離子液體-分散液液微萃取結合高效液相色譜法同時分析食品包裝中3種痕量內分泌干擾物

王玲玲^*，張蕾

（遼寧大學化學院，沈陽 110036）

目前，樣品前處理方法的研究正向著簡單、省時、高效、小型化及減少有機溶劑用量的方向發展。傳統的分離富集方法有溶劑萃取法、離子交換法、固相萃取法等。液相微萃取法（LPME）是近年來發展起來的一種微型化樣品前處理方法^[1]，該方法僅需要微升級的萃取溶劑，將萃取、凈化、濃縮集為一體，同步完成，具有溶劑用量少、操作簡易、富集因子高等特點。離子液體（IL）作為一類新興的環境友好溶劑，具有蒸氣壓低、熱穩定性好、結構可調節以及對有機和無機物有良好溶解能力等獨特的物理化學性質^[2]，可代替傳統的有機溶劑，在分析化學，特別是在樣品前處理過程中受到了越來越多的重視。

目前，基于離子液體的液相微萃取技術，包括離子液體單滴微萃取（IL-DSME）^[3]、離子液體中空纖維液相微萃取（IL-HF-LME）^[4]和離子液體-分散液液微萃取（IL-DLLME）^[5]，已被廣泛應用在生物、環境和食品樣品的分析中。人們研究離子液體用于萃取食品色素、染料、抗生素、有機氯農藥、生物分子蛋白質等^[7-10]，取得良好的富集效果。

近年來，雙酚類化合物被廣泛應用于塑料、黏合劑以及食品和飲料的包裝材料中。其中，雙酚A（BPA）、雙酚AF（BPAF）和雙酚AP（BPAP）是3種典型的內分泌干擾物，長期接觸這類物質會對人類的身體健康產生不良影響，如減少精子數量，降低生育能力，增加生殖系統的癌癥發病率等^[11-13]。因此，本實驗我們采用IL-DLLME-HPLC分析食品包裝材料中痕量的BPA、BPAF和BPAP。

1　實驗部分

1.1　材料與試劑

離子液體（IL）：1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C₄mim][PF₆]），1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C₄mim][PF₆]），1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[C₈mim][PF₆]）（中國科學院蘭州化學物理研究所）。雙酚A(BPA)，雙酚AF(BPAF)，雙酚AP(BPAP)，（天津希恩生化科技有限公司，純度95%）。甲醇（賽默飛世爾科技公司，色譜純），實驗中所用到的其他藥品均為分析純，全部購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

標準儲備液的配制：分別取BPA、BPAF和BPAP標準品適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并定量稀釋制成濃度為1.0mg/ml的標準儲備液，避光，儲存于4℃的環境中。

工作品溶液的配制：精密量取標準儲備液適量，用二次蒸餾水稀釋制成濃度為200.0ng/ml，現用現配。

1.2　色譜系統與分析條件

色譜儀：Agilent 1100（美國），配有自動進樣器和二極管陣列檢測器（DAD）；色譜柱：Agilent XDB-C18 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm，美國）；流動相為甲醇-水（60 : 40）；流速1.0ml/min；柱溫30℃；檢測波長275nm；進樣體積20μl。

1.3　離子液體-分散液液微萃取

離子液體-分散液液微萃取（IL-DLLME）過程如圖1所示。將10.0ml工作品或樣品溶液置于15ml具塞離心管中，然后將200μl的IL快速注入工作品或樣品溶液中，將此混合溶液置于50℃水浴中超聲萃取3min，形成渾濁液。萃取完成后，渾濁液通過離心機以5000r/min離心分離5min，舍棄上層水溶液。下層離子液體相用300μl甲醇溶液，經0.45μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液，直接進入HPLC進行檢測。

1.4　樣品制備

一次性紙杯，塑料水瓶和塑料食品包裝袋分別購買于當地的市場。將三種樣品剪成均勻小碎塊，分別取2.0g浸泡于50ml乙醇中，放置24h。收集乙醇提取液，40℃水浴旋轉蒸發至體積為0.5～1ml。殘留液用二次蒸餾水溶解，過直徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液作為樣品溶液，于4℃避光保存，備用。

2　結果與討論

2.1　離子液體-分散液液微萃取條件的優化

為了獲得目標分析物最佳提取效率，本實驗通過分析10ml工作標準品溶液（200.0ng/ml）對提取條件進行優化。實驗參數包括提取溶劑的類型和體積，樣品溶液的pH值和離子強度以及提取時間和溫度。所有實驗平行分析三次（n=3），提取回收率和富集因子通過下面的公式進行計算：

式中，c₀和c_a分別表示樣品溶液和離子溶液提取相中目標化合物的濃度；V₀和V_a分別表示樣品溶液和離子溶液提取相的體積。

2.1.1　萃取溶劑的類型

在IL-DLLME實驗中，選擇合適的萃取溶劑的類型對萃取是至關重要的。萃取溶劑的選擇，不但要考慮到目標化合物的化學結構，對目標化合物較好的萃取性能，還要求提取溶劑不溶于水，同時具有良好的色譜行為。基于上述條件，我們選擇了[C₄mim][PF₆]、[C₆mim][PF₆]和 [C₈mim][PF₆]這三種咪唑類型的離子液體對目標化合物進行萃取，結果如圖2（a）所示。如圖所見，萃取回收率隨著陽離子碳鏈的增長（C₄～C₈）而增大，這可能是由于目標化合物與離子液體的疏水作用隨著離子液體碳鏈的增長而增強，因此，[C₈mim][PF₆]對目標化合物萃取率最高。所以，[C₈mim][PF₆]被選作萃取溶劑，進行后續實驗。

2.1.2　萃取溶劑的體積

萃取溶劑的體積也是影響IL-DLLME的另一個至關重要的因素。因為，較低的萃取劑體積會產生較高的富集倍數，這有利于被分析物的富集，增加方法的靈敏度。本實驗考察了不同體積的[C₈mim][PF₆]（50～300μl）對萃取回收率的影響，結果見圖2（b）所示。由圖可見，隨著萃取劑體積從50μl增加到200μl，目標分析物的回收率也隨之增加，繼續增加萃取劑的體積（200～300μl），目標分析物的回收率幾乎沒有明顯的變化，因此選用萃取溶劑的體積為200μl。

2.1.3　樣品溶液pH值

本實驗考察了樣品溶液在pH值在2～12之間對萃取回收率的影響。溶液pH的調節采用NaOH和HCl作為酸堿調節劑，進行pH控制。從圖3（a）可以看出，在pH值在2～6之間時，目標化合物的回收率均大于95%；當pH>8時，目標化合物的回收率均出現明顯的下降。通常，目標化合物的水溶液pH值約為5.0，所以，實驗無需調節樣品溶液的pH值。

2.1.4　樣品溶液離子強度

為了考察了不同離子強度對萃取效率的影響，實驗中分別采用濃度（mol/L）為0、0.02、0.2、0.5和1.0的NaCl溶液作為基礎溶液，按1.3步驟進行實驗，結果見圖3（b）。如圖所示，隨著NaCl加入量的增加，目標分析物的萃取效率也隨之降低。這可能是由于NaCl加入增加了樣品溶液的黏度，降低了被分析物分散到萃取劑中的擴散速率，同時也增大了被分析物在樣品溶液中的溶解度，所以導致萃取率的下降。因此，接下來的實驗中無需調節樣品溶液的離子強度。

2.1.5　萃取溫度

通常，在IL-DLLME過程中，增高實驗溫度可以降低IL的黏度，提高其在樣品溶液中的分散度，加速被分析物從溶液到IL中傳質速度，從而提高萃取效率。因此，本實驗考察了不同溫度對萃取率的影響。分別在5℃到70℃溫度下，按1.3步驟進行實驗。結果顯示，目標化合物的萃取回收率隨著溫度的升高而增大，在溫度到達50℃以后，回收率基本維持不變。因此，本實驗采用50℃作為萃取溫度。

2.1.6　萃取時間

實驗中，采用超生輔助的方式進行萃取，在50℃的條件下，考察了1～10min之間萃取時間對萃取效率的影響。結果表明，目標化合物的萃取回收率隨著萃取時間的延長而增大，在時間為3min時，回收率達到最大值（95.1%～102.5%）。繼續增加萃取時間，萃取效率沒有明顯的改變。因此，為了提高整個實驗的效率，選用3min作為樣品的萃取時間。

2.2　方法的評價

2.2.1　工作曲線、重現性、檢出限和定量限

在最佳的實驗條件下，我們考察該方法的線性、精密度、檢出限和定量限每個實驗平行分析3次。日內精密度是在一天之內測定濃度為200ng/ml的工作品溶液5次，日間精密度則是采用與日內精密度同樣的工作品溶液連續測定5天，所得結果如表1所示。由表可知線性范圍在5～500ng/ml，線性關系良好（相關系數r> 0.99），檢出限（S/N=3，S/N為信噪比），和定量限（S/N=10）分別為0.50～1.50ng/ml和1.65～4.85ng/ml，日內精密度和日間精密度的RSD值均小于5.0%，實驗數據表明該方法具有較高的靈敏度和重現性適合雙酚類內分泌干擾物的痕量分析。

2.2.2　實際樣品分析

為考察方法的準確性和適用性，對三種食品包裝材料進行分析，空白和加標樣品色譜圖如4所示，可以看出空白樣品無干擾。對濃度分別為50.0ng/ml和200.0ng/ml加標樣品進行分析，在最優實驗條件下每個樣品平行分析3次，實驗結果如表2所示。由表可見，三種食品包裝材料中所有目標化合物的回收率在97.8%到103.1%之間，結果令人滿意，說明該實驗方法適用于檢測實際樣品中痕量BPA、BPAF和BPAP。

2.3　與其他方法的比較

本方法與文獻中報道的分析BPA，BPAF和BPAP的其他方法進行了比較，結果見表3。由表可見，IL-DLLME過程快速，整個萃取過程在3min內就可以達到萃取平衡。相對于傳統的固相萃取（SPE）和液液萃取（LLE），IL-DLLME方法需要的樣品量更少，整個萃取過程不消耗任何有機溶劑。盡管本實驗方法的檢出限高于固相萃取-液質串聯用法（SPE-LC-MS/MS）、液液萃取-氣質聯用法（LLE-GC-MS）和液相微萃取-氣質聯用法（LPME-GC-MS），但本實驗方法更簡單、快速和環境友好。

3　結論

本實驗我們開發了一種快速和環境友好的IL-DLLME結合HPLC的分析方法，并將其成功地應用于檢測食品包裝材料中痕量BPA、BPAF和BPAP。該方法不但減少了有機溶劑的消耗，而且縮短了樣品預處理的時間。相比于傳統的萃取溶劑，IL更安全和環境友好。IL-DLLME對3種目標化合物在3min內就可以達到萃取平衡。考查了并優化了影響萃取的各個因素，進行了方法學評價，并成功地將該方法應用到實際樣品的測定。實驗結果證明該方法具有良好的線性范圍和令人滿意的回收率，適合實際樣品中痕量BPA、BPAF和BPAP的分析。

參考文獻

[1] Liu S, Dasgupta PK. Anal Chem, 1995, 67(13): 2042-2049.

[2] Pandey S. Anal Chim Acta, 2006, 556(1): 38-45.

[3] Melwanki MB, Huang SD. Anal Chim Acta, 2006, 555(1): 139-145.

[4] TaoY, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(35): 6259-6266.

[5] Liu Y, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(6): 885-891.

[6] Chen X, LiF, Asumana, et al. Sep Purif Technol, 2013, 106: 105-109.

[7] Chen DX, OuYang XK, Wang YG, et al. Sep Purif Technol, 2013, 104: 263-267.

[8] Mohammadi A, Tavakoli R, Kamankesh M, et al. Anal Chim Acta, 2013, 804: 104-110.

[9] Vichapong J, Burakham R, et al. Talanta, 2011, 84(5): 1253-1258.

[10] Zhou Q, Bai H, Xie G, et al. J Chromatogr A, 2008, 1188(2): 148-153.

[11] Auriol M, Filali-Meknassi Y, Tyagi RD, et al. Proc Biochem, 2006, 41(3): 525-539.

[12] Fowler PA, Bellingham M, Sinclair KD, et al. Mol Cell Endocrinol, 2012, 355(2): 231-239.

[13] HuWY, ShiGB, Hu DP, et al. Mol Cell Endocrinol, 2012, 354(1-2): 63-73.

^*通信作者：王玲玲, E-mail: wll19801010@163.com