第一章　腫瘤免疫治療技術及原理

第一節　腫瘤免疫治療簡介

一、腫瘤免疫治療基礎

1.腫瘤免疫治療史概述

腫瘤免疫治療開始于1891年，當時紐約外科醫生William B.Coley（1862—1936）發現，細菌產物“科萊毒素”（Coley toxins）對腫瘤有療效，他開發出了一種專治腫瘤的細菌疫苗，成功地使許多患者腫瘤縮小并治愈^［1］。經歷了近一個半世紀的發展，現在腫瘤免疫治療主要包括三類：腫瘤的主動特異性免疫治療——腫瘤疫苗（包括腫瘤細胞疫苗、DC疫苗、腫瘤多肽疫苗、獨特型疫苗和核酸疫苗）、過繼性免疫治療（包括淋巴因子活化的殺傷細胞LAK、腫瘤浸潤淋巴細胞TIL、細胞因子誘導的殺傷細胞CIK、供者淋巴細胞輸注DLI）和非特異性免疫調節劑。表1-1列舉了腫瘤免疫研究中的一些大事件^［2］。

1976年， IL-2的發現激發了人們對細胞免疫反應的廣泛研究。1985年，發現使用IL-2后轉移性黑色素瘤和腎癌出現持久性的消退。1992年，IL-2獲準用于治療轉移性腎癌。1998年，IL-2獲準用于治療轉移性黑色素瘤^［2］。2012年，耶魯大學的Vincent T. DeVita和NIH的Steven A. Rosenberg聯合在《新英格蘭醫學》雜志發表“癌癥研究200年”^［3］。文中肯定了免疫調節劑、過繼性免疫細胞治療和基因工程修飾的免疫細胞在癌癥治療方面的臨床效果，這為今后免疫療法治療腫瘤提供了有力的證據。2014年，耶魯大學等機構的研究表明，接受免疫檢驗點PD-1單抗nivolumab治療黑色素瘤后，出現了令人鼓舞的結果，1年生存率可達62%，2年生存率達43%^［4］。2014年，紀念斯隆-凱特琳癌癥中心對16名成人難治性、復發性急性淋巴細胞白血病患者進行嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治療后，患者的完全緩解率達88%，遠高于補救性化療的完全緩解率^［5］。

2.抗腫瘤免疫應答基本原理簡介

（1）機體免疫系統組成　免疫系統分為天然免疫系統和獲得性免疫系統兩部分^［6］。天然免疫是免疫系統的第一道屏障，發生應答的時間非常快。參與天然免疫反應的細胞類型有粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞等。獲得性免疫是一種特異性的免疫應答反應，與天然免疫相比，具有一定的優勢。它能特異識別各種抗原，并對同種抗原具有記憶能力。獲得性免疫和天然免疫之間沒有明顯的界限，兩者相互關聯。比如NK細胞和γδ T細胞同時兼具天然免疫和獲得性免疫的特征（圖1-1）。免疫系統誘發機體對外源病原體和內源異常細胞產生保護性免疫力非常重要。正常情況下，體內的某些免疫細胞能及時發現并殺傷體內經常出現的少量異常細胞。免疫細胞能夠識別機體內產生的帶有新抗原決定簇的突變細胞，并能及時清除這些突變細胞，進而阻止腫瘤的發生、發展。

（2）抗腫瘤免疫應答機制　無論是天然固有免疫，還是獲得性抗腫瘤免疫，都需要經歷三個主要步驟^［7］，才能獲得有效的抗腫瘤免疫應答反應（圖1-2）。①免疫細胞識別、攝取、加工處理腫瘤抗原階段。免疫應答啟動階段，專職抗原遞呈細胞——樹突狀細胞（DC），必須首先獲取腫瘤抗原。這些腫瘤抗原通過在原位被消化，或者被傳遞到其他組織等形式，成為治療性疫苗的一部分。DC攝取抗原后被激活，通過對腫瘤抗原肽段的加工、處理等過程，通過MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子，將腫瘤抗原遞呈到DC表面。②免疫細胞活化、增殖、分化、成熟階段。在淋巴組織內，負載腫瘤抗原的DC刺激T細胞，產生特異性T細胞免疫應答，效應細胞以能發揮強烈細胞毒性作用的CD8⁺ T細胞為主。DC也可以刺激特異性抗體的產生，與NK（natural killer）細胞或者NK樣T（natural killer T，NKT）細胞一起，共同參與抗腫瘤免疫應答。③免疫效應階段。腫瘤特異性T細胞進入腫瘤組織，發揮抗腫瘤免疫殺傷效應功能，同時，Treg等免疫細胞也開始發揮免疫抑制調節作用^［7］。了解抗腫瘤免疫應答的三個主要過程，可以在三個方面進行抗腫瘤免疫治療：促進和優化腫瘤抗原的遞呈過程；促進T細胞的活化；改善腫瘤免疫抑制微環境。

（3）腫瘤免疫抑制微環境　1959年，Burnet和Thomas提出了“免疫監視（tumor immune surveillance）”假說^［8］，該假說認為免疫系統能夠識別并清除惡性腫瘤，從而抑制了腫瘤的發生發展。盡管機體內具有一系列的免疫監視機制，但仍難以阻止腫瘤的發生和發展。少量腫瘤細胞不易引起機體應答，待腫瘤生長至一定程度，超越了機體免疫應答的能力，腫瘤細胞即得以逃逸。T細胞是腫瘤免疫監視過程中的一個重要成員，是抑制腫瘤微環境的關鍵因素。正常T細胞通過識別MHC-腫瘤相關抗原復合體來消除腫瘤細胞。由于腫瘤微環境的免疫抑制作用，腫瘤組織中T細胞的活性明顯下降。通過檢驗點（CTLA-4和PD-1）抑制劑降低T細胞的活化閾值，或回輸一定數量的活化T細胞對晚期黑色素瘤患者有明顯的效果^［9］，提示解除腫瘤免疫抑制微環境能治療腫瘤。

腫瘤細胞逃避抗腫瘤免疫應答的機制有許多。①可以通過下調其表面MHC-Ⅰ類分子的表達、表達PD-L1等信號分子^［7］，產生免疫抑制的微環境，進而抑制T細胞的殺傷活性。②腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌作用，改變和維持自身生存和發展的條件，促進腫瘤的生長和發展。腫瘤細胞也可以通過釋放免疫抑制因子IDO（indoleamine 2，3-dioxygenase）、TGF-β和IL-10等，來阻止T細胞的免疫監視功能，進一步抑制抗腫瘤免疫應答。釋放的免疫抑制因子TGF-β可誘導T細胞分化成為Treg，IL-10能促進M2巨噬細胞的分化。Treg對免疫反應有負向調節的作用。有研究表明，B細胞白血病和淋巴瘤患者體內Tregs水平增高，與B細胞惡性腫瘤的預后成負相關^［10］。髓源性抑制細胞MDSC（myeloid derived suppressor cell，MDSC），在腫瘤抑制的微環境中扮演著另一個重要的角色。腫瘤招募免疫抑制細胞，不僅抑制了免疫反應，而且通過釋放促進血管生成的因子（VEGFA、FGFβ等）來誘導血管生成。MDSC能夠直接抑制NK細胞的功能，并促進免疫抑制T細胞的數量。Tregs、MDSCs和M2巨噬細胞等一起，共同參與腫瘤免疫抑制的微環境、負向調節T細胞的功能，也是腫瘤細胞免疫逃逸的一個重要原因^［11］。③血管周細胞也是腫瘤微環境中的重要細胞成分，通常與腫瘤血管的結構相關。在腫瘤組織中，周細胞較少，會使腫瘤組織血管出現滲漏^［12］。Hamzah等^［13］的研究表明：RGS5作為主要的調控基因，影響著周細胞的成熟，進而出現不正常的血管形態。RGS5缺乏的小鼠中，腫瘤組織中的周細胞呈正常成熟形態，且腫瘤內血管與正常組織中血管的結構類似。

（4）免疫調控信號通路簡介　免疫應答的精細調節是通過大量的配體、受體（包括協同刺激分子）的相互協調而實現的，它們負責擴大或者抑制初始的免疫應答。通常T細胞受體（TCR）會特異性地識別抗原遞呈細胞（APC）遞呈的MHC-多肽復合物，這些相互作用既可以發生在二級淋巴器官（此時幼稚T細胞第一次遇到抗原），也可以發生在淋巴結外^［14］。有兩個獨立的信號途徑參與T細胞與APC細胞的相互調節作用。第一信號通過T細胞上的TCR識別APCs上腫瘤抗原-MHC復合物。第二信號獨立于腫瘤抗原，通過共刺激分子傳遞。除了T細胞正向調控的共刺激分子，最近也發現了越來越多的T細胞負向調控的共刺激分子， T細胞的耐受或者功能可能由這些因子一起決定（圖1-3）^［14］。

①T細胞正向調控共刺激分子。正向共刺激信號主要是由表達在幼稚T細胞上的CD28受體來調節的，CD28會與B7.1（CD80）和B7.2（CD86）分子結合，后者表達于激活的APCs上。這種相互作用引起T細胞的增殖并促進T細胞的活化，同時也會產生多種細胞因子如IL-2等。小鼠實驗顯示，若CD4⁺ T和CD8⁺ T細胞存在CD28或者其配體B7.1和B7.2分子的缺陷，將會嚴重削弱二者增殖和產生效應細胞因子的能力^［15］。除了CD28以外，ICOS也是CD28家族一個重要的共刺激分子，影響T細胞的激活和功能^［16］。ICOS表達在激活的T細胞上，與表達在B細胞、巨噬細胞、內皮細胞和非淋巴結組織上的配體B7RPL結合。在基因敲除小鼠的研究中發現，ICOS與CD28不同，僅影響T細胞一部分功能。ICOS在效應CD4⁺ T細胞中通過提高NFATc1的表達和下游c-maf的表達，調節IL-4的表達。ICOS還參與IL-21和IL-17表達的調節^［17］。最近的研究表明，ICOS也可調節Treg細胞IL-10的分泌^［14］。缺乏CD28或者ICOS共刺激信號，僅會導致免疫功能缺陷，但是觀察不到絕對的CD4⁺ T和CD8⁺ T細胞免疫耐受^［18］。沒有CD28和ICOS共刺激激活的T細胞，會成為免疫耐受的T細胞，并且出現基因轉錄缺陷^［16］。T細胞免疫耐受不僅受正向共刺激分子缺乏的調節，同時也受負向共刺激分子的調節。

②T細胞負向調控共刺激分子。目前，已發現了多種負向共刺激因子，比如CTLA-4、PD-1、B7-S1和B7-H3等。CTLA-4僅在激活的T細胞上受到誘導表達。相對于CD28，CTLA-4是T細胞激活和增殖的負向調節因子。CTLA-4缺陷小鼠在新生期便可由于大量的T細胞激活和組織浸潤，出現自發的自身免疫反應甚至死亡^［19］。封閉CTLA-4的表達，能抑制CD4⁺ T細胞的活性，但對于CD8⁺ T細胞則無作用。大量的研究已經提示CTLA-4通過調控Treg細胞的抑制功能，在誘導免疫耐受中發揮重要作用。封閉CTLA-4的表達或者與細胞疫苗結合、放射治療、手術切除或者熱療等，會提高T細胞介導的免疫應答^［20］。ipilimumab，一種人源化的抗CTLA-4單克隆抗體，在治療黑色素瘤的過程中，可明顯提高患者的總體生存率，已經被FDA批準用于治療晚期黑色素瘤等^［21］。PD-1是表達在激活的T細胞、B細胞、單核細胞和NKT細胞表面的另外一種抑制性受體，其配體是PD-L1 （B7-H1）和PD-L2 （B7-DC）^［22］。PD-L1在血液系統、胰島、心臟、內皮、小腸和胰腺中表達上調。PD-L2的表達則相對局限，主要表達在DC和單核細胞上，可上調激活IFN-γ、GM-CSF和IL-4。在PD-1缺失的小鼠中可以觀察到明顯的自身免疫反應，提示PD-1在免疫耐受中發揮重要作用。PD-1缺陷會加速NODLtJ小鼠Ⅰ型糖尿病的發生，促進C57BL/6小鼠模型出現關節炎和狼瘡性腎小球腎炎。PD-1、PD-L1信號通路通過抑制CD4⁺T細胞和CD8⁺ T細胞的增殖以及抑制IL-2的產生來發揮作用。PD-1配體，PD-L1和PD-L2在免疫耐受中的作用存在爭議，最近的研究認為，PD-L1和PD-L2在體內能下調免疫應答反應，并且維持T細胞對抗原的免疫耐受^［23］。PD-L1已經被發現在多種腫瘤中表達，并且顯示可以誘導腫瘤特異性T淋巴細胞的凋亡^［14］。在使用PD-1抑制劑治療的臨床Ⅰ期試驗中，使用人單克隆抗體MDX-1106，已經顯示可導致黑色素瘤、結腸癌和肺癌患者的腫瘤轉歸^［24］。

B7-H3屬于B7/CD28共刺激分子超家族成員，表達在人類DCs上，可以刺激人類T細胞增殖和IFN-γ的產生^［25］。初期的研究提示B7-H3可作為正向共刺激分子促進T細胞活化，但后來的研究卻給出了相反的結論，認為B7-H3可抑制CD4⁺ T細胞和CD8⁺ T細胞的增殖并減少TCR信號激活引起的細胞因子分泌。雖然B7-H3表達于腫瘤細胞中，但其在抗腫瘤應答調節中的功能仍存在爭議^{［14，26］}。B7-S1/B7x/B7-H4屬于B7超家族，并且廣泛表達在淋巴組織和非淋巴組織中。類似于B7-H3，B7-S1在激活的而不是幼稚的T細胞表面有一個受體^［27］。體外研究表明，B7-S1可以抑制CD4⁺T細胞和CD8⁺ T細胞的增殖、細胞周期、細胞因子和毒性T細胞的產生。在體內抑制B7-S1也會導致T細胞依賴的免疫應答的增強和EAE疾病的加重。與PD-L1相似，B7-S1在腫瘤中由TAMs表達。由巨噬細胞TAMs表達的B7-S1，可以抑制腫瘤抗原特異性CD8⁺ T細胞的增殖和效應功能。在淋巴細胞缺乏的小鼠中阻抑B7-S1，能降低移植腫瘤細胞的生長^{［14，28］}。

隨著人們對腫瘤抗原、腫瘤免疫應答和腫瘤免疫抑制微環境等機制的理解，抗腫瘤免疫治療已逐漸成為可能。