自制硅膠柱分離提純混合對照品-GC法測定遼細辛中3, 5-二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚的含量研究

蓋崴，高虹，劉征雨

（遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心遼寧省分析科學研究院，沈陽 110015）

遼細辛揮發(fā)油主要成分為3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚（safrole）和甲基丁香酚。目前，對遼細辛進行質量評價的主要手段是用GC-MS法確定遼細辛揮發(fā)油中的成分^[1,2]。在對主要有效成分甲基丁香酚和有毒成分黃樟醚的同時測定上研究^[3,4]很少。而且黃樟醚是易制毒，對照品不容易買到，所以，很多報道都是用面積歸一法測定其相對含量，或者用單一對照品，測定黃樟醚對其相對峰面積進行定量。由于細辛中成分較為復雜，面積歸一化法及相對峰面積法都無法實現(xiàn)其準確定量。本文利用通過氣液相連續(xù)萃取^[5,6]，自制硅膠柱分離提純的3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚，制得3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚的混合對照品，實現(xiàn)了細辛中3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚的同時測定。

1　實驗部分

1.1　試劑及儀器

1.1.1　實驗儀器

氣液相連續(xù)萃取塔，自主研發(fā)，專利號：200420070324；GC-4000A氣相色譜儀，北京東西電子分析儀器有限公司；電子天平BSA124S，賽多利斯科學儀器有限公司；離心機，上海安寧科學儀器廠；超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司。

1.1.2　試劑及樣品來源

正己烷、二氯甲烷、丙酮（天津康科德科技有限公司）色譜純；對照品：3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚混合對照品（自制）；樣品：遼寧省新賓縣遼細辛培植基地人工種植遼細辛（全），2009年9月采收。粉碎過100目篩，裝袋密封后置于干燥器中備用。

1.2　實驗方法與結果

1.2.1　混合對照品的提取

本實驗運用氣液相連續(xù)萃取法提取遼細辛揮發(fā)油，通過自制硅膠柱進一步分離雜質提純得到3,5-二甲氧基甲苯、甲基丁香酚和黃樟醚混合對照品。

氣液相連續(xù)萃取樣品制備方法是依托于我單位具有自主知識產權的“氣液相連續(xù)萃取塔”（圖1）建立起來的一種樣品制備方法。氣液相連續(xù)萃取樣品制備方法提取的揮發(fā)油中幾種主要成分的含量均比藥典法提取的要多。

1.2.2　混合對照品的含量

本實驗提取的混合對照品中3個組分之間分離度較好，同遼細辛揮發(fā)油中其他組分之間分離度較好，見圖2和圖3。完全滿足定量分析遼細辛揮發(fā)油中3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚3種成分含量的要求。經過計算3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚3種組分的總含量占混合對照品的73.96%。混合對照品儲備溶液在室溫下密封放置兩周穩(wěn)定性良好。

1.2.3　色譜條件

安捷倫HP-INNOWAX石英毛細管柱（30m×0.53mm）；柱溫130℃；氣化室溫度260℃；載氣為氮氣；氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度280℃；進樣量2.0μl。

1.2.4　實驗方法

精密稱定樣品粉末約1g，置于50ml離心管中，移取4.0ml丙酮，超聲提取30min后放入離心機離心10min，取上清液置于10ml容量瓶中，再移取4.0ml丙酮于離心管中，超聲提取30min后放入離心機離心10min，合并上清液于10ml容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻。取上清液過0.45μm有機相微孔濾膜，取濾液1.0μl注入氣相色譜，記錄色譜圖。

取2.0ml混合對照品儲備溶液，置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀釋至刻度，搖勻。吸取1.0μl注入氣相色譜儀，結果見圖4，記錄峰面積積分值。按外標定量法計算樣品中3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚的含量，見圖5。

2　結果與討論

2.1　供試品溶液的制備

2.1.1　提取溶劑的考察

精密稱取樣品粉末3份，每份約1g，分別置于50ml離心管中，分別精密移取4.0ml丙酮、二氯甲烷、正己烷，密封。超聲30min后，放入離心機離心10min。取上清液至10ml容量瓶中，再分別移取4.0ml丙酮、二氯甲烷、正己烷于離心管中，密封。超聲30min后，放入離心機離心10min。合并上清液于10ml容量瓶中，分別用丙酮、二氯甲烷、正己烷稀釋至刻度，搖勻。提取液過0.45μm有機相微孔濾膜，取濾液2.0μl注入氣相色譜進行分析（n=3）。結果見表1，根據(jù)考察結果提取溶劑選為丙酮。

2.1.2　提取方法的考察

精密稱取樣品粉末4份，每份約1g，分別置于50ml離心管中，分別精密移取4.0ml丙酮，密封。分別采用超聲15min，超聲30min，以及超聲30min兩次和超聲30min三次，取提取液過0.45μm有機相微孔濾膜，取濾液2.0μl注入氣相色譜進行分析（n=3）考察。結果見表2。

根據(jù)考察結果供試品溶液的制備方法為：精密稱定樣品粉末約1g，置于50ml離心管中，移取4.0ml丙酮，超聲提取30min后放入離心機離心10min，取上清液置于10ml容量瓶中，再移取4.0ml丙酮于離心管中，超聲提取30min后放入離心機離心10min，合并上清液于10ml容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻。

2.2　線性關系的考察

混合對照品儲備液：精密稱取31.8mg混合對照品，置于10ml容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻。混合對照品儲備液濃度為3,5-二甲氧基甲苯0.67mg/ml，黃樟醚0.77mg/ml，甲基丁香酚0.91mg/ml。

精密移取混合對照品儲備液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀釋至刻度，搖勻。各吸取1.0μl注入氣相色譜儀，記錄對照品的峰面積，結果見表3。

以混合對照品3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚進樣量（mg）為橫坐標，峰面積的積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖6。

線性回歸方程分別為：3,5-二甲氧基甲苯Y=8×10⁸X?4014.9(R²=0.9995)，線性范圍為0.000067～0.000335mg；黃樟醚Y=8×10⁸X+726.2(R²=0.9997)，線性范圍為0.000077～0.000385mg；甲基丁香酚Y=9×10⁸X?3534.4(R²=0.9996)，線性范圍為0.000091～0.000455mg。

2.3　精密度試驗

取2.0ml混合對照品儲備溶液，置于10ml容量瓶中，加入丙酮稀釋至刻度，搖勻。吸取1.0μl注入氣相色譜儀，重復進樣5次，3,5-二甲氧基甲苯峰面積積分值的相對標準偏差為0.95%，黃樟醚峰面積積分值的相對標準偏差為1.25%，甲基丁香酚峰面積積分值的相對標準偏差為1.85%，結果表明本方法精密度較好。

2.4　重現(xiàn)性試驗

精密稱取樣品粉末5份，每份約1g，按1.2.4方法制備成供試品溶液，分別取1.0μl注入氣相色譜儀，按外標法定量計算樣品中3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚的含量，見表4。

5份樣品中3,5-二甲氧基甲苯含量相對標準偏差為1.90%，黃樟醚含量相對標準偏差為1.60%，甲基丁香酚含量相對標準偏差為1.64%，結果表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.5　穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，在配制后0,4,8和24h于同一色譜條件下分別取1.0μl注入氣相色譜儀，記錄峰面積，見表5，結果表明樣品溶液在室溫24h穩(wěn)定。

2.6　加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品粉末5份，每份約1g，精密稱取混合對照品加入其中，每份約15mg，按1.2.4制成供試品溶液，分別取1.0μl注入氣相色譜儀，按外標法定量計算樣品中3,5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、甲基丁香酚的量，結果見表6～表8，結果表明本方法回收率較好。

3　結論

方法學驗證用自制硅膠柱分離提純混合對照品-GC法測定遼細辛中3,5二甲氧基甲苯，黃樟醚和甲基丁香酚的含量，精密度RSD分別為0.95%、1.25%、1.85%，重現(xiàn)性RSD分別為1.90%、1.60%、1.64%，加樣回收率分別為99.16%、94.99%、102.57%；HPLC法測定遼細辛中3,5二甲氧基甲苯、黃樟醚和甲基丁香酚的含量，精密度RSD分別為1.77%、1.07%、1.39%，重現(xiàn)性RSD分別為1.98%、2.52%、2.21%，加樣回收率分別為95.07%、94.30%、98.26%。結果令人滿意。

參考文獻

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作者簡介：蓋崴：男，助理研究員，Tel：13840450477, E-mail: gaiwei0305@163.com