前言

外源微生物采油技術有重復性差和持續時間短等缺陷。存在這些問題的關鍵在于外源微生物的配伍比較盲目，沒有理論指導和配伍標準，從而對內源微生物激活不具有很好的針對性，究其原因主要是缺乏對采油過程中油藏微生物群落結構的了解。采用分子生態學方法對高溫油藏微生物群落進行多樣性分析，并將得到的信息用于指導油藏微生物的分離是一項十分重要的工作。

編者用兩種方法提取了油田采出水中的細菌總DNA，采用16S rDNA V3、V8、V9三個高可變區的引物對提取的DNA進行擴增，對PCR產物進行了變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。結果表明，采用酶法和化學法結合的方法提取水樣中的總DNA，即可得到完整的DNA樣品，經PCR-DGGE分析后能夠得到較多的DNA條帶；采用V9區引物擴增比V3和V8區引物能夠得到更多的DNA條帶，從而分析到更多的微生物信息。對水樣中優勢條帶序列分析表明，在該油藏中存在的微生物與GenBank數據庫中α，β，γ-變形菌和芽孢桿菌的序列相似性最高。以序列信息為指導，采用富集培養、直接培養和特殊培養的方法，從水樣中分離出5株高溫菌（而傳統分離方法只能獲得3株）。實驗證實了其中3株能在55℃以上兼性厭氧條件下生長并降解原油，并使原油的黏度和凝固點顯著降低。

利用多相分類技術，通過細菌的表型、生理生化指標、碳源試驗、細胞壁組成、16S rDNA和基因組DNA分子雜交等實驗，確定菌株DM-1為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis DM-1，菌株DM-2為嗜熱脂肪芽孢桿菌，命名為Geobacillus stearothermophilus DM-2。

菌株DM-1在55℃高溫缺氧環境中，能以烴為唯一碳源乳化并降解原油。在LB固體培養基上，DM-1能產生黏性膿胞樣菌落，用產多糖培養基培養可產生胞外多糖使發酵液黏稠。該多糖物質經HPLC技術檢測，其主要成分為甘露糖（91.87%）、葡萄糖（7.95%）和半乳糖（0.18%）；對菌株DM-1產多糖的最佳碳源和發酵溫度進行了選擇，發現該菌株在45℃時利用蔗糖為碳源發酵，其多糖產量可達1.7g·L^-1；利用非均質巖心模擬的調剖實驗表明，DM-1的菌體及其產生的胞外多糖在巖石表面形成生物膜對巖石孔隙起到了封堵作用，使注入壓力由0.01MPa增加到0.40MPa，滲透率降低了58.8%，采收率提高了3.9%，該菌株可用于微生物調剖。

菌株DM-2在60～65℃高溫和缺氧條件下，能夠以烴為碳源生長代謝，經分析表明，DM-2對原油的降解率可達70%，且對原油中各種正構烷烴均有不同程度的降解，說明該菌株對原油有很強的降解能力。同時，菌株DM-2以糖為碳源可產生一種新型生物乳化劑，該乳化劑對柴油、苯、二甲苯、煤油和原油等均有很好的乳化效果，在常溫下形成EI-24值為100%的乳狀液。該乳化劑對酸堿穩定，在pH1～pH14范圍內對0^#柴油的乳化能力均為100%，經高溫高壓作用后活性穩定，且能耐受25%的高NaCl濃度。實驗證明，該生物乳化劑由糖和蛋白組成，其中多糖含量約為38.6%，蛋白含量約為55.7%。經HPLC技術檢測，其多糖組分為甘露糖（37.8%）、葡萄糖（31.9%）、半乳糖（28.0%）和葡萄糖醛酸（2.3%），蛋白部分主要由賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸組成。菌株DM-2產生的乳化劑能夠提高烷烴和原油在水中的溶解度，形成水包油（O/W）乳狀液，對高含蠟原油的乳化、分散效果明顯，原油降解率達67.78%。礦場實驗表明，DM-2菌株的發酵液乳化性能好，增油效果明顯，極具應用前景。

采用PCR-DGGE技術對外源菌在油藏中的消長情況進行了監測，同時也得到了大量的內源微生物信息。由于外源微生物的注入，遼河油田兩口井的原油產量均有明顯提高，井26-195的日產油量平均為1.58t，井27-221的日產油量平均可達4.52t，而實施微生物采油技術之前這兩口井的產油量幾乎為零。序列分析表明，在這兩口井中Proteobacteria是主要菌群，大多數是與烴降解相關的未培養微生物，這為功能性菌株的分離提供了信息。結合產油量曲線和DGGE圖譜分析可知，采收率的提高與油藏內源和外源微生物群落的存在密切相關。

采用兼并引物擴增了兩株高溫解烴菌的alkB片段，通過序列比對和氨基酸序列分析，驗證了這兩段序列確實是alkB基因片段。對于烴降解微生物群落，alkB基因是編碼關鍵酶的功能基因，在種群的功能分析上具有重要作用。目前芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的烴降解基因研究還很少，給分析工作帶來很大困難，同時，如何將微生物種群與其生態功能聯系起來是目前微生物生態學研究的一個難點。本研究為今后分離完整的烷烴降解基因和檢測環境樣本中的功能性種群奠定了基礎。

王　君

二零一八年一月