1.2　堆肥過程胡敏酸與富里酸結構演變規律

1.2.1　堆肥過程胡敏酸與富里酸含量變化

腐植酸可作為電子受體接受微生物進行腐殖質呼吸時產生的電子，并促進微生物的生長^［14］，因此，腐植酸含量及組成對腐殖質還原菌種群結構必然產生影響。由圖1-5（a）可見，堆肥過程中腐植酸的含量總體呈上升趨勢，然而不同物料變化規律不完全相同。堆肥過程雞糞、牛糞及污泥中腐植酸含量上升速率較快，到高溫期分別增加了27.5%、32.2%和33.1%；而果蔬、雜草和秸稈分別增加了3.5%、16.9%和15.2%；枯枝變化趨勢與其他物料呈相反趨勢，其腐植酸含量降低了32.7%。由此可以推測，在升溫期，纖維素及木質素類物料不利于腐植酸的合成，而蛋白質含量較豐富的物料在堆肥的初期階段更易形成腐植酸，腐殖質還原菌數量有可能會隨之升高。在高溫期，不同物料腐植酸含量均呈明顯上升趨勢，說明堆肥后期是形成腐植酸的主要階段。

作為腐植酸的重要組成部分，胡敏酸的變化趨勢與腐植酸基本相同，其濃度隨堆肥過程呈增加趨勢，見圖1-5（b）。富里酸與之不同，在果蔬、雜草、秸稈及枯枝中總體上其含量呈降低趨勢，見圖1-5（c）。但在雞糞、牛糞及污泥中，富里酸呈先升高后降低的趨勢，這說明在蛋白類物料的升溫期，富里酸較易形成，但隨堆肥腐殖化進行，含量隨之降低^［15］。

1.2.2　堆肥過程胡敏酸與富里酸結構演變規律

1.2.2.1　堆肥胡敏酸與富里酸的紫外光譜特征

（1）SUVA₂₅₄

有機物在254nm下的紫外吸收代表具有不飽和碳碳鍵的芳香族化合物，記為SUV。在相同的碳濃度下，該波長下吸光度的增加，意味著非腐植酸向腐植酸的轉化，SUVA₂₅₄可用于表征有機質的芳構化程度，其值越高，芳構化程度越高。如圖1-6（a）、圖1-7（a）所示，胡敏酸與富里酸中SUVA₂₅₄隨堆肥的進行而升高，表明堆肥過程中腐植酸的芳香化程度不斷增加。與堆肥初期相比，雞糞、牛糞、果蔬、雜草、枯枝、秸稈及污泥中胡敏酸濃度在堆肥過程中分別增加了8.2%、17.3%、20.4%、30.3%、39.3%、23.8%及18.6%；富里酸濃度在堆肥過程中分別增加了12.5%、13.8%、12.8%、8.6%、7.2%、9.5%及12.3%。表明堆肥過程中，非腐植酸類物質不斷轉化為腐植酸類物質，堆肥的穩定度也有一定程度的增加。堆肥過程中有機質變化過程包括降解與腐殖化，隨著堆肥中有機質的逐漸降解，形成富里酸，然而到高溫期，部分功能基團與有機組分如多酚、羧基、富里酸被逐漸降解，從而堆肥的腐植酸逐漸增加。胡敏酸SUVA₂₅₄在果蔬、雜草、枯枝及秸稈的增加量要略高于雞糞、牛糞及污泥，說明纖維素類、木質素類物料在堆肥過程中的腐殖化程度要高于蛋白類物料。Zhao等^［17］認為堆肥腐植酸主要由纖維素、木質素類物質的不完全降解產物及氨基酸結合而成，因此，隨著堆肥過程中木質素及纖維素類物質的不斷降解縮合，堆肥腐殖化程度逐漸增加，致使其吸光度逐漸增大。

（2）E₄/E₆

E₄/E₆是一個用來表征苯環碳骨架縮合度、芳香化合物的聚合度、分子量大小以及腐殖化程度的傳統參數，該值與有機質縮合度呈反比^［18］。由圖1-6（b）可知，該值在雞糞、牛糞、果蔬、雜草、枯枝、秸稈及污泥堆肥過程中呈降低趨勢，說明胡敏酸的縮合程度隨堆肥過程逐漸增加。該值在纖維素類物料（果蔬和雜草）中降低了9.83和10.47，說明苯環碳骨加縮合度、芳香化合物的聚合度及分子量最高。如圖1-7（b）所示，富里酸中E₄/E₆在不同物料分別降低了3.06、3.77、5.06、5.77、2.05、6.22及7.19，其中，雞糞、牛糞和污泥在堆肥高溫期E₄/E₆降低明顯，在腐熟期變化較為平緩；果蔬、雜草、枯枝及秸稈則在堆肥過程中呈持續降低的趨勢。說明蛋白質類物料堆肥過程中官能團的縮合主要發生在高溫期，而纖維素、木質素類物料的腐殖化過程則發生在整個堆肥過程中。這主要是由于蛋白類物料在堆肥前期較易降解，微生物活動較強，加速了堆肥前期的腐殖化過程，而纖維素、木質素類物料與之相反，微生物活動較弱，隨著堆肥溫度上升，適應堆肥環境較為緩慢，物質分解與轉化速率相對較弱^［19］。

（3）A_226-400

在有機質的紫外吸收光譜中，226～400nm下的吸收帶是由具有多個共軛體系的苯環結構引起的，這一范圍基本反映了有機質的吸收光譜特性，可從整體上研究堆肥胡敏酸、富里酸的苯環類化合物及芳構化程度的變化^［20］。本研究分別對胡敏酸與富里酸在226～400nm范圍內的吸光度進行積分，結果如圖1-6（c）所示，該值在雞糞、牛糞、果蔬、雜草、枯枝、秸稈及污泥中分別增長了9.8%、17.1%、32.4%、38.5%、45.0%、24.4%和16.5%，說明隨著堆肥的進行，胡敏酸中苯環類化合物不斷增多。纖維素、木質素類物料（果蔬、雜草、枯枝及秸稈）的增加量明顯高于蛋白類（雞糞、牛糞）與污泥，說明纖維素、木質素類物料的腐殖化的速率要高于蛋白類物料。A_226-400在富里酸中呈現出相同趨勢［圖1-7（c）］。與堆肥初期相比，雞糞、牛糞及果蔬的增加量最高，分別增加了14.0%、14.6%及12.6%，明顯高于雜草（3.6%）、秸稈（6.7%）、枯枝（4.9%）及污泥（7.2%）。這是由于在雞糞、牛糞、果蔬中微生物繁殖迅速，降解速率快，進而促進堆肥過程的芳香化及腐殖化程度^［8］。

（4）S_R

S_R是一類表征有機質分子量的重要參數，并與分子量呈反比。堆肥過程中S_R呈降低趨勢，說明隨著堆肥進行，腐植酸的分子量逐漸增大^［21］。如圖1-6（d）所示，該值在雞糞、牛糞、果蔬、雜草、枯枝、秸稈及污泥的堆肥過程呈階段性降低，分別降低了0.11%、0.26%、0.40%、0.29%、0.34%、0.32%及0.26%，說明堆肥過程中胡敏酸分子量呈逐漸升高的趨勢。其中，雜草在高溫階段出現顯著降低，說明該物料的分子量在堆肥的高溫期變化劇烈。不同物料中富里酸在堆肥升溫期差異較為顯著［圖1-7（d）］，在雞糞、牛糞和污泥中，其值隨堆肥過程呈顯著降低（0.74、0.52和0.61），明顯高于果蔬（0.16）、雜草（0.09）、枯枝（0.35）及秸稈（0.26），說明蛋白類物料在堆肥過程中富里酸分子量的增加量明顯高于纖維素及木質素類物料。

（5）SUVA₂₉₀

紫外光譜參數SUVA₂₉₀能夠表示堆肥過程中醌基的含量^［22］。如圖1-6（e）所示，雞糞、牛糞和污泥中醌基含量在堆肥過程中持續上升，說明蛋白類物料中胡敏酸中醌基含量逐漸增多；而醌基含量在果蔬、雜草、枯枝及秸稈中則呈先升高后降低的趨勢，這是由于在堆肥后期，纖維素、木質素類物料中游離的醌基之間或與活性自由基發生縮合，形成胡敏酸從而減少了醌基的含量^［1，8］。

圖1-7（e）為不同物料堆肥過程中富里酸中醌基含量的變化趨勢，與胡敏酸不同，堆肥過程明顯增加了富里酸中醌基的含量，不同物料增加量從大到小依次為：枯枝（0.06）>秸稈（0.16）>雜草（0.20）>果蔬（0.28）>污泥（0.34）>牛糞（0.40）>雞糞（0.17）。由此可見，木質素堆肥過程中醌基的增加量最高，其次為纖維素類，蛋白類物料最低。研究表明，堆肥過程中木質素降解產生芳香碳，芳香碳能進一步氧化成醌基，這些醌基與氨基酸等縮合形成胡敏酸與富里酸^［8］，因此，物料差異對堆肥過程腐植酸中醌基含量影響較為顯著。

1.2.2.2　堆肥胡敏酸與富里酸的熒光光譜特征

為研究堆肥過程中腐植酸的組成結構與變化規律，采用平行因子分析方法對胡敏酸及富里酸的熒光光譜進行解析。堆肥腐植酸由4個熒光成分組成，如圖1-8所示，根據已有文獻表明，C1［（E_m/E_x）/nm，410/326］為類富里酸物質^［23］；C2［（E_m/E_x）/nm，350/（215，280）］與C4［（E_m/E_x）/nm，300/（225，275）］為類蛋白類物質，其中C2為類酪氨酸類物質^［24］，該峰不僅與酪氨酸類物質相關，還與可溶性微生物代謝副產物和苯環類物質有關^［25］，C4為色氨酸類物質^［26］，它們既可以以游離態存在，也可以與蛋白質結合；C3［（E_m/E_x）/nm，465/（275，365）］為類胡敏酸物質^［27］。

基于熒光光譜-平行因子分析，根據熒光組分得分值F_max變化，得到胡敏酸、富里酸在堆肥過程中結構及組分的變化（表1-1）。根據EEM-PACAFAC結果可知，在堆肥的升溫期，類色氨酸組分（C4）含量最高，隨著堆肥的進行該熒光組分所占比例有所降低（雞糞與牛糞中胡敏酸除外），而類富里酸物質（C1）與類胡敏酸的熒光組分所占比例呈增加趨勢。這是由于色氨酸類的微生物可利用性較強，隨著堆肥進行，胡敏酸與富里酸中類蛋白類組分隨微生物降解其百分含量逐漸降低，逐漸轉化為類富里酸和類胡敏酸類物質^［28］。雞糞與牛糞在堆肥腐熟期形成的胡敏酸中仍含有類蛋白類組分，并且類胡敏酸與類富里酸的含量無明顯增加，說明此蛋白類物料中胡敏酸的腐殖化程度相對其他物料較低。類富里酸與類胡敏酸是結構較為穩定的組分，這源于堆肥過程微生物對木質素與纖維素類物質的降解^［29］。類酪氨酸類物質（C2）在堆肥過程中無明顯變化。

1.2.2.3　堆肥腐植酸的核磁共振波譜特征

（1）¹³C-NMR（¹³C-核磁共振）波譜

為比較胡敏酸不同碳核分布，將掃描光譜分為以下4區：0～50ppm（1ppm=10^-6，下同）為脂肪碳（¹³C-NMR1）；50～110ppm為多羥基碳（¹³C-NMR2）；110～160ppm為芳香碳及酚類碳（¹³C-NMR3）；160～220ppm為羧基碳（¹³C-NMR4）^［30］。7種物料堆肥過程中胡敏酸的¹³C-NMR波譜如圖1-9所示，根據其圖譜出峰位置與形狀可將7種堆肥胡敏酸分為兩類：雞糞、牛糞、果蔬、雜草、枯枝、秸稈與污泥。7種堆肥在0～50ppm范圍內均呈現一系列的共振信號，如在18ppm、22ppm、29ppm、40ppm、45ppm均有清晰可見的吸收峰，這可能是由于—CH₃、—CH₂等基團片斷的吸收引起的^［31］。在50～110ppm范圍內為多羥基碳、連氧碳和連氮碳的特征吸收^［32］，從圖中可以看出，堆肥過程中存在大量的羥基碳與氨基酸，它們也是腐植酸形成的重要功能基團。110～160ppm范圍內的共振信號是7種堆肥過程中共有的特征吸收峰，表明這7種堆肥胡敏酸都含有芳香碳及酚類碳。在170～185ppm之間的共振吸收是酯、羧酸、醌、酮中羰基碳的貢獻^［33］，普遍存在于7種堆肥過程中。研究表明，雖然受NOE（歐沃豪斯）效應飽和作用的影響，譜峰面積與其所代表的含碳數不完全成正比，但在相同條件下，記錄的質子噪聲去偶碳譜可定性地比較不同堆肥過程中胡敏酸中碳的相對百分含量^［34］。

如表1-2所列，7種物料胡敏酸中的脂肪族碳含量隨堆肥過程呈遞減趨勢，而芳香碳與酚類碳含量則呈升高趨勢。這說明堆肥過程中，脂肪族基團逐漸被微生物降解，而胡敏酸結構單元逐漸形成。其中，胡敏酸中脂肪族含量按照雞糞、牛糞、污泥、果蔬、雜草、秸稈及枯枝的次序遞減，分別降低了18.5個百分點、17.4個百分點、13.45個百分點、9.13個百分點、6.34個百分點、5.42個百分點和0.10個百分點，說明蛋白質類物料中的脂肪碳的降低量最多，其次為纖維素類物料，這是由堆肥中脂肪族碳初始含量的差異引起的。多羥基碳在不同物料堆肥過程中變化趨勢并不一致，其中雞糞、牛糞在堆肥過程中多羥基碳呈降低趨勢，分別降低了7.33個百分點、3.42個百分點，而果蔬、雜草、枯枝、秸稈、污泥堆肥中則分別增加了15.36個百分點、5.25個百分點、1.14個百分點、6.51個百分點、5.41個百分點。這說明蛋白類物料中胡敏酸的芳香碳與酚基碳主要源于脂肪族碳與羥基碳的降解，而纖維素與木質素類中芳香碳主要源于脂肪族碳的降解。不同物料芳香碳含量均有不同程度的升高，雞糞、牛糞、果蔬、雜草、秸稈、枯枝、污泥分別升高了16.6個百分點、17.1個百分點、12.2個百分點、21.8個百分點、15.6個百分點、5.0個百分點、5.0個百分點。不同物料中羧基碳含量變化趨勢不同，其中，雞糞、牛糞、污泥的胡敏酸中羧基碳分別增加了9.3個百分點、3.8個百分點、3.0個百分點，而果蔬、雜草、枯枝、秸稈分別降低了18.4個百分點、20.7個百分點、6.1個百分點、16.70個百分點。表明纖維素與木質素類物料更易發生芳基化，而羧基化普遍存在于蛋白類物料的胡敏酸形成過程中。

（2）¹H-NMR波譜

7種堆肥過程中富里酸的¹H-NMR波譜如圖1-10所示。¹H-NMR的化學位移主要分為3個區^［35］。

①0.5～3.1ppm范圍內的吸收主要是脂肪鏈上氫的貢獻，圖中可明顯看到此范圍內的吸收峰，其中δ=0.80ppm、0.86ppm、0.87ppm的吸收峰為脂肪鍵上甲基的吸收峰；δ=1.21ppm、1.22ppm、1.24ppm的吸收峰為亞甲基、距離芳香環兩個碳以上的CH或極性官能團的吸收峰。

②3.1～5.5ppm區，該區為連氧（或氮）碳上的H（主要為多糖、有機胺、含甲氧基類物質）以及脂環芳族H的吸收，富里酸在堆肥過程中均呈現出寬而強的共振信號，并且在4.50～4.75ppm處有尖銳強峰，該范圍內的吸收可能是樣品中—OH、—COOH、NH等活潑氫及溶劑中微量水造成的^［36］。

③富里酸在6.0～10.0ppm范圍內可觀察到形狀各異的共振信號，該范圍為芳香族化合物中H的信號，包括醌、苯酚、含氧或含氮或含氮雜環芳香化合物、甲酸鹽及其他具有空間位阻的芳香氫的貢獻^［37］。

本研究中各組分在3個化學位移區均存在不同程度的吸收，根據圖1-10各吸收區域的峰的面積，計算了各類氫的相對含量，結果列于表1-2。化學位移在0.5～3.1ppm范圍內的含量呈現出明顯降低趨勢，雞糞、牛糞、果蔬及污泥分別降低了50.7個百分點、37.6個百分點、21.4個百分點及21.9個百分點，而枯枝、雜草、秸稈在堆肥過程中的變化量小于10個百分點。部分物料在3.1～5.5ppm區間的百分含量呈現出先上升后下降的趨勢。在高溫期，雞糞、牛糞、污泥含量分別升高了20.3個百分點、29.6個百分點、26.5個百分點，其次為果蔬（2.9個百分點）與雜草（9.4個百分點），而枯枝與秸稈與之相反。由此可以推測，在雞糞、牛糞與污泥中升高的這一部分碳水化合物、含氧甲基類物質的含量是脂肪族鏈上氫的斷鏈而形成的^［38］；而枯枝、秸稈、果蔬、雜草中脂肪族氫含量在升溫期含量較少，轉化量低，到達腐熟期才呈現出明顯的降低趨勢。7種物料中富里酸在6.0～10.0ppm范圍內的含量均有明顯升高，分別升高了61.3個百分點（雞糞）、71.5個百分點（牛糞）、76.6個百分點（果蔬）、35.8個百分點（雜草）、50.4個百分點（枯枝）、70.7個百分點（秸稈）及47.9個百分點（污泥），說明堆肥過程中隨著脂肪結構及聚亞甲基鏈結構的破壞，一部分生成了醌基，苯酚及含氧、含氮等雜環芳香化合物^［39］。