金屬螯合雜化硅膠整體柱的制備及在線SPE-HPLC測定牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留

金秋，魏海英^*，呂運開

（河北大學化學與環境科學學院，保定 071002）

高效螯合色譜（HPCIC）是當今較為成熟的一種色譜技術，它是使用高效螯合離子交換色譜柱作為分離介質，檢測和分析復雜樣品中殘留的金屬離子^[1]。金屬螯合色譜（MCAC）通常也叫做固定化金屬螯合色譜（IMAC），是高效螯合色譜的一種，在檢測和純化蛋白質以及多肽類物質時有較好的效果，從而引起了人們的廣泛關注^[2-4]。IMAC具有較好的配體穩定性、簡單的再生條件、高容量、適宜的洗脫條件和低的消耗等特點，成功地應用在了分離生物大分子方面。IMAC能夠較好的吸附蛋白質類物質，同時很多不同的金屬如Ni²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等都被用作固定化金屬，與蛋白質形成螯合作用^[5-6]。

根據金屬螯合色譜固定相與蛋白質發生親和作用的原理，以及氟喹諾酮類藥物結構特性，本工作采用溶膠-凝膠的方法合成了大孔雜化硅膠整體柱基質，并在基質表面接枝環氧基，其環氧基團與亞氨基二乙酸反應，再絡合銅離子，獲得金屬螯合雜化硅膠整體柱，并將其應用于在線固相萃取-液相色譜測定牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留。

1　實驗部分

1.1　試劑和儀器

鹽酸環丙沙星（CIP），恩諾沙星（ENR），洛美沙星（LOM），諾氟沙星（NOR），甲基三甲氧基硅烷（MTMS），四乙氧基硅烷（TEOS），3-(2,3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷（KH-560，EPTS），亞氨基二乙酸（IDA），碳酸鈉，硫酸銅，甲醇，乙腈，冰醋酸。其他試劑均為分析純或色譜純，液相色譜所用試劑和溶液需在0.45μm濾膜過濾后使用，水為二次蒸餾水。

高效液相色譜儀（島津LC-20A液相色譜），Venusil XBP C18色譜柱（5μm, 250mm × 4.6mm，博納艾杰爾，中國）。色譜條件：流動相為乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（25 : 75，體積比），流速為0.8ml/min；紫外檢測波長為280nm，溫度為25℃。

1.2　金屬螯合-大孔雜化整體柱的制備

1.2.1　環氧基雜化整體柱的制備

將合成的雜化整體柱先用甲醇沖洗2h除去整體柱中的DMF，再用0.1mol/L HCl溶液沖洗活化2h，隨后用高純水沖洗至流出液為中性。最后使用甲醇沖洗30min，除去殘留的水，氮氣吹干，除去殘留的溶劑。將EPTS與無水甲醇以3 : 2的體積比混合，用泵以0.05ml/min的流速連續通過整體柱，在40℃水浴中反應12h。隨后將修飾好的雜化整體柱繼續用大量的甲醇和DMF沖洗，以用來除去未反應的物質，沖洗結束后，將不銹鋼柱在40℃下真空干燥過夜。

1.2.2　金屬螯合雜化整體柱的制備

準確稱取12.72g碳酸鈉并溶解在120ml的水中，將6.0g的亞氨基二乙酸加入到碳酸鈉溶液中，并調節溶液的pH值至8.0。將整體柱豎直放置在60℃的柱溫箱中，用液相泵輸送上述溶液，以恒定流速（0.05ml/min）流過整體柱，動態接枝反應6h。為了獲得較好的接枝效果，調換柱子進液端，重復以上步驟。反應結束后，將整體柱依次用水、10%的乙酸溶液和水沖洗至流出液至中性。

在銅離子的固定過程中，準確稱取1.248g硫酸銅，溶解在60ml的水中，并以恒定0.05ml/min的流速通過整體柱，室溫下反應3h。然后從整體柱另一端進液，重復以上步驟。反應完后，用0.02mol/L的磷酸鹽緩沖溶液將未固定的銅離子洗去，將制備的金屬螯合雜化整體柱保存在甲醇溶液中。

1.2.3　實際樣品分析

準確稱取5.2138g牛奶樣品（超市購買），加入10ml乙腈溶劑，混勻5min后，超聲萃取10min，取上層清液分別加入到10ml的離心管中，10000r/min的條件下離心10min，收集上清液，重復提取殘渣一次，合并兩次提取液，用0.22μm微孔過濾膜過濾。分別加標濃度為0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.2mg/kg和0.5mg/kg的標準溶液，平行三次實驗。

2　結果與討論

2.1　合成機理研究

首先采用溶膠-凝膠方法制備大孔雜化整體柱，它的大孔連續網狀結構能夠提供較多的鍵合空間和鍵合位點。原位結合環氧基團后，同亞氨基二乙酸反應，就在整體柱孔道中形成螯合配體。這種三齒配體有足夠的配位原子能夠與銅離子形成較強的鍵合作用。同時，銅離子所形成的空鍵合軌道能夠提供較多的鍵合位點，從而能有效地吸附蛋白質分子和藥物小分子。

2.2　材料的表征

通過圖1中曲線（a）和（b）的對比，3437.00cm^?1處的-OH吸收峰明顯增加，同時935.37cm^?1處的環氧，1128.50cm^?1處的Si-O-Si和1029.34cm^?1的C-O吸收峰明顯變小，證明了IDA接枝成功。通過圖1中曲線（b）和（c）的對比，由于銅離子的吸收峰在指紋區沒有較強的吸收峰變化，只有在3437.00cm^?1處的-OH吸收峰有明顯的降低間接證明了Cu²⁺成功地固定在了IDA鍵合的雜化整體柱上。

如圖2所示，在100～250℃之間，由于水和有機溶劑的蒸發，（a）和（b）都有較小的失重。在300～400℃之間，亞氨基二乙酸鍵合的雜化整體柱有兩個階段的失重過程，而環氧-雜化整體柱在400℃只存在一個階段的失重過程。通過熱重分析，證明了IDA接枝成功。

從圖3（a）和（b）來看，所制備的整體柱都具有較均一、連續的網絡骨架結構。雜化整體柱和金屬螯合雜化整體柱所具有的大于10μm的通孔為在線聯用分析提供了較低的柱壓以及在化學修飾過程中提供了足夠大的孔空間，均勻的網絡骨架結構減少了整體材料管壁剝離問題。

2.3　標準曲線

通過高效液相色譜，測定了濃度（mg/L）為0.05、0.1、0.2、0.5和1.0的ENR、NOR、CIP和LOM的混合溶液。如表1所示，為氟喹諾酮類藥物的標準曲線，各目標物均表現出了良好的線性，線性相關系數均大于0.95。通過三倍噪聲法，計算儀器檢出限均低于16.24 μg/kg。

2.4　在線預富集

采用0.05mg/L的氟喹諾酮類藥物為上樣溶液，考察了金屬螯合雜化整體柱（MC-HMC）的在線富集能力。通過在線萃取和標準溶液直接進樣的標準曲線斜率之比，來計算富集因子。如表1所示，ENR、NOR、CIP和LOM的富集因子分別是15.4、18.6、14.9和18.5。詳細考察了不同進樣體積的富集效果，其色譜圖（圖4）表明了MC-HMC對磺胺類藥物有較好的富集效果。

2.5　在線凈化

為了考察MC-HMC對生物樣品的凈化能力，分別采用空白牛奶樣品，加標牛奶樣品、商品HLB固相萃取柱凈化的加標牛奶樣品和MC-HMC凈化的加標牛奶樣品進行比較研究。如圖5所示，（d）的噪聲明顯低于（a）和（b），表明經過預處理的樣品，不會干擾測定。通過比較圖5（a）和圖5（b），證明了方法有較好的重復性。當與商用的HLB柱比較時，MC-HMC顯示出了較好的凈化和富集能力，同時不會造成基線的漂移。

2.6　在線固相萃取-液相色譜聯用技術檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物

如表2是在線方法的特征參數。ENR、NOR、CIP和LOM的平均回收率在88.60%～102.00%，73.40%～96.00%，76.00%～100.15%和93.60%～102.40%之間。ENR的方法檢出限和定量限為11.16μg/kg和36.83μg/kg，NOR的方法檢出限和定量限為12.50μg/kg和37.50μg/kg，LOM的方法檢出限和定量限為15.43μg/kg和46.29μg/kg，CIP的方法檢出限和定量限為13.57μg/kg和40.71μg/kg。相對標準偏差在2.05%～5.75%之間。

3　結論

本文以接枝環氧基硅烷的雜化整體柱作為基質，鍵合亞氨基二乙酸并絡合銅，制備了一種新型的金屬螯合-大孔雜化硅膠整體柱。將整體柱作為預柱，與高效液相色譜聯用，對牛奶樣品中氟喹諾酮類藥物進行在線富集檢測，并與商用HLB柱進行了對比。該方法顯示出較好的凈化和富集效果。

參考文獻

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基金項目：國家自然科學基金資助項目(21375032)、河北省自然科學基金項目(B2016201213)

^*通信作者：魏海英, 女, 副教授, Tel :13315289983, E-mail：snake3cn@163.com