任務一　微生物培養基知識

任務要求

1.了解微生物細胞的化學組成

2.掌握微生物生長所需營養物質及其生理功能

3.理解微生物對營養物質吸收的不同方式

4.熟悉微生物的營養類型及其劃分依據

5.掌握培養基配制原則

微生物與其他生物一樣都是有生命活動的，都需要從生存環境中獲取所需的各種營養物質來滿足其生長繁殖過程中的物質和能量代謝。營養物質是微生物進行各種生命活動的物質基礎。

一、微生物營養

那些能夠滿足微生物機體生長、繁殖和完成各種生理活動所需的物質稱為營養物質。而微生物從環境中獲得和利用營養物質的過程稱為營養。

微生物吸收何種營養物質主要取決于微生物細胞的化學組成。

（一）微生物細胞的化學組成

微生物細胞的化學成分以有機物和無機物兩種狀態存在。有機物包含各種大分子，它們是蛋白質、核酸、類脂和糖類等，占細胞干重的99%。無機成分包括小分子無機物和各種離子，占細胞干重的1%。

微生物細胞的元素構成包括C、H、O、N、P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等。其中C、H、O、N、P、S六種元素占微生物細胞干重的97%，稱為常量元素；其他為微量元素。微生物細胞的化學元素組成的比例常因微生物種類的不同而異。

組成微生物細胞的化學元素分別來自微生物生長所需要的營養物質，即微生物生長所需的營養物質應該包含所有組成細胞的各種化學元素。這些物質概括為提供構成細胞物質的碳素來源的碳源物質、構成細胞物質的氮素來源的氮源物質和一些含有K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo元素的無機鹽等。

（二）微生物的營養物質及其生理功能

1.碳源

凡是為微生物生長繁殖提供碳元素來源的物質稱為碳源。碳源分為無機碳和有機碳兩大類。凡只能利用有機碳源的微生物，叫作異養微生物（為數眾多）；凡以無機碳源作唯一或主要碳源的微生物，叫作自養微生物（種類較少）。微生物利用的碳源物質見表3-1。對一切異養微生物來講，其碳源同時又作為能源，因此，這種碳源又稱之為雙功能營養物。

碳源的生理作用主要有：碳源物質通過復雜的化學變化構成微生物自身的細胞物質和代謝產物；同時多數碳源物質在細胞內生化反應過程中還能為機體提供維持生命活動的能量，但有些以CO₂為唯一或主要碳源的微生物生長所需的能源則不是來自CO₂。

2.氮源

凡是為微生物生長繁殖提供氮元素來源的物質稱為氮源。微生物營養上要求的氮素物質可以分為：

①空氣中的分子態氮，少數固氮菌可以利用；

②無機氮化合物，絕大多數微生物可以利用；

③有機氮化合物，大多數寄生性微生物和一部分腐生性微生物可以利用。

銨鹽作為氮源時會導致培養基pH值下降，稱為生理酸性鹽，而以硝酸鹽作為氮源時培養基pH值會升高，稱為生理堿性鹽。

從微生物所能利用的氮源來看，一部分微生物不需要利用氨基酸作氮源，它們能把尿素、銨鹽、硝酸鹽甚至氮氣等簡單氮源自行合成所需要的一切氨基酸，因而可稱為“氨基酸自養型生物”；反之，凡需要從外界吸收現成的氨基酸作氮源的微生物，就是“氨基酸異養型生物”。所有的動物和大量的異養微生物屬于氨基酸異養型生物，而所有綠色植物和不少微生物（如細菌、酵母菌、多數放線菌和真菌）都是氨基酸自養型生物。

人類和為人類服務的大量動物都需要外界提供現成的氨基酸和蛋白質，而這些營養成分往往又是其食物或飼料、餌料中較缺少的。為了充實人和動物的氨基酸營養，除了繼續向綠色植物索取外，還應更多地利用氨基酸自養型微生物，讓它們將人和動物原先無法利用的廉價氮源，包括尿素、銨鹽、硝酸鹽或氮氣等轉化為菌體蛋白（單細胞蛋白或食用菌等）或含氮的代謝產物（谷氨酸等氨基酸），以豐富人類的營養和擴大食物資源，這對人類的生存和發展來說，具有十分積極的意義。

3.無機鹽

無機鹽或礦物質元素主要可為微生物提供除碳源、氮源以外的各種重要元素。無機鹽是微生物生長必不可少的一類營養物質，它們在機體中的生理功能主要是作為酶活性中心的組成部分、維持生物大分子和細胞結構的穩定性、調節并維持細胞的滲透壓平衡、控制細胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長的能源物質等（表3-2）。

微生物生長所需的無機鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。

凡生長所需濃度在10^-3～10^-4mol/L范圍內的元素，可稱為大量元素（又稱常量元素），如P、S、K、Mg、Na、Ca和Fe等；凡生長所需濃度在10^-6～10^-8mol/L范圍內的元素，可稱為微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo和Ni、Sn、Se、Cr、W、Co等。微量元素一般參與酶的組成或使酶活化（表3-3）。

無機鹽的營養功能十分重要，可歸納如下：

4.生長因子

生長因子通常指那些微生物生長所必需且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以滿足機體生長需要的有機化合物。根據生長因子的化學結構和它們在機體中的生理功能的不同，可將生長因子分為維生素、氨基酸、嘌呤與嘧啶三大類（見表3-4）。維生素在機體中所起的作用主要是作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必須在培養基中補充這些氨基酸或含有這些氨基酸的小肽類物質，微生物才能正常生長；嘌呤與嘧啶作為生長因子在微生物機體內的作用主要是作為酶的輔酶或輔基，以及用來合成核苷、核苷酸和核酸。

生長因子與碳源、氮源、能源有一定區別，即并非任何一具體微生物都需要外界為它提供生長因子。按微生物對生長因子的需要與否，可分成三種類型：

（1）生長因子自養型微生物　它們不需要從外界吸收任何生長因子，多數真菌、放線菌和不少細菌，如大腸桿菌、青霉菌、釀酒酵母等都屬此類。

（2）生長因子異養型微生物　它們需要從外界吸收多種生長因子，才能維持正常生長，如各種乳酸菌、動物致病菌、支原體和原生動物等。

（3）生長因子過量合成型微生物　少數微生物在其代謝活動中，能合成并大量分泌某些維生素等生長因子，常可作為有關維生素的生產菌種。如可用阿舒假囊酵母或棉阿舒囊霉生產維生素B₂，可用謝氏丙酸桿菌、鏈霉菌和產甲烷菌生產維生素B₁₂等。

在配制培養基時，一般可用生長因子含量豐富的天然物質作原料以保證微生物對它們的需要，例如酵母膏、玉米漿、肝浸液、麥芽汁、米糠浸液或其他新鮮動、植物的汁液等。

5.水分

水是微生物生長所必不可少的。水在細胞中的生理功能主要有：

①起到溶劑與運輸介質的作用，營養物質的吸收與代謝產物的分泌必須以水為介質才能完成；

②參與細胞內一系列化學反應；

③維持蛋白質、核酸等生物大分子穩定的天然構象；

④因為水的比熱容高，是熱的良好導體，能有效地吸收代謝過程中產生的熱并及時地將熱迅速散發出體外，從而有效地控制細胞內溫度的變化；

⑤保持充足的水分是細胞維持自身正常形態的重要因素；

⑥微生物通過水合作用與脫水作用控制由多亞基組成的結構，如酶、微管、鞭毛及病毒顆粒的組裝與解離。

微生物生長的環境中水的有效性常以水活度值（a_w）表示，水活度值是指在一定的溫度和壓力條件下，溶液的蒸氣壓力與同樣條件下純水蒸氣壓力之比，即：

a_w=p/p₀

式中，p代表溶液蒸氣壓；p₀代表純水蒸氣壓。

純水a_w為1.00，溶液中溶質越多，a_w越小。微生物一般在a_w為0.60～0.99的條件下生長，a_w過低時，微生物生長的遲緩期延長，比生長速率和總生長量減小。微生物不同，其生長的最適a_w不同（表3-5）。一般而言，細菌生長最適a_w較酵母菌和霉菌高，而嗜鹽微生物生長最適a_w則較低。

6.能源

為微生物生命活動提供最初能量來源的物質，稱為能源，通常分為輻射能和化學能。輻射能一般是指太陽能；化學能則指能夠進行氧化還原反應并產生能量的物質，如Fe²⁺、S、H₂S、H₂、N等。

各種異養微生物的能源就是碳源。化能自養型微生物的能源是一些還原態的無機物質，如N、N、S、H₂S、H₂和Fe²⁺等，能利用這種能源的都是一些原核微生物，包括亞硝酸細菌、硝酸細菌、硫化細菌、硫細菌、氫細菌和鐵細菌等。

化學能源物質往往會與碳源、氮源等物質相重疊，使一種營養物充當兩種或兩種以上功能，因此也稱之為雙功能或多功能碳源。如無機物N屬于雙功能營養物（能源、氮源），有機物蛋白質、氨基酸屬于三功能營養物（碳源、氮源、能源）。

二、微生物營養類型

由于微生物種類繁多，其營養類型也比較復雜，人們常在不同層次和側重點上對微生物營養類型進行劃分（表3-6）。根據碳源、能源及電子供體性質的不同，可將絕大部分微生物分為光能無機自養型、光能有機異養型、化能無機自養型及化能有機異養型四種類型（表3-7）。

（一）光能無機自養型

光能無機自養型，又稱光能自養型，這是一類能以CO₂為唯一碳源或主要碳源并利用光能進行生長的微生物。它們能利用無機物如水、硫化氫、硫代硫酸鈉或其他無機化合物使CO₂固定還原成細胞物質，并且伴隨元素氧（硫）的釋放。

藻類、藍細菌和光合細菌屬于這一類營養類型。

藻類和藍細菌：

這與高等植物光合作用是一致的。

光合細菌：

這與藻類、藍細菌和高等植物是不同的。

（二）化能無機自養型

化能無機自養型，又稱化能自養型，這類微生物利用無機物氧化過程中放出的化學能作為它們生長所需的能量，以CO₂或碳酸鹽作為唯一或主要的碳源進行生長，利用電子供體如氫氣、硫化氫、二價鐵離子或亞硝酸鹽等使CO₂還原成細胞物質。

屬于這類微生物的類群有硫化細菌、硝化細菌、氫細菌與鐵細菌等。例如氫細菌：

（三）光能有機異養型

光能有機異養型，又稱光能異養型，這類微生物不能以CO₂作為唯一碳源或主要碳源，需以有機物作為供氫體，利用光能將CO₂還原為細胞物質。

紅螺屬的一些細菌就是這一營養類型的代表：

光能有機異養型細菌在生長時通常需要外源的生長因子。

（四）化能有機異養型

化能有機異養型，又稱化能異養型，這類微生物生長所需的能量來自有機物氧化過程釋放出的化學能，生長所需要的碳源主要是一些有機化合物，如淀粉、纖維素、有機酸等，化能有機異養型微生物利用的有機物通常既是它們生長的碳源物質又是能源物質。

目前在已知的微生物中大多數屬于化能有機異養型，如絕大多數的細菌、全部真菌、原生動物以及病毒。

如果化能有機異養型微生物利用的有機物不具有生命活性，則是腐生型；若是生活在活細胞內從寄生體內獲得營養物質，則是寄生型。

三、微生物營養吸收

微生物是借助生物膜的半透性及其結構特點來吸收營養物質和水分的。影響營養物質進入細胞的因素主要有三個：①營養物質本身的性質；②微生物所處的環境；③微生物細胞膜的透過屏障作用。

（一）單純擴散

單純擴散是一種最簡單的物質跨膜運輸方式，為純粹的物理學過程，在擴散過程中不消耗能量，物質擴散的動力來自參與擴散的物質在膜內外的濃度差，營養物質由高濃度向低濃度擴散，不能逆濃度運輸。物質擴散的速率隨原生質膜內外營養物質濃度差的降低而減小，直到膜內外營養物質濃度相同時才達到一個動態平衡。

單純擴散并不是微生物細胞吸收營養物質的主要方式。水是唯一可以通過擴散自由通過原生質膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些氣體分子（O₂、CO₂）及某些氨基酸在一定程度上也可通過擴散進出細胞。

（二）促進擴散

促進擴散指溶質在運送過程中，必須借助存在于細胞膜上的底物特異性結合載體蛋白的協助，但不消耗能量的一類擴散性運送方式。營養物質也是由高濃度向低濃度擴散，不能逆濃度運輸。

促進擴散與單純擴散的主要區別：通過促進擴散進行跨膜運輸的物質需要借助于載體的協助作用才能進入細胞（圖3-1），而且每種載體只運輸能特異性結合的物質，具有高度的專一性。被運輸物質與載體之間親和力大小變化是通過載體分子的構象變化而實現的。參與促進擴散的載體主要是一些蛋白質，這些蛋白質能促進物質進行跨膜運輸，底物在這個過程中不發生化學變化，而且在促進擴散中載體只影響物質的運輸速率，并不改變該物質在膜內外形成的動態平衡狀態，被運輸物質在膜內外濃度差越大，促進擴散的速率越快，但是當被運輸物質濃度過高而使載體蛋白飽和時，運輸速率就不再增加。

通過促進擴散進入細胞的營養物質主要有氨基酸、單糖、維生素及無機鹽等。

（三）主動運輸

主動運輸是廣泛存在于微生物中的一種主要的物質運輸方式（圖3-2）。主動運輸的一個重要特點是在物質運輸過程中需要消耗能量，而且可以逆濃度運輸。

主動運輸須提供能量，并通過細胞膜上特異性載體蛋白構象的變化，而使膜外環境中低濃度的溶質運入膜內。由于它可以逆濃度梯度運送營養物，所以對許多生存于低濃度營養環境中的貧養菌的生存極為重要。主動運輸的例子很多，主要有無機離子、有機離子（某些氨基酸、有機酸等）和一些糖類（乳糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蜜二糖以及阿拉伯糖、核糖等）。在大腸桿菌中，通過主動運輸，運送1分子乳糖約消耗0.5分子ATP，而運送1分子麥芽糖則要消耗1.0～1.2ATP。

（四）基團移位

基團移位是指既需特異性載體蛋白的參與，又需耗能的一種物質運輸方式，其特點是溶質在運送前后會發生分子結構的變化。

基團移位廣泛存在于原核生物中，尤其是一些兼性厭氧型細菌和專性厭氧型細菌中，主要用于糖（葡萄糖、果糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺等）的運輸，丁酸、核苷酸、腺嘌呤等也可通過這種方式運輸。目前尚未在好氧型細菌及真核生物中發現這種運輸方式，也未發現氨基酸通過這種方式進行運輸。

在研究大腸桿菌對葡萄糖和金黃色葡萄球菌對乳糖的吸收過程中，發現這些糖進入細胞后以磷酸糖的形式存在于細胞質中，表明這些糖在運輸過程中發生了磷酸化作用，其中的磷酸基團來源于胞內的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），因此稱為磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖轉移酶運輸系統（PTS），簡稱磷酸轉移酶系統（圖3-3）。PTS通常由五種蛋白質組成，包括酶Ⅰ、酶Ⅱ（包括a、b和c三個亞基）和一種低分子量的熱穩定蛋白質（HPr）。酶I和HPr是非特異性的細胞質蛋白，酶Ⅱ a是可溶性細胞質蛋白，親水性酶Ⅱ b與位于細胞膜上的酶Ⅱ c相結合。在糖的運輸過程中，PEP上的磷酸基團逐步通過酶Ⅰ、HPr的磷酸化與去磷酸化作用，最終在酶Ⅱ的作用下轉移到糖，生成磷酸糖并釋放于細胞質中。

四、培養基制作技術

培養基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的混合營養料。培養基中應含有滿足微生物生長繁殖的六大營養要素（碳源、氮源、生長因子、無機鹽、水分、能源），且比例適宜。制作培養基時，應配制完畢后立即滅菌，避免雜菌污染和破壞其固有成分和性質。此外，培養基還應具有適宜的酸堿度（pH值）、一定緩沖能力、一定的氧化還原電位和合適的滲透壓等理化條件。

（一）配制培養基的原則

配制培養基應堅持以下原則：培養基組分應適合微生物的營養特點（目的明確）；營養物的濃度與比例應恰當（營養協調）；物理化學條件適宜（理化適宜）；根據營養目的來選擇不同來源的材料（經濟節約）。

1.目的明確

配制培養基之前，先要明確擬培養什么微生物、獲何產物、用途是什么，根據不同的工作目的，選擇適宜的營養物質。

總體而言，所有微生物生長繁殖均需要培養基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水及能源，但由于微生物營養類型復雜，不同微生物對營養物質的需求是不一樣的，因此首先要根據不同微生物的營養需求配制針對性強的培養基。自養型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖類、脂類、蛋白質、核酸、維生素等復雜的有機物，因此培養自養型微生物的培養基完全可以（或應該）由簡單的無機物組成。

2.營養協調

微生物細胞內各種成分之間有相對穩定的比例。在大多數為化能異養微生物配制的培養基中，除水分外，碳源（兼能源）的含量最高，其后依次是氮源、常量元素和生長因子。

C/N是指培養基中所含C原子的摩爾濃度與N原子的摩爾濃度之比。不同的微生物菌種要求不同的C/N，同一種菌在不同生長時期都有不同的要求。C/N是培養基制備的一個重要因素。

一般來講，真菌需C/N較高的培養基（似動物的“素食”），細菌尤其是動物病原菌需C/N較低的培養基（似動物的“葷食”）。

3.理化適宜

影響微生物生長的理化條件主要有pH值、滲透壓、水分活度和氧化還原電位等條件。

（1）pH值　培養基的pH值必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。各類微生物生長繁殖或產生代謝產物的最適pH條件各不相同，細菌適于在pH 6.5～7.5條件下生長，放線菌為pH 7.5～8.5，酵母菌為pH 3.8～6.0，霉菌為pH 4.0～5.8，藻類為pH 6.0～7.0，原生動物為pH 6.0～8.0。

值得注意的是，在微生物生長繁殖和代謝過程中，由于營養物質被分解利用和代謝產物的形成與積累，會導致培養基pH發生變化，若不對培養基pH條件進行控制，往往導致微生物生長速度下降或（和）代謝產物產量下降。因此，為了維持培養基pH的相對恒定，通常在培養基中加入pH緩沖劑，常用的緩沖劑是一氫和二氫磷酸鹽（如K₂HPO₄和KH₂PO₄）組成的混合物。K₂HPO₄溶液呈堿性，KH₂PO₄溶液呈酸性，兩種物質等量混合溶液的pH為6.8。當培養基中酸性物質積累導致H⁺濃度增加時，H⁺與弱堿性鹽結合形成弱酸性化合物，培養基pH不會過度降低；如果培養基中OH^-濃度增加，OH^-則與弱酸性鹽結合形成弱堿性化合物，培養基pH也不會過度升高。

但K₂HPO₄和KH₂PO₄緩沖系統只能在一定的pH范圍（pH 6.4～7.2）內起調節作用。有些微生物，如乳酸菌能大量產酸，上述緩沖系統就難以起到緩沖作用，此時可在培養基中添加難溶的碳酸鹽（如CaCO₃等）作“備用堿”來進行調節，CaCO₃難溶于水，不會使培養基pH過度升高，但它可以不斷中和微生物產生的酸，同時釋放出CO₂，將培養基pH控制在一定范圍內。

在培養基中還存在一些天然的緩沖系統，如氨基酸、多肽、蛋白質等都屬于兩性電解質，也可以起到一定緩沖劑的作用。

（2）滲透壓　是某水溶液中一個可用壓力來度量的理化指標，它表示兩種不同濃度的溶液間若被一個半透性薄膜隔開時，稀溶液中的水分子會因水勢的推動而透過隔膜流向濃溶液，直至濃溶液所產生的機械壓力足以使兩邊水分子的進出達到平衡為止，這時由濃溶液中的溶質所產生的機械壓力，即為滲透壓。滲透壓的大小是由溶液中所含有的分子或離子的質點數決定的，等重的物質，其分子或離子越小，則質點數越多，因而產生的滲透壓就越大。與微生物細胞滲透壓相等的等滲溶液最適宜微生物的生長，高滲溶液會使細胞發生質壁分離，低滲溶液則會使細胞吸水膨脹，直至細胞破裂。

（3）水分活度（a_w）　表示微生物可利用的自由水或游離水的含量，其定義是指在同溫同壓下，某溶液的蒸氣壓（p）與純水蒸氣壓（p₀）之比。各種微生物生長繁殖范圍的a_w值在0.60～0.998。例如：

（4）氧化還原電位　也稱氧化還原電勢，是度量某氧化還原系統中還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標。一般以E_h表示，是指以氫電極為標準時某氧化還原系統的電極電位值，單位是V（伏）或mV（毫伏）。

各種微生物對其培養基的氧化還原電位有不同的要求。一般好氧菌生長的E_h值為+0.3～+0.4V，兼性厭氧菌在+0.1V以上時進行好氧呼吸產能，在+0.1V以下時則進行發酵產能；而厭氧菌只能生長在0～+0.1V的環境中。在實驗室中，為了培養嚴格厭氧菌，除應驅走空氣中的氧外，還應在培養基中加入適量的還原劑，包括巰基乙酸、抗壞血酸、硫化鈉、半胱氨酸、鐵屑、谷胱甘肽、瘦牛肉粒等，以降低它的氧化還原電位。例如，加有鐵屑的培養基，其E_h值可降至-0.40V的低水平。

測定氧化還原電位值除用電位計外，還可使用化學指示劑，例如刃天青等。刃天青在無氧條件下呈無色（E_h相當于-0.40mV）；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH相關，一般在中性時呈紫色，堿性時呈藍色，酸性時為紅色；在微含氧溶液中，則呈現粉紅色。

4.經濟節約

配制培養基時，在能達到相同或相近效果的前提下，要盡可能選擇原料易得、價格便宜、操作簡便的培養基配制方法用于生產，降低成本，例如使用制糖生產廢液、豆粕、米糠、花生餅等原料生產發酵，實現經濟節約。

（二）培養基的類型

培養基常因分類依據不同而類型多樣，實驗中多以成分、物理狀態、用途、生產目的等作為分類依據。

1.根據成分劃分

（1）天然培養基　是指一類利用動、植物或微生物體包括用其提取物制成的培養基，其營養成分復雜、豐富、不穩定，難以說清其化學組成，也稱非化學限定培養基。牛肉膏蛋白胨培養基和麥芽汁培養基就屬于此類。

常用的天然有機營養物質包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米漿、土壤浸液、麩皮、牛奶、血清、豆粕、花生餅、稻草浸汁、胡蘿卜汁等。天然培養基成本較低，除在實驗室經常使用外，也適于用來進行工業上大規模的微生物發酵生產。

（2）合成培養基　是一類按微生物的營養要求精確設計后用多種高純化學試劑配制成的培養基。因由化學成分完全了解的物質配制而成，也稱化學限定培養基，高氏一號培養基和查氏培養基就屬于此類型。配制合成培養基時重復性強，但與天然培養基相比其成本較高，微生物在其中生長速度較慢，一般適于在實驗室用來進行有關微生物營養需求、代謝、分類鑒定、生物量測定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。

（3）半合成培養基　指一類主要以化學試劑配制，同時還加有某種或某些天然成分的培養基。例如，培養真菌的馬鈴薯蔗糖培養基等。

2.根據物理狀態劃分

根據培養基中凝固劑的有無及含量的多少，可將培養基劃分為固體培養基、半固體培養基和液體培養基三種類型。

（1）固體培養基　是一類外觀呈固態的培養基，由液體培養基中加入適量凝固劑配制而成。例如，加有1%～2%瓊脂或5%～12%明膠的液體培養基，就可制成遇熱熔化、冷卻后呈凝固態的用途最廣的固體培養基。

理想的凝固劑應具備以下條件：①不被所培養的微生物分解利用；②在微生物生長的溫度范圍內保持固體狀態，在培養嗜熱細菌時，由于高溫容易引起培養基液化，可在培養基中適當增加凝固劑比例來解決這一問題；③凝固劑凝固點溫度不能太低，否則將不利于微生物的生長；④凝固劑對所培養的微生物無毒害作用；⑤凝固劑在滅菌過程中不會被破壞；⑥凝固劑要具有透明度好、黏著力強等特點；⑦凝固劑配制要使用方便且價格低廉。常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠。表3-8列出瓊脂和明膠的一些主要特性。

對絕大多數微生物而言，瓊脂是最理想的凝固劑，瓊脂是由藻類（海產石花菜）中提取的一種有高度分支的復雜多糖；明膠是由膠原蛋白制備得到的產物，是最早用來作為凝固劑的物質，但由于其凝固點過低，而且某些細菌和許多真菌產生的非特異性胞外蛋白酶以及梭菌產生的特異性膠原酶都能液化明膠，目前已較少作為凝固劑；硅膠是由無機的硅酸鈉及硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時凝聚而成的膠體，它不含有機物，適合配制分離與培養自養型微生物的培養基。

（2）半固體培養基　是在液體培養基中加入少量的凝固劑配制而成，一般添加瓊脂比例為0.2%～0.8%。半固體培養基常用來觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定等。

（3）液體培養基　不加任何凝固劑。在用液體培養基培養微生物時，通過振蕩或攪拌可以增加培養基的通氣量，同時使營養物質分布均勻。液體培養基常用于大規模工業生產以及在實驗室進行微生物的基礎理論和應用方面的研究。

3.根據用途劃分

根據用途不同，將培養基劃分為基礎培養基、加富培養基、鑒別培養基和選擇培養基。

（1）基礎培養基　盡管不同微生物的營養需求各不相同，但大多數微生物所需的基本營養物質是相同的。基礎培養基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養物質的培養基，如牛肉膏蛋白胨培養基是最常用的基礎培養基。基礎培養基也可以作為一些特殊培養基的基礎成分，再根據某種微生物的特殊營養需求，在基礎培養基中加入所需營養物質。

（2）加富培養基　也稱營養培養基，即在基礎培養基中加入某些特殊營養物質制成的一類營養豐富的培養基，這些特殊營養物質包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。加富培養基一般用來培養營養要求比較苛刻的異養型微生物。科研和發酵生產中，加富培養基也可以用來富集和分離某種微生物，這是因為加富培養基含有某種微生物所需的特殊營養物質，該種微生物在這種培養基中較其他微生物生長速度快，逐漸富集形成優勢菌，并淘汰其他微生物，從而容易達到分離該種微生物的目的。從某種意義上講，加富培養基類似選擇培養基，但兩者又存在一定的區別，加富培養基是用來增加所要分離的微生物的數量，使其形成生長優勢，從而分離到該種微生物；選擇培養基則一般是抑制不需要的微生物的生長，使所需要的微生物增殖，從而達到分離所需微生物的目的。

（3）鑒別性培養基　是用于鑒別不同類型微生物的培養基。在培養基中加入能與目的菌的無色代謝產物發生顯色反應的指示劑，從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養基，我們稱作鑒別培養基。鑒別培養基主要用于微生物的快速分類鑒定，以及分離和篩選產生某種代謝產物的微生物菌種。最常見的鑒別培養基是伊紅美藍培養基，即EMP培養基。它在飲用水、牛奶等大腸菌群數細菌學檢驗和大腸桿菌的遺傳學研究中有著重要的用途。EMP培養基成分見表3-9。

EMP培養基中的伊紅、美藍兩種苯胺染料可抑制G⁺細菌和一些難培養的G^-細菌。在低酸度下，這兩種染料會結合并形成沉淀，起著產酸指示劑的作用。因此，試樣中多種腸道細菌會在EMP培養基平板上產生易于用肉眼識別的多種特征性菌落，尤其是大腸桿菌，因其能強烈分解乳糖而產生大量混合酸，菌體表面帶H⁺，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅與美藍結合，故使菌落染上深紫色，從菌落表面的反射光中還可看到綠色金屬光澤（類似金龜子色），其他幾種產酸能力弱的腸道菌的菌落也會有相應的棕色，具體如下：

（4）選擇性培養基　是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養基。根據不同種類微生物的特殊營養需求或對某種化學物質的敏感性不同，在培養基中加入相應的特殊營養物質或化學物質，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長，從而達到選擇分離的目的。

選擇培養基可分為兩種類型：一種類型的選擇培養基是依據某些微生物的特殊營養需求設計的（投其所好）；另一類選擇培養基是在培養基中加入某種化學物質，這種化學物質沒有營養作用，對所需分離的微生物無害，但可以抑制或殺死其他微生物（取其所抗）。

四種常用的選擇培養基如下：

①酵母菌富集培養基　葡萄糖5%，尿素0.1%，（NH₄）₂SO₄ 0.1%，KH₂PO₄ 0.25%，Na₂PO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，FeSO₄·7H₂O 0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉紅0.003%，pH 4.5。

②Ashby 無氮培養基（富集好氧性自生固氮菌用）　甘露醇1%，KH₂PO₄ 0.02%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，NaCl 0.02%，CaSO₄·2H₂O 0.01%，CaCO₃ 0.5%。

③Martin培養基（富集土壤真菌用）　葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，瓊脂2%，孟加拉紅0.003%，鏈霉素30μg/mL，金霉素2μg/mL。

④含糖酵母膏培養基（在厭氧條件下富集乳酸菌用）　葡萄糖2%，酵母膏1%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.02%，pH6.5。

4.根據生產目的劃分

根據培養基用于生產的目的，可以分為種子培養基、發酵培養基。

（1）種子培養基　是為保證發酵工業獲得大量優質菌種而設計的培養基。這種培養基營養較為豐富，氮源比例較高，有時會特意地加入使菌種適應發酵條件的基質。例如味精產生菌北京棒桿菌AS.1299的一級種子（用搖床培養）培養基配方是：葡萄糖3%，玉米漿2.5%，尿素0.5%，K₂HPO₄ 0.1%，MgSO₄ 0.04%，pH 6.7～7.0。二級種子（1200L發酵罐）培養基配方是：用水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分都相同。這樣做既保證了營養要求，又有利于適應下面的發酵條件。

（2）發酵培養基　是為使生產菌種能夠大量生長并能累積大量代謝產物而設計的培養基。其特點是用量特別大，因此對發酵培養基的要求，除了要滿足菌種需要的營養條件外，還要求原料來源廣泛，成本比較低。所以這種培養基的成分一般都比較粗放，碳源的比例較大。例如檸檬酸發酵用的培養基，就只用紅薯粉作原料，濃度高達22%，產酸在14%左右。

除了上述幾類培養基外，還有專門用于培養病毒等寄生微生物的活組織培養基，如雞胚等；專門用于培養自養微生物的無機鹽培養基等。

思考與交流

1.微生物的營養物質有哪些？

2.微生物的營養類型有哪些？

3.培養基有哪些類型？

4.培養基配制原則是什么？