三、基因轉染T細胞的方法^［16］

有幾種不同的基因轉移方法可用于CAR-T細胞的基因轉導和靶基因表達?；虻霓D導/轉染方法主要包括病毒和非病毒轉染的方法。

1.γ反轉錄病毒載體

反轉錄病毒載體作為基因轉移載體有兩個特點：①大多數反轉錄病毒基因組能被轉導的目的基因所代替；②反轉錄病毒載體轉染的目的基因，能在細胞分裂的過程中整合到宿主細胞的基因組中。

2.慢病毒載體

慢病毒載體與γ反轉錄病毒載體比較相似，病毒基因可以被目的基因所替代，并且目的基因可以整合到宿主細胞基因組中。不同于γ反轉錄病毒，慢病毒表達載體需要順式遞呈rev基因，以及可以提高gag-pol mRNA核輸出的中央聚嘌呤區/中央終止信號^［25］。慢病毒與γ反轉錄病毒載體的另一個不同之處是，慢病毒載體可以通過完整的宿主核膜，在整合到靶細胞時不需要細胞處于分裂期。慢病毒載體的另一個優勢是在靶細胞基因組整合位點與啟動子區域無關，這樣可以減少插入突變的風險^［26］。

3.腺病毒相關病毒載體

腺病毒相關病毒（adeno-associated virus，AAV）是單鏈的DNA小脫氧核糖核酸病毒，在每一個單鏈基因組的末端具有一個倒置的末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR），是基因組復制和包裝需要的順式作用元件。最近的研究發現，AAV在19號染色體上的特定整合位點，是基因插入比較安全的區域，有利于CAR-T細胞的基因轉染。

4.質粒DNA依賴的載體

許多年來，一直使用質粒DNA載體將目的基因轉移到癌細胞中。通過電轉的方法也可以將質粒DNA有效地轉移到淋巴細胞中，使目的基因瞬時表達。這個轉基因過程雖然也可以導致基因組的整合，但是相比較于病毒載體，其發生基因整合的概率非常低。研究已經證明使用電轉DNA的方法是安全的，但是基因轉移效率不高，且經過該方法轉基因的T細胞壽命較短^［27］。

5.轉座子依賴的基因轉移

轉座子是不連續的DNA片段，具有在染色體位點之間遷移和攜帶基因信息的能力。目前兩種不同的轉座子依賴的表達系統被用來作為基因治療的方法，即睡美人SB系統和來源于鱗翅目昆蟲的PB系統。SB系統具有較低的免疫原性，低的增強子/啟動子活性，精確和穩定的染色體整合以及能接受“負荷”的能力。通過SB和PB轉座子系統，可以將表達CD19 CAR導入T細胞中^{［28，29］}。PB轉座子系統也已經被用來制備靶向CD10和HER-2的CAR-T細胞^{［29，30］}。CD19 CAR-T細胞的制備需要經過3～4個星期^［31］。

6.mRNA介導的基因轉導

使用電轉的方法將mRNA轉導進 T細胞可以獲得接近100%的轉染效率，且目的基因在靶細胞中能有效表達。mRNA基因轉導的優點包括：①相對容易體外制備mRNA；②具備轉導靜止和增殖期細胞的能力；③很少導致基因組DNA的整合和插入突變。但是這種轉導方法的缺點包括瞬時基因表達（大約7～10天）、需要多次輸注CAR-T細胞等。有幾項臨床前的研究已經成功使用mRNA電轉的方法制備CAR-T細胞^{［31，32］}。

體內試驗結果證明，用病毒載體將CAR基因導入T細胞中制備CAR-T細胞，是安全和有效的方法^［33］。為了提高T細胞的轉染效率，目前最常用的方法還是病毒轉染介導的T細胞轉基因方法^［34-36］。Philipp Vormittag等^［33］分析了978份CAR-T細胞制備產品，發現其中919份是使用病毒轉染T細胞的方法，其中521份（占54%）使用的是慢病毒載體，398份（占41%）使用的是反轉錄病毒載體。