地判斷出來，但對于混合纖維或混紡織物，則需要借助顯微鏡觀察法、燃燒法、染色法、拉曼光譜法等多種手段進行判別。