任務六　顯微鏡

任務要求

1.了解顯微鏡的分類

2.掌握普通光學顯微鏡的構造

3.掌握普通光學顯微鏡的使用方法

4.了解普通光學顯微鏡的日常維護方法

顯微鏡是人類微生物科學研究領域最偉大的發明之一。在它發明出來之前，人類對周圍事物的認知只能靠肉眼或者靠放大鏡幫助肉眼觀察，顯微鏡的出現使人類從宏觀世界向微觀世界觀察成為可能，有助于科學家發現新物種和醫生治療部分疾病。

由于微生物個體微小，肉眼看不見或看不清楚，因此必須借助顯微鏡來觀察。熟悉顯微鏡和掌握顯微鏡的操作技術是研究微生物必不可少的方法和手段。而顯微鏡是精密儀器，必須熟悉其構造及各部件的作用，才能真正掌握其使用方法，做到既懂得儀器維護，又敢于放手工作。

一、顯微鏡的種類

現代顯微鏡一般可以分為兩大類：一類是光學顯微鏡；另一類是非光學顯微鏡。光學顯微鏡又分為可見光顯微鏡和不可見光顯微鏡?？梢姽怙@微鏡按照明技術分為明視野、暗視野和熒光顯微鏡；按成像技術分為相差顯微鏡、干涉相差顯微鏡和偏光顯微鏡；按照鏡體結構分為倒置、實體和比較顯微鏡。而不可見光顯微鏡分為紫外、紅外和X射線顯微鏡。非光學顯微鏡分為電子顯微鏡和超聲波顯微鏡，前者又有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡兩種。下面將重點介紹幾種常用的顯微鏡。

（一）普通光學顯微鏡

普通光學顯微鏡是通過目鏡和物鏡兩組透鏡系統組合作用實現放大成像的，故又被稱為復式顯微鏡。普通光學顯微鏡由機械裝置和光學系統兩部分組成。機械裝置包括鏡座、鏡臂、載物臺、調焦螺旋等部件，是顯微鏡的基本組成單位，保證了光學系統的準確和靈活調控。光學系統由物鏡、目鏡、聚光器、光源等組成，直接影響著顯微鏡的性能，是顯微鏡的核心。一般的顯微鏡都可配置多種可互換的光學組件，通過這些組件的變換改變顯微鏡的功能，如明視野、暗視野、相差等。

（二）暗視野顯微鏡

營養態細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清楚，而暗視野顯微鏡則利用特殊的聚光器實現斜射照明，給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品反射或折射后再進入物鏡。因此，整個視野是暗的，而樣品是明亮的，就像白天看不到的星空在黑夜能清楚地顯現一樣，在暗視野顯微鏡中由于樣品與背景之間的反差增大，可以清晰地觀察到在明視野顯微鏡中不易看清的活菌體等透明的微小顆粒。而且，即使所觀察微粒的尺寸小于顯微鏡的分辨率，依然可以通過它們散射的光而發現其存在。因此，暗視野顯微鏡主要用于活細菌運動性的觀察。

（三）相差顯微鏡

光線通過較透明的菌樣時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化，因此用普通光學顯微鏡觀察未經染色的菌體時，其形態結構很難辨別。如果光線通過不同的折射率和厚度的細胞時，直射光和衍射光的光程就會發生改變。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位也會發生改變并產生相位差。相差顯微鏡因配備環狀光闌和相差板等特殊的光學裝置，利用光的干涉現象，就能將光的相位差轉變為人眼可以察覺的明暗差，從而使原來透明的菌體表現出明顯的明暗差異和對比度。從而實現了在不染色的情況下比較清楚地觀察到活細胞及其細胞的細微結構。

（四）熒光顯微鏡

熒光是指熒光素吸收紫外線并轉放出的一部分光波較長的可見光。經紫外線照射，發熒光的物體會在黑暗的背景下表現為光亮的有色物體，這就是熒光顯微鏡的工作原理。由于不同熒光素的激發波長范圍不同，因此同一菌品可以同時用兩種以上的熒光素標記，它們在熒光顯微鏡下經過一定波長的光激發出不同顏色的光，從而達到顯像目的。熒光顯微鏡在免疫學、環境微生物學、分子生物學領域應用廣泛。

（五）電子顯微鏡

由于顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長，波長越短，成像放大倍數越大。因此，用波長極短的電磁波取代可見光來放大成像，可制造出分辨率更高的顯微鏡。1933年，德國人最早制造出世界上第一臺以電子作為“光源”的電子顯微鏡。其工作原理是電子束通過電磁場時發生復雜的螺旋式運動，產生偏轉、匯聚或發散，并同樣可以聚集成像。而一束電子具有波長很短的電磁波的性質，其波長與運動速度成反比，速度越快，波長越短。理論上，電子波的波長最短可達到0.005nm，所以電子顯微鏡的分辨能力要遠高于光學顯微鏡。幾十年來，電子顯微鏡發展迅速，應用也日益廣泛，對包括微生物學在內的許多學科的進步都起到了積極推動作用。

（六）掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡與光學顯微鏡和透射電鏡不同，它的工作原理類似于顯像管電視。電子槍發出的電子束被磁透鏡匯聚成極細的電子“探針”，在菌體表面進行“掃描”，電子束掃到的地方就可激發菌樣表面釋放出二次電子。二次電子產生的多少與電子束入射角度有關，也就是說與樣品表面的立體結構有關。與此同時，在觀察用的熒光屏上另一個電子束也做同步的掃描。二次電子由探測器收集后被閃爍器轉變成光信號，再經光電倍增管和放大器再次轉變成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強度。這樣，菌樣上產生二次電子多的地方，在熒光屏上相應的部位就亮，從而就能得到一幅放大的菌樣立體圖像。

二、普通光學顯微鏡的基本構造

普通光學顯微鏡主要由機械裝置和光學系統兩部分組成。機械裝置包括鏡座、鏡臂、轉換器、載物臺、調焦螺旋等，光學系統包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等。普通光學顯微鏡結構見圖2-44。

（一）機械裝置

（1）鏡座　位于顯微鏡底部，呈馬蹄形，支撐整個顯微鏡。

（2）鏡臂　位于鏡筒后面，為弓形，起支撐鏡筒作用，并且是搬移顯微鏡時握持部位。顯微鏡鏡臂可根據需求改變角度，方便觀察使用。

（3）鏡筒　位于顯微鏡上方，上面安裝目鏡，下面連接轉換器。根據鏡筒個數可分為單鏡筒和雙鏡筒兩種。

（4）物鏡轉換器　位于鏡筒下方，為兩個金屬圓碟合成的一個轉盤，一般有4個圓孔，其可裝配不同放大倍數的物鏡，使物鏡通過鏡筒與目鏡構成完整的放大系統。

（5）載物臺　也叫鏡臺，一般為方形，上面有玻片夾，用于放置和固定標本。載物臺上裝有玻片移動器，可實現標本片的上下左右移動。另外，載物臺中央有一通光孔，光線可以通過通光孔而直射到標本上。

（6）調焦螺旋　又叫準焦螺旋，在顯微鏡的鏡臂上左右各有粗細準焦螺旋一對。粗準焦螺旋，可實現載物臺的快速升降，便于迅速找出圖像；細準焦螺旋，可實現載物臺的細微升降，便于調節清晰圖像。

（二）光學系統

（1）目鏡　安裝在鏡筒上端，用于眼睛直接觀察。目鏡的作用是將由物鏡放大的實像進一步放大，但不增加顯微鏡的分辨率。目鏡上刻有放大倍數，常用的目鏡有10×、16×，鏡中可自裝一條黑色紉絲作為“指針”，用來指示所觀察的部位。根據需要，目鏡內也可安裝目鏡測微尺，經校對后用以測量所觀察物體的大小。

（2）物鏡　安裝在物鏡轉換器下方，用于放大物像。物鏡是決定顯微鏡性能（如分辨率）的最重要的構件。物鏡的作用是將標本第一次放大成倒像。一般顯微鏡常備有4個物鏡，每個物鏡由數片不同球面半徑的透鏡組成。物鏡下端的透鏡口徑越小，鏡筒越長，其放大倍數越高。物鏡分為低倍物鏡和高倍物鏡，其放大倍數一般刻在物鏡鏡頭上，例如4×、10×、40×、100×，分別表示4倍、10倍、40倍和100倍，其中40倍叫高倍物鏡，100倍稱為油鏡。

（3）聚光器　安裝在載物臺下方支架上，主要由聚光鏡和光圈組成。聚光鏡作用是匯聚光線，增加標本的照明。光圈位于聚光鏡下方，由多片金屬片組成，中心圓孔大小可變，以調節光線強弱。另外，升降聚光器也可調節照明強度。在光圈下面，還有一個圓形的濾光片架，可根據鏡檢需要放置濾光片。

（4）光源　光源可以分為燈源和反光鏡反射光兩種。現代顯微鏡多以燈泡作為光源，可通過開關按鈕控制光線強弱。反光鏡安裝在聚光器或轉盤下方，其作用是把光源投射來的光向上反射到聚光器上為觀察標本提供光線。

三、普通光學顯微鏡的使用

（一）顯微鏡的取放

顯微鏡使用時要從鏡箱中取出，取放時注意右手握持鏡臂，左手托住鏡座，保持鏡身直立，切不可用一只手傾斜提攜，防止摔落目鏡。要輕取輕放，放置時注意鏡臂朝向自己，距桌邊沿5～10cm。擺放顯微鏡的桌子要求平穩，桌面清潔，避免陽光直射。

（二）顯微鏡使用方法

1.開啟光源

打開電源開關，通過開關按鈕調節光線強弱。

2.放置載玻片標本

將待鏡檢的載玻片標本放置在載物臺上用玻片夾固定，移動標本正對通光孔中央。

3.低倍物鏡觀察

用顯微鏡觀察標本時，應遵循“先低倍再高倍”的原則。先用低倍物鏡找到物像，因為低倍物鏡觀察范圍大，較易找到物像，且容易找到要作精細觀察的部位。具體操作如下：

（1）轉動粗準焦螺旋，用眼從側面觀望，使載物臺快速上升，直到低倍物鏡距標本0.5cm左右停止。

（2）眼睛接近目鏡觀察，用手慢慢轉動粗準焦螺旋，使載物臺緩慢下降，直到視野內的物像較清晰為止。然后改用細準焦螺旋，調節至物像清晰。

（3）前后左右輕移載玻片位置，在視野中找到要觀察的部位。注意視野中的物像為倒像，移動載玻片時應向相反方向移動。

4.高倍物鏡觀察

在低倍觀察基礎上，轉動轉換器至高倍物鏡，進行高倍觀察。具體操作如下：

（1）將欲觀察的部位移至低倍鏡視野正中央，物像要清晰。

（2）旋轉物鏡轉換器，使高倍物鏡移到卡槽位置上，利用物鏡鏡頭的等焦性微調細準焦螺旋，使物像清晰。

（3）再次移動載玻片標本找到欲觀察的部位。

5.換片

觀察完畢，如需換用另一載玻片標片時，將物鏡轉回低倍物鏡，取出玻片，更換新片，稍加調焦，即可觀察。

6.整理

顯微鏡使用結束后，下降載物臺至最低處，取下載玻片標本，清潔顯微鏡，把物鏡轉動呈“八”字形或置于最低倍物鏡下，并調節玻片夾至適當位置，使物鏡不會碰到。最后，套上專用防塵罩，并將顯微鏡放回指定位置。

四、普通光學顯微鏡使用注意事項

（1）顯微鏡是精密儀器，使用時必須按照操作規程，做到細心和耐心，切勿操之過急，動作過猛，以防操作失誤而損壞構件。

（2）不要用手觸摸顯微鏡光學玻璃部件，注意保持玻璃表面清潔。

（3）觀察時載玻片要加蓋蓋玻片，注意防止載玻片上的水流到載物臺上，更不要讓酸、堿等腐蝕性化學藥品接觸顯微鏡。

（4）使用細準焦螺旋微調時，如遇到不能繼續向同一方向轉動而到達極限時，不能蠻轉，應向相反方向轉動粗準焦螺旋，然后再用細準焦螺旋進行微調。

（5）使用高倍物鏡時，由于物鏡與標本之間距離很近，因此要特別仔細，調焦時不能用粗準焦螺旋，只能用細準焦螺旋。

（6）目鏡、物鏡如有不潔時，使用擦鏡紙作直線方向擦拭，切勿用手指或手帕及棉布涂擦。目鏡或物鏡如沾有油污，可先用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭干凈，再用干凈擦鏡紙擦拭。

（7）換片時千萬不可在高倍物鏡下操作，以防損壞鏡頭。

（8）觀察時坐姿要端正，雙目并開，可兩眼輪換觀察以減輕疲勞。如需要繪圖，一般用左眼觀察標本，右眼看圖紙，這樣有利于提高工作效率。

（9）顯微鏡使用完畢，用擦鏡紙清潔鏡頭，將各部分還原，并使低倍物鏡轉至中央或者將物鏡轉動呈“八”字形，下降載物臺，套上防塵罩，放回箱內。

思考與交流

1.依據顯微鏡的分類，普通光學顯微鏡應屬于明視野還是暗視野顯微鏡？為什么？

2.自行查閱資料，了解為什么觀察細菌時要滴加香柏油。