第4章　核酸化學(xué)

4.1　復(fù)習(xí)筆記

一、核酸的類別、分布和組成

1類別

核酸分核糖核酸RNA與脫氧核糖核酸DNA。RNA中又分mRNA、tRNA和rRNA三種，此外還有許多其他種類的RNA。

2分布

DNA主要存在于細(xì)胞核的染色質(zhì)（chromatin）中，線粒體和葉綠體中也有。90%的RNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，10%存在于細(xì)胞核中，rRNA主要存在于核糖體內(nèi)。

DNA和RNA核糖和嘧啶是有區(qū)別的。它們的組分區(qū)別如表4-1所示。

表4-1　RNA與DNA組分上的區(qū)別

3組成

（1）核糖及脫氧核糖

表4-2　RNA與DNA的組成與鑒定

（2）嘌呤堿

嘌呤堿為核酸中的嘌呤類物質(zhì)，主要為腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）兩種，次黃嘌呤、黃嘌呤與尿酸是腺嘌呤的代謝產(chǎn)物。

（3）嘧啶堿

嘧啶堿為核酸中的嘧啶類物質(zhì)，核酸中存在的嘧啶堿有胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）及胸腺嘧啶（T）3種。DNA含胸腺嘧啶，RNA含尿嘧啶。

二、核苷與核苷酸

用核酸酶水解核酸可得到核苷酸，核苷酸經(jīng)核苷酸酶水解又產(chǎn)生核苷和磷酸。核苷酸為核酸的組成單位，核苷和磷酸是組成核苷酸的基本物質(zhì)。

圖4-1　核酸、核苷酸的化學(xué)組成

1核苷

核苷是由嘧啶和嘌呤與核糖或脫氧核糖相連組成的，嘌呤核苷是第9位氮與核糖或脫氧核糖第1′位碳相連，嘧啶核苷則由嘧啶第1位氮與糖第1′位碳相連。天然的核酸中只有5′-核糖磷酸。

表4-3　核苷的類別

2核苷酸

核苷酸是核苷的磷酸酯，由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖和磷酸所組成。含核糖的核苷酸稱核（糖核）苷酸，含脫氧核糖的核苷酸稱脫氧核（糖核）苷酸。

表4-4　核苷酸的類別

（1）核苷酸的結(jié)構(gòu)

核苷酸分子中糖基與磷酸基的連接方式為核糖基的第2′、3′和5′碳位上的自由羥基，分別與磷酸連接可生成3種核糖-磷酸酯異構(gòu)體。

此外還有環(huán)式結(jié)構(gòu)如環(huán)腺苷酸（cAMP）和環(huán)鳥苷酸（cGMP）。

（2）核苷酸的性質(zhì)

①一般物理性質(zhì)

核苷酸為無色粉末或結(jié)晶，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，具有旋光性，在酸性溶液中不穩(wěn)定，在中性及堿性溶液中很穩(wěn)定。

②互變異構(gòu)現(xiàn)象

凡堿基上有酮基的核苷酸都有酮式和烯醇式的互變異構(gòu)現(xiàn)象。酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體常同時(shí)存在，并處于一定的平衡狀態(tài)。在體內(nèi)核酸結(jié)構(gòu)中酮式占優(yōu)勢(shì)，這對(duì)于核酸分子中氫鍵的形成是很重要的。

③紫外吸收

由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，所以堿基、核苷及核苷酸在260nm附近有最大吸收峰。

④核苷酸的兩性解離和等電點(diǎn)

核苷酸分子既含磷酸基，又含堿基，是兩性電解質(zhì)，有等電點(diǎn)。

（3）核苷酸重要的衍生物

①ATP類的高能磷酸化合物：核苷二磷酸和核苷三磷酸。

②輔酶核苷酸：如尿苷-5′-二磷酸葡糖（UDPG）在代謝中作為輔酶以供給葡萄糖；煙酰胺核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸和輔酶A等都參加氧化還原和其他代謝。

③核苷多磷酸和寡核苷多磷酸類化合物。

三、DNA的結(jié)構(gòu)

1DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA分子中核苷酸之間的連接方式和核苷酸的序列。

（1）DNA分子中核苷酸之間的連接方式

核苷酸的連接方式是由一個(gè)核苷酸脫氧核糖第5′的磷酸與另一核苷酸脫氧核糖第3′位的-OH相連成3′，5′-磷酸二酯鍵，沒有支鏈。核苷酸鏈堿基的順序是5′→3′。

（2）與DNA結(jié)構(gòu)研究有關(guān)的工具酶

與DNA研究有關(guān)的工具酶如表4-5所示。

表4-5　與DNA研究有關(guān)的工具酶

（3）DNA分子中核苷酸的序列

①化學(xué)斷裂法

化學(xué)斷裂法利用一種多核苷酸激酶在被測DNA樣品的5′端羥基上標(biāo)記³²P，然后根據(jù)堿基所在位置分為G、G＋A、T＋C和C 4組，采用不同專一性試劑修飾堿基，使每組樣品在其特定堿基位斷裂，即得長度不同的核苷酸片段。

②鏈終止法

鏈終止法又稱雙脫氧法或酶法，是用2′,3′-雙脫氧核苷三磷酸（2′,3′-ddNTP）為核苷酸鏈合成的抑制劑，根據(jù)DNA復(fù)制原理制備各種核苷酸片段。從互補(bǔ)鏈的核苷酸序列，即可推知被測核酸的核苷酸序列。

③DNA測序的新方法

DNA雜交法（sequencing by hybridization，SBH）、MALDI-TOF質(zhì)譜法、掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）和原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）。

2DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)

通過用X射線衍射法研究DNA，Watson與Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

大多數(shù)天然DNA是雙鏈DNA，也有單鏈、三鏈和四鏈的DNA。

（1）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

雙螺旋結(jié)構(gòu)式DNA的經(jīng)典模型結(jié)構(gòu)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)的下列特點(diǎn)：

①兩條反向平行的多核苷酸鏈形成右手雙螺旋，它們平行地圍繞同一個(gè)中心軸盤繞。

②DNA的兩條多核苷酸鏈之間有兩條螺旋形的凹槽，一條深而且寬，稱為大溝，另一條淺而且窄，稱為小溝。這些溝對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的相互識(shí)別是很重要的。

③堿基位于螺旋的內(nèi)部，脫氧核糖和磷酸位于螺旋的外側(cè)，它們組成多核苷酸鏈的骨架。

④雙螺旋的直徑是2nm，兩個(gè)相鄰的堿基對(duì)之間的距離為0.34nm，每10個(gè)核苷酸形成螺旋的一轉(zhuǎn)。

⑤兩條多核苷酸鏈由堿基對(duì)之間的氫鍵相連，A與T配對(duì)形成兩個(gè)氫鍵；G與C配對(duì)形成三個(gè)氫鍵。這種堿基之間的配對(duì)關(guān)系稱作堿基互補(bǔ)。

⑥堿基互補(bǔ)具有重要的生物學(xué)意義，它是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)。

（2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定的，穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的主要有3種作用力。包括：

①氫鍵

A與T相配對(duì)，形成2個(gè)氫鍵；G與C相配對(duì)，形成3個(gè)氫鍵；G與C配對(duì)更穩(wěn)定，DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與G＋C的百分含量成正比。

②堿基堆積力

堿基形狀扁平，疏水，分布于螺旋的內(nèi)側(cè)，大量鄰近堿基對(duì)的堆積，使其內(nèi)部形成一個(gè)強(qiáng)大的疏水區(qū)，與介質(zhì)的水分子隔開，這種現(xiàn)象稱疏水作用。

③離子鍵

磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中陽離子之間形成的離子鍵，可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力。

（3）DNA雙螺旋的種類

①右手螺旋DNA

用X射線衍射分析研究DNA結(jié)構(gòu)時(shí)，因DNA鈉鹽纖維樣品相對(duì)濕度或鹽的種類等條件不同，雙螺旋結(jié)構(gòu)的特征也不相同，通常用A、B、C 3種類型，均為右手螺旋。

表4-6　不同類型右手DNA雙螺旋比較

②左手螺旋DNA

左手螺旋DNA分子中磷原子的走向?yàn)殇忼X形，因而被稱為Z-DNA。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：

a．左手螺旋DNA分子中每12個(gè)核苷酸組成一個(gè)左手螺旋，比右手螺旋DNA的直徑略細(xì)。

b．堿基對(duì)偏離螺旋軸心而比較靠近螺旋分子外表，呈現(xiàn)堿基比較暴露的狀態(tài)。

c．小溝深窄，大溝平坦而不明顯。

d．Z-DNA中的鳥嘌呤為順式，核糖的C-3′外露，而右手螺旋DNA分子中的鳥嘌呤為反式，核糖C-2′為外露。

（4）DNA的三鏈結(jié)構(gòu)和四鏈結(jié)構(gòu)

①三鏈DNA

三螺旋DNA是在雙螺旋DNA的大溝中插入第三條鏈，從而形成三股螺旋，有Py型和Pu型兩種類型。

②四鏈DNA

X射線衍射和核磁共振的研究表明，合成序列（T/A）m Gn（m＝1～4，n＝1～8）的單鏈DNA中4個(gè)鳥嘌呤可通過Hoogsteen堿基配對(duì)，形成分子內(nèi)或分子間的四螺旋結(jié)構(gòu)，其基本結(jié)構(gòu)單元是鳥嘌呤四聯(lián)體。

3DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步扭曲、折疊而形成。

（1）超螺旋結(jié)構(gòu)

環(huán)狀DNA分子的雙螺旋多轉(zhuǎn)幾圈后產(chǎn)生額外張力使DNA內(nèi)部使原子的位置重排，DNA發(fā)生扭曲，這種DNA雙螺旋的扭曲為超螺旋。

雙鏈環(huán)狀DNA可形成共價(jià)閉環(huán)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)和開環(huán)DNA等三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種最常見形式。

（2）超螺旋的分類

①負(fù)超螺旋

放松DNA雙螺旋形成的超螺旋為負(fù)超螺旋，自然界存在的超螺旋DNA分子絕大多數(shù)是負(fù)超螺旋，負(fù)超螺旋有利于DNA的解鏈，在DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中具有重要意義。

②正超螺旋

旋緊DNA雙螺旋形成的超螺旋為正超螺旋。

4真核細(xì)胞染色體DNA的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

真核生物形成高度有序和高度致密的結(jié)構(gòu)——染色體。

（1）有重復(fù)序列

真核細(xì)胞染色體DNA中有許多重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸序列，為重復(fù)序列。除酵母以外的真核細(xì)胞都有重復(fù)序列，原核細(xì)胞中不存在重復(fù)序列。根據(jù)重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)不同，分為高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列和單一序列。

①高度重復(fù)序列

高度重復(fù)序列是指在整個(gè)基因組中重復(fù)的次數(shù)很高，大于10⁵的重復(fù)序列，對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

②中度重復(fù)序列

中度重復(fù)序列在整個(gè)基因組中重復(fù)次數(shù)為10～10⁵。中度重復(fù)序列的DNA通常作為基因用，如rRNA基因、tRNA基因、組蛋白基因和免疫球蛋白基因等都屬于中度重復(fù)序列。

③單一序列

單一序列，又稱單拷貝基因，是指在整個(gè)基因組中只出現(xiàn)1次或少數(shù)幾次的序列。單一序列是作為基因用，絕大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、卵清蛋白和絲心蛋白等）或酶的結(jié)構(gòu)基因?qū)儆趩我恍蛄小?/p>

（2）回文序列

回文序列又稱反向重復(fù)序列，回文序列變性和復(fù)性后可形成十字形結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中均有，與DNA和蛋白質(zhì)之間的識(shí)別有關(guān)。

四、RNA的結(jié)構(gòu)

表4-7　mRNA、tRNA和rRNA的結(jié)構(gòu)

1RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

（1）RNA分子中核苷酸之間的連接方式

RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)指核苷酸之間的連接方式和核苷酸的序列。RNA分子中核苷酸之間的連接方式是通過3′,5′-磷酸二酯鍵相連，形成有一個(gè)5′端和一個(gè)3′端的無支鏈RNA長鏈結(jié)構(gòu)。

（2）RNA分子中核苷酸的序列

常用的RNA分子中核苷酸的序列測定方法有：

①用專一性核糖核酸酶裂解RNA

用各種堿基專一的核糖核酸酶分別將RNA部分水解，得到長度不一的核苷酸片段，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后即可讀出RNA的序列。

②用化學(xué)試劑裂解RNA

同DNA序列測定的化學(xué)斷裂法。

③逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

先用逆轉(zhuǎn)錄酶（又稱RNA指導(dǎo)的DNA多聚酶），將被測RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），然后按照測DNA序列的化學(xué)斷裂法或鏈終止法進(jìn)行序列測定的。

（3）降解RNA的核酸酶

降解RNA的核酸酶稱核糖核酸酶，這是一類水解RNA的酶。常見的具有專一性的有RNaseⅠ和RNaseT₁。非專一性核酸酶類如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一性核糖核酸酶RNaseⅠ和RNaseT₁的功能如表4-8所示：

表4-8　RNaseⅠ和RNaseT₁的功能特性

（4）RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

①tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

tRNA為單鏈多聚核苷酸，核苷酸之間以3′,5′磷酸二酯鍵相連。主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有：

a．相對(duì)分子質(zhì)量很小。

b．各種tRNA的鏈長很接近，一般在73～93個(gè)核苷酸之間。

c．各種tRNA中約有20多個(gè)位置上的核苷酸是不變和半不變的。

d．各種tRNA的3′端都為CCA，這是接受氨基酸的一端；5′端大多數(shù)為pG，少數(shù)為pC。

e．tRNA含有較多的修飾成分。

②rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

rRNA是指核糖體RNA，其一級(jí)結(jié)構(gòu)是由3′,5′-磷酸二酯鍵相連的多核苷酸核糖體，由大小兩個(gè)不同亞基組成。rRNA中修飾堿基的含量比tRNA少得多，但有甲基化核苷的存在。

③mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

mRNA為單鏈多聚核苷酸，核苷酸之間以3′,5′磷酸二酯鍵相連。

a．mRNA種類多，分子量差異很大。

b．真核細(xì)胞mRNA為單順反子，有5′-非編碼區(qū)、3′-非編碼區(qū)，中間的編碼區(qū)編碼一條多肽鏈。原核細(xì)胞mRNA為多順反子，一條mRNA有多個(gè)編碼區(qū)。

c．真核細(xì)胞mRNA5′端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，可防止5′核酸外切酶的降解作用，同時(shí)有助于核糖體與mRNA的識(shí)別與結(jié)合。

d．大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3′末端有poly（A）結(jié)構(gòu)，與mRNA分子的穩(wěn)定性及運(yùn)輸有關(guān)，原核細(xì)胞mRNA沒有poly（A）結(jié)構(gòu)。

2RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

大多數(shù)RNA分子鏈的許多區(qū)域自身發(fā)生回折。回折區(qū)內(nèi)的多核苷酸段呈螺旋結(jié)構(gòu)。由于鏈的回折配對(duì)的堿基之間形成氫鍵，不能配對(duì)的堿基形成突環(huán)。螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素主要也是堿基堆積力，其次才是氫鍵。

（1）tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形，由五部分構(gòu)成：氨基酸接受臂、DHU環(huán)、TψC環(huán)、可變環(huán)（或額外環(huán)）、反密碼子環(huán)（圖4-2）。

①氨基酸接受臂由tRNA3′端和5′端附近的7對(duì)堿基所組成，3′端的CCA接受活化的氨基酸；

②二氫尿嘧啶環(huán)：由8～12個(gè)核苷酸組成，具有兩個(gè)二氫尿嘧啶，與tRNA分子的其余部分相連。

③反密碼環(huán)具有反密碼子。

④Tψc臂與一個(gè)含有TψC序列的環(huán)和一個(gè)可變環(huán)（或稱額外環(huán)）相連；

⑤額外環(huán)，又稱可變環(huán)，位于TψC環(huán)和反密碼環(huán)之間，其大小往往是tRNA分類的重要指標(biāo)。

圖4-2　酵母丙氨酸t(yī)RNA（tRNA^Ala）的三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu)

（2）rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)亦為三葉形。

（3）mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是通過單鏈自身回折而形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

3RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L形。

五、核酸的性質(zhì)

1性狀和溶解度

DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，微溶于水，鈉鹽溶解度較大。不溶于一般有機(jī)溶劑，可用乙醇和異丙醇沉淀核酸。

2分子大小

DNA和RNA分子量都很大，但DNA的分子量比RNA的更大，在1.6×10⁶～2.2×10⁹之間。DNA分子大多數(shù)是不對(duì)稱的。

3酸堿性質(zhì)

核酸分子中含有磷酸基和堿基，磷酸基可解離放出H^＋，堿基可接受H^＋，具有酸堿性質(zhì)。由于磷酸基的酸性較強(qiáng)，所以其等電點(diǎn)較低。RNA的等電點(diǎn)為pH 2.0～2.5，而DNA的等電點(diǎn)在pH4～4.5范圍內(nèi)。

4紫外吸收特征

（1）嘌呤和嘧啶都含有共軛雙鍵，因此堿基、核苷、核苷酸、核酸都具有紫外吸收特性，最大吸收值在260nm附近。

（2）A₂₆₀＝1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈或RNA以及20μg/ml寡核苷酸。

（3）利用A₂₆₀/A₂₈₀可以判斷核酸樣品的純度，純DNA樣品A₂₆₀/A₂₈₀為1.8，純RNA為2.0。

5核酸的變性及復(fù)性

（1）DNA變性

①DNA變性定義

DNA變性是指DNA雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵在某些理化因素（溫度、pH、離子強(qiáng)度等）作用下發(fā)生斷裂，使雙鏈DNA解離為單鏈的現(xiàn)象。

②熔解溫度（T_m）

a．溶解溫度的定義

熔解溫度又稱DNA的解鏈溫度，是指在解鏈過程中，DNA雙螺旋失去一半時(shí)的溫度。

b．T_m值可作為衡量DNA樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。

c．DNA的T_m值與其DNA長短以及堿基的GC含量相關(guān)。GC的含量越高，T_m值越高，其經(jīng)驗(yàn)公式為：（G＋C）%＝（T_m－69.3）×2.44。

d．溶液的離子強(qiáng)度越高，T_m值越高，反之則相反。因此，DNA制品應(yīng)保存在較高濃度的溶液中，常保存在1 mol/L NaCl溶液中。

③DNA的增色效應(yīng)

DNA的增色效應(yīng)是指在DNA解鏈過程中，由于有更多的共軛雙鍵得以暴露，DNA在260nm處的吸光度隨之增加的現(xiàn)象，是監(jiān)測DNA雙鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生變性的最常用的指標(biāo)。

（2）DNA復(fù)性

①復(fù)性的定義

復(fù)性是指兩條解離的互補(bǔ)鏈在變性條件緩慢地除去后可重新配對(duì)，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。

②復(fù)性的制約因素

a．DNA濃度較高時(shí)，兩條互補(bǔ)鏈彼此相碰的機(jī)會(huì)增加，易于復(fù)性。

b．因加熱變性的DNA，當(dāng)溫度超過T_m后，即迅速冷卻到低溫時(shí)，不能復(fù)性，可以用來保持DNA變性狀態(tài)。但當(dāng)溶液維持在T_m以下的較高溫度時(shí)，則可能復(fù)性，一般比T_m低25℃左右時(shí)最佳。

c．DNA片段的大小也影響其復(fù)性的速度，大的線狀單鏈，其擴(kuò)散速度慢，碰撞機(jī)會(huì)小。

（3）雜交

來源不同具有互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸片段在溶液中冷卻時(shí)可以再形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雜交作用。其基本原理是利用硝酸纖維素濾膜能牢固地結(jié)合單鏈核酸，而不能結(jié)合雙鏈DNA或雙鏈RNA。

①Southern印跡法，也稱DNA印跡法，是指通過將待測的單鏈DNA轉(zhuǎn)移并固定到特定的膜上并用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，是檢測目的基因的一種分子雜交技術(shù)。具體方法步驟如圖4-3所示。

圖4-3　DNA印跡法步驟

②Northern印跡法，又稱RNA印跡法，是將變性RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與放射性同位素標(biāo)記的RNA或與單鏈DNA探針進(jìn)行雜交的方法。

③Western印跡法，又稱蛋白質(zhì)印跡法，是根據(jù)抗體與抗原可以結(jié)合的原理，分析蛋白質(zhì)的方法。

6沉降

沉降是指在超離心機(jī)的離心力作用下，核酸分子下沉的現(xiàn)象。沉降DNA時(shí)常用氯化銫作介質(zhì)。DNA的浮力密度與DNA分子構(gòu)象有密切關(guān)系。經(jīng)沉降后的分布圖如圖4-4所示。

圖4-4　DNA的沉降

六、核酸的生物功能和實(shí)踐意義

核酸是基本遺傳物質(zhì)，在蛋白質(zhì)的生物合成上占有重要位置，在個(gè)體的生長、生殖、遺傳、變異和轉(zhuǎn)化等一系列生命現(xiàn)象中起決定性作用

1DNA的生物功能

（1）DNA是基本的遺傳物質(zhì)

DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，是染色體的主要成分，DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，是基因的基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)。在遺傳過程中DNA的具體作用有兩方面。

①在細(xì)胞分裂時(shí)按照自己的結(jié)構(gòu)精確復(fù)制傳給子代。

②作為模板將所儲(chǔ)遺傳信息傳給mRNA。

細(xì)菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第一次直接證明了DNA是遺傳物質(zhì)，噬菌體感染實(shí)驗(yàn)，又一次直接證明了具有遺傳作用的是DNA而不是蛋白質(zhì)。

（2）DNA與變異

①基因突變的定義

基因突變是由于DNA堿基對(duì)的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化。

②基因突變的類型

按基因結(jié)構(gòu)改變的類型可分為堿基置換和移碼突變。基因突變的類型和機(jī)制如表4-9所示.

表4-9　基因突變的類型及機(jī)制

（3）DNA與病變

①DNA與遺傳性疾病

遺傳性疾病又稱先天性疾病，是由于遺傳缺陷而產(chǎn)生的，即是DNA結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果。如血紅蛋白鏈中的谷氨酸密碼子發(fā)生突變變成纈氨酸導(dǎo)致鐮刀狀貧血病的發(fā)生，缺乏產(chǎn)生促黑素生成的酪氨酸酶的基因引起白化病。

②DNA與癌變

DNA與癌變的關(guān)系十分復(fù)雜，某些物理或化學(xué)因素導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)改變，形成了一種變異的癌細(xì)胞的DNA，這種變異的DNA生物體不能修復(fù)，最后會(huì)導(dǎo)致癌癥。

（4）克隆與克隆化

克隆是指由單一親代細(xì)胞用無性繁殖產(chǎn)生的子代細(xì)胞。形成克隆的過程稱克隆化。利用克隆技術(shù)可使新引入的基因擴(kuò)大化，產(chǎn)生大量DNA、單克隆抗體和某些稀有蛋白質(zhì)。克隆技術(shù)在基因工程和免疫學(xué)上有著重要作用。

2RNA的生物功能

（1）RNA與蛋白質(zhì)的生物合成

①RNA的功能和特性

3種RNA（mRNA、tRNA和rRNA）都參與了蛋白質(zhì)的生物合成。RNA可通過參與蛋白質(zhì)的合成、中心法則和逆轉(zhuǎn)錄過程傳遞遺傳信息。具體的功能如表4-10所示。

表4-10　mRNA、tRNA和rRNA參與蛋白質(zhì)合成的功能特性

②遺傳密碼

a．密碼子

密碼子，又稱三聯(lián)體密碼，是mRNA上3個(gè)相鄰的核苷酸序列，一個(gè)密碼子就代表一種氨基酸。共有64個(gè)密碼子，AUG稱為起始密碼子，UAA、UAG、UGA 3個(gè)密碼子為終止密碼子，不編碼任何氨基酸，只作為肽鏈合成終止的信號(hào)。

b．反密碼子

反密碼子是tRNA上與mRNA密碼子結(jié)合的特殊堿基三聯(lián)體。密碼子與反密碼子作用示意圖如圖4-6所示。

圖4-5　密碼子和反密碼子的關(guān)系

（2）RNA與遺傳

部分病毒以RNA作為遺傳物質(zhì)。

（3）RNA在傳遞遺傳信息上的作用

①mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。

②tRNA是氨基酸的運(yùn)載工具及蛋白質(zhì)生物合成的適配器。

③rRNA是核糖體的主要成分，是翻譯工作的場所。

④遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄到mRNA，從mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的遺傳信息傳遞過程稱為中心法則。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)證明遺傳信息也可以從RNA逆轉(zhuǎn)錄到DNA，這一現(xiàn)象豐富了中心法則。

3核酸與病毒

（1）病毒是含DNA或RNA的核蛋白，結(jié)構(gòu)以核酸為中心，外包以保護(hù)性蛋白質(zhì)外殼，主要成分為糖蛋白。病毒一般為棒狀和球狀，有無定形者，病毒RNA一般為發(fā)夾形。

（2）可分為DNA病毒和RNA病毒兩大類。

常見的DNA病毒有：牛痘病毒、T4噬菌體。

RNA病毒有：煙草花葉病毒（TMV）、小兒麻痹病毒、流行感冒病毒、呼吸道及腸道病毒。

4核酸及其水解產(chǎn)物在人類生活上的實(shí)踐意義

目前，人類已利用核酸的水解物，如腺苷三磷酸（ATP）、肌苷酸（5-IMP）、環(huán)腺苷酸（cAMP）以及核酸水解后的核苷酸混合物等，已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)（如ATP、cAMP、核酸水解物“核酪”）、工業(yè)（5-IMP用作增鮮劑）和農(nóng)業(yè)（核酸水解物用作農(nóng)作物的增產(chǎn)）等各方面。

七、核酸的分離、合成和鑒定原理

核酸分離和純化的原則：DNA要注意保持分子完整性，RNA注意盡可能完全抑制RNA酶的活性。

1DNA的分離純化

DNA的分離純化步驟：將細(xì)胞破碎，提取DNA，然后用苯酚或氯仿等除去蛋白質(zhì)，用2倍體積的乙醇沉淀DNA，得纖維狀DNA。用RNA酶除去RNA，再去多糖等雜質(zhì)，得較純的DNA。最后用柱層析或密度梯度離心等方法純化，最終得到純的DNA。

2RNA的分離純化

RNA的提取可采用苯酚提取法，破碎細(xì)胞做成勻漿時(shí)，直接加入含水苯酚，使含水苯酚與勻漿一起振蕩，然后離心。上層水相含RNA和多糖，取出水層，加入2倍體積的乙醇使RNA沉淀，再進(jìn)一步純化。

3合成

人工合成核酸的方法有兩類，一類是酶促合成法，另一類是化學(xué)合成法。酶促合成法主要是利用核苷酸磷酸化酶或有關(guān)專一性核酸聚合酶合成DNA或RNA。

4鑒定和含量測定

（1）核酸的鑒定

①RNA的鑒定方法

濃鹽酸和苔黑酚（3,5-二羥甲苯）與RNA反應(yīng)生成綠色物質(zhì)，可以鑒定RNA，也可以在670nm測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RNA的含量。

②DNA的鑒定方法

DNA在酸性條件（冰醋酸和少量濃硫酸）下與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，可以鑒定DNA，也可以在595nm測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA的含量。

（2）核酸含量的鑒定

①根據(jù)磷元素的含量測定

RNA中含磷量為9.0%，DNA中含磷量為9.2%，因此可以根據(jù)磷元素的含量計(jì)算DNA和RNA的含量。含磷量的測定是用濃硫酸將核酸消化，使其有機(jī)磷變成無機(jī)磷，然后與鉬酸銨定磷試劑作用，生成藍(lán)色的鉬藍(lán)。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺和磷含量成正比，可在660nm比色測定。從磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品中磷的含量，從而求出核酸的含量。

②根據(jù)核糖和核脫氧核糖的含量測定

DNA與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，RNA與苔黑酚反應(yīng)生成綠色物質(zhì)，再利用比色法計(jì)算DNA和RNA的含量。

③紫外吸收法

實(shí)驗(yàn)室中常見的是測量核酸在260nm和280nm的吸光度（A值），從A₂₆₀/A₂₈₀的比值可判斷樣品的純度。