3.3　名校考研真題詳解

一、選擇題

1有一混合蛋白質溶液，各種蛋白質的pI分別為4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。電泳時欲使其中4種泳向正極，緩沖液的pH應該是（　?。?。[中國科學院2007研]

A．5.0

B．4.0

C．6.0

D．7.0

E．8.0

【答案】D

【解析】氨基酸的帶電狀況與溶液的pH有關，改變pH可以使氨基酸帶上正電荷或負電荷，也可以使它處于正負電荷數相等即凈電荷為零的兼性離子狀態。使氨基酸處于凈電荷為零時的pH，稱為等電點，記為pI。一般來說，當pH＞pI時，多肽鏈帶凈負電荷，在電場中將向陽極移動，在低于等電點的任一pH，多肽鏈帶有凈正電荷，在電場中將向陰極移動。本題欲使其中4種蛋白質泳向正極，即有4種蛋白質應帶上凈負電荷，即pH應大于前4個蛋白的pI，且小于第五個蛋白的pI，因此答案選D。

2下列哪組反應是錯誤的？（　　）[河北師范大學2001研]

A．Arg-坂口反應

B．多肽-雙縮脲反應

C．氨基酸-茚三酮反應

D．Trp-乙醛酸反應

E．Phe-偶氮反應

【答案】E

【解析】苯丙氨酸沒有特殊的顏色反應，偶氮反應是酪氨酸所特有的顏色反應。

3下列氨基酸中，哪一種含氮量最高？（　?。?span id="1n1hixi" class="ZhenTiTag">[河北師范大學2002研]

A．Arg

B．His

C．Gln

D．Lys

E．Pro

【答案】A

【解析】所有的氨基酸都含有N元素，而精氨基酸分子中的N元素有四個，所以它的含量是所有氨基酸中最高的。

4下列有關蛋白質的敘述哪項是正確的？（　　）[西南農業大學2002研]

A．蛋白質分子的凈電荷為零時的pH是它的等電點

B．通常蛋白質的溶解度在等電點時最大

C．大多數蛋白質在飽和硫酸銨中溶解度增大

D．由于蛋白質在等電點時溶解度大，所以一般沉淀蛋白質時應遠離等電點

E．以上各項全不正確

【答案】A

【解析】蛋白質等電點是指蛋白質分子內的正電荷總數與負電荷總數相等時的pH。因此，在等電點時，蛋白質分子的凈電荷等于零，即處于等電點的蛋白質分子在電場中既不向正極移動，也不向負極移動。由于在等電點時蛋白質分子間的靜電斥力最小，所以其溶解度最小，在溶液中易于沉淀。飽和硫酸銨常用于沉淀蛋白質，因為大量的中性鹽離子奪走蛋白質周圍的水化層，并抑制其解離，因而導致蛋白質易于沉淀，溶解度最小。

5有一肽，用胰蛋白酶水解得：①H-Met-Glu-Leu-lys-OH；②H-Ser-Ala-Arg-OH；③H-Gly-Tyr-OH三組片段。用BrCN處理得④H-Ser-Ala-Arg-Met-OH；⑤H-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr-OH兩組片段。按肽譜重疊法推導出該九肽的序列應為（　?。?span id="wmmg1k6" class="ZhenTiTag">[中國藥科大學2005研]

A．③＋②＋①

B．②＋①＋③

C．⑤＋④

D．②＋③＋①

E．①＋②＋③

【答案】B

【解析】（1）一般來說，如果多肽鏈只斷裂成兩段或三段便能測出其氨基酸序列，只要知道原多肽鏈的C端和N端的氨基酸殘基就可以推斷出它們在原多肽鏈中的前后次序。但是多數情況下，除了能確定C端肽段和N端肽段的位置外，中間那些肽段的次序是不能確定的。若借助兩種或兩種以上的不同方法斷裂多肽樣品，使成具有重疊肽的幾套肽段，這樣依靠重疊肽就可以確定肽段在原多肽鏈中的正確位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸序列。這種方法即為肽譜重疊法。（2）胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶，專一性強，只斷裂賴氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）殘基的羧基參與形成的肽鍵。用它斷裂得到的是以Arg或Lys為C-末端殘基的肽段。題中①、②兩組片段即分別為Arg或Lys為C-末端殘基的肽段。溴化氫（BrCN）只斷裂由甲硫氨酸（Met）殘基的羧基參與形成的肽鍵。題中第④組即為以Met為C-末端殘基的肽段。從兩種處理方式獲得的水解產物可以看出，該肽只有一個Met殘基，各組片段之間有相互重疊的肽段，如下：

①H-Met-Glu-Leu-lys-OH；

②H-Ser-Ala-Arg-OH；

③H-Gly-Tyr-OH；

④H-Ser-Ala-Arg-Met-OH；

⑤H-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr-OH。

借助上述重疊肽，可以推測該肽的氨基酸序列應為：

Set-Ala-Arg-Met-Glu-Leu-lys-Gly-Tyr

6具有四級結構的蛋白質特征是（　?。?span id="n5qofxi" class="ZhenTiTag">[華東理工大學2007研]

A．分子中必定含有輔基

B．在兩條或兩條以上具有三級結構多肽鏈的基礎上，肽鏈進一步折疊、盤曲形成

C．每條多肽鏈都具有獨立的生物學活性

D．依賴肽鍵維系四級結構的穩定性

E．由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽鏈組成

【答案】E

【解析】蛋白質的四級結構是指兩條以上具有三級結構的多肽鏈之間締合在一起的結構。其中，每條具有三級結構的多肽鏈稱為亞基，一般具有四級結構的蛋白質才有生物學活性。維持其穩定的是次級鍵，如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力等。

7蛋白質變性后表現為（　?。?。[武漢大學2015研]

A．黏度下降

B．溶解度增加

C．不易被蛋白酶水解

D．生物學活性喪失

E．易被鹽析出現沉淀

【答案】D

【解析】蛋白質變性后的表現：生物活性喪失、黏度增加、溶解度下降、易被蛋白酶水解。

8蛋白質中氨基酸在280nm處光吸收值最大的是（　?。?。[廈門大學2014研]

A．色氨酸

B．酪氨酸

C．苯丙氨酸

D．賴氨酸

【答案】A

9組成蛋白質的單位是（　　）。[武漢大學2014研]

A．L-α-氨基酸

B．D-氨基酸

C．L-β-氨基酸

D．D-酸-氨基酸

E．L-D-氨基酸

【答案】A

【解析】氨基酸是組成蛋白質的基本單位，存在于自然界的氨基酸有300多種，但組成人體蛋白質的僅有20種氨基酸，都是L-基酸氨基酸（甘氨酸除外）。

10下列蛋白質通過凝膠過濾層析柱時，最先被洗脫的是（　　）。[武漢大學2014研]

A．牛胰島素（分子量5700）

B．肌紅蛋白（分子量16900）

C．牛β乳球蛋白（分子量35000）

D．血清清蛋白（分子量68500）

E．馬肝過氧化物酶（分子量247500）

【答案】E

【解析】凝膠過濾層析的基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質各成分按分子大小分開，達到分離的目的。小分子物質能進入凝膠顆粒內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，因此大分子物質先洗脫出來，而小分子物質后被洗脫出來。

11下列哪種氨基酸溶于水時不引起偏振光旋轉？（　?。?span id="odkcgct" class="ZhenTiTag">[武漢大學2014研]

A．谷氨酸

B．亮氨酸

C．丙氨酸

D．甘氨酸

E．苯丙氨酸

【答案】D

【解析】甘氨酸沒有手性碳原子，因此不具有旋光性，其溶于水也不存在變旋現象，因此也不能使偏振光旋轉。

12、在蛋白質一級結構測定時要確定二硫鍵的位置，可以用下列哪一種方法測定出含二硫鍵的肽段？（　　）[華中農業大學2016研]

A．巰基化合物還原

B．過甲酸氧化

C．對角線電泳

D．雙向電泳

【答案】C

【解析】對角線電泳是把水解后的混合肽段點到濾紙的中央，在pH6.5的條件下，進行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來。然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S-斷裂。這時每個含二硫鍵的肽段被氧化成一對含半胱氨磺酸的肽。濾紙旋轉90°角在與第一向完全相同的條件下進行第二向電泳。在這里，大多數肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上，而含半胱氨磺酸的成對肽段比原來含二硫鍵的肽小而負電荷增加，結果它們都偏離了對角線。肽斑可用茚三酮顯色確定。將每對含半胱氨磺酸的肽段（未用茚三酮顯色的）分別取下，進行氨基酸順序分析，然后與多肽鏈的氨基酸順序比較，即可推斷出二硫鍵在肽鏈間或（和）肽鏈內的位置。

二、填空題

1尿素是一種蛋白質的變性劑，其主要作用是______。[復旦大學1999研]

【答案】破壞蛋白質的二級結構

【解析】引起蛋白質變性的試劑有很多，但其作用方式并不完全一致，如尿素和胍能與多肽主鏈競爭氫鍵，更重要的原因是能增加非極性側鏈在水中的溶解度，因而降低了維持蛋白質三級結構的疏水相互作用。而SDS則是破壞蛋白質分子內的疏水相互作用使非極性基團暴露于介質水中。

2Edman降解是從多肽鏈游離的______末端測定氨基酸殘基序列的過程。[中山大學2018研]

【答案】N

3在蛋白質的二級結構中，只要存在______α-螺旋結構就會被中斷。[華南師范大學2004研]

【答案】脯氨酸（或羥脯氨酸）

【解析】一條肽鏈能否形成α-螺旋，以及形成的螺旋是否穩定，與它的氨基酸組成和序列有極大的關系。一般而言，R基越小，電荷越少，越利于α-螺旋的形成和穩定。多聚脯氨酸的α-碳原子參與R基吡咯的形成，環內的C_α-N鍵和C-N肽鍵都不能旋轉，而且多聚脯氨酸的肽鍵不具酰胺氫，不能形成鏈內氫鍵。因此，多肽鏈中只要存在脯氨酸（或羥脯氨酸），α-螺旋即被中斷，并產生一個“結節”。

4維持蛋白質系水膠體穩定的因素是______和______。[西南農業大學2001研]

【答案】水化層；雙電層

5測定蛋白質濃度的方法有______、______和______等。[華中農業大學2017研]

【答案】凱氏定氮法，紫外分光光度法，雙縮脲法

【解析】測定蛋白質濃度的方法，即一定體積下的蛋白質定量方法，常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍染色法等。

6蛋白質分子中氮的平均含量為______，故樣品中的蛋白質含量常以測氮量乘以______，即______。[四川大學2000研]

【答案】16%；6.25；16%的倒數

7生物體內大多數蛋白質形成正確構象時需要______的幫助，某些蛋白質的折疊還需要______和______酶的催化。[華中農業大學2008研]

【答案】分子伴侶；蛋白質二硫鍵異構酶；肽基脯氨酸異構酶

8常用的肽鏈N端分析的方法有______法、______法、______法和______法。[華中師范大學2008研]

【答案】DNS；Sanger；Edman降解；氨肽酶

9增加溶液的離子強度能使某種蛋白質的溶解度增高的現象稱為______，在高離子強度下使某種蛋白質沉淀的現象稱為______。[武漢大學2007研]

【答案】鹽溶；鹽析

三、判斷題

1蛋白質分子的亞基與結構域是同義詞。（　?。?span id="7fy6keo" class="ZhenTiTag">[西南農業大學2000研]

【答案】錯

【解析】亞基是指一條多肽鏈或以共價鍵連接在一起的幾條多肽鏈組成的蛋白質分子的最小共價結構單位。而結構域是指在較大的球狀蛋白質分子中，多肽鏈往往形成幾個緊密的球狀構象，彼此分開，以松散的肽鏈相連，此球狀構象就是結構域。

2參與蛋白質組成的氨基酸中Trp、Tyr和Phe在紫外區有光吸收，這是紫外吸收法定量蛋白質的依據。（　?。?span id="02kqzu6" class="ZhenTiTag">[中山大學2018研]

【答案】對

3色氨酸是含有兩個羧基的氨基酸。（　?。?span id="vvglfkr" class="ZhenTiTag">[中山大學2018研]

【答案】錯

【解析】色氨酸是雜環氨基酸，不含有兩個羧基；常見的20種蛋白質氨基酸中含有兩個羧基的氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸。

4蛋白質的亞基（或稱亞單位）和肽鏈是同義的。（　　）[中國科學技術大學1999研]

【答案】錯

【解析】亞基是肽鏈，但肽鏈不一定是亞基。如胰島素A鏈與B鏈，經共價的硫-硫鍵連接成胰島素分子，A鏈與B鏈不是亞基。

5四級結構是蛋白質保持生物學活性的必要條件。（　　）[中山大學2018研]

【答案】錯

【解析】具有三級結構的單體蛋白質就具有生物學活性，而組成蛋白質四級結構的亞基同樣具有三級結構，當其單獨存在時不具有生物學活性，因此四級結構不是蛋白質保持生物學活性的必要條件。

6某些蛋白質中含有一些不常見的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質合成以后經修飾衍生而來的。（　?。?span id="ckb0dap" class="ZhenTiTag">[中山大學2018研]

【答案】對

【解析】某些蛋白質中含有一些不常見的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質合成以后經羥化、羧化、甲基化等修飾衍生而來的，如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸。

7蛋白質中的稀有氨基酸是翻譯后修飾而成的。（　?。?span id="oyp40im" class="ZhenTiTag">[浙江大學2018研]

【答案】對

【解析】硒代半胱氨酸不屬于題目中說的稀有氨基酸，稀有氨基酸指的是羥脯氨酸和羥賴氨酸等氨基酸。

8只有在pH很高或很低時，氨基酸才主要以非離子化形式存在。（　　）[山東大學2016研]

【答案】錯

【解析】在水溶液中氨基酸癿非離子化形式從來不會占優勢。

9變性蛋白質溶解度降低是由蛋白質分子的電荷被中和去除了蛋白質外面的水化層所引起的。（　?。?span id="5nw6ulk" class="ZhenTiTag">[山東大學2016研]

【答案】錯

【解析】蛋白質變性是由于維持蛋白質構象穩定的作用力（次級鍵和二硫鍵）被破壞從而使蛋白質空間結構被破壞并使個體喪失生物活性的現象，次級鍵破壞之后，蛋白質結構松散，原來聚集在分子內部的疏水性氨基酸側鏈伸向外部，減弱了蛋白質分子與水分子之間的相互作用，因此溶解度降低。

10蛋白質變性后，會使大量氨基酸游離出來。（　?。?span id="uumdheb" class="ZhenTiTag">[山東大學2016研]

【答案】錯

【解析】蛋白質變性是指蛋白質的空間結構被破壞，而一級結構仍保持完整，所以不會有氨基酸游離出來，大量氨基酸游離出來的現象稱為氨基酸的降解。

11絲氨酸是蛋白質的磷酸化位點，因此蛋白質中含有的絲氨酸殘基均能被磷酸化。（　?。?span id="6vhguy5" class="ZhenTiTag">[華中農業大學2016研]

【答案】錯

12蛋白質分子由α-蛋氨基酸組成，這些氨基酸α-碳是一個手性碳原子，因此均具有光學活性。（　?。?span id="iajkvp0" class="ZhenTiTag">[中山大學2018研]

【答案】錯

【解析】常見的20種蛋白質氨基酸中除Pro是α-亞氨基酸外，其余的都是由α-氨基酸組成，除Gly外其余氨基酸都具有一個手性碳原子，因此均具有光學活性。

13疏水蛋白質的折疊伴隨著多肽鏈的熵增加。（　?。?span id="oo6hl2c" class="ZhenTiTag">[清華大學研]

【答案】錯

【解析】蛋白質折疊過程是有序化的過程，故熵減少。

14蛋白質變性和DNA變性的機理是相似的，復性時都可以恢復原來的生物活性。（　?。?span id="5h6qlid" class="ZhenTiTag">[天津商學院研]

【答案】錯

【解析】蛋白質變性根據變性程度可以分為可逆變性和不可逆變性，原來的生物學活性不一定能夠恢復；DNA變性后一般可以恢復原來的生物學活性。

四、名詞解釋題

1凝膠過濾層析。[華中科技大學2017研]

答：凝膠過濾層析又稱為排阻層析或分子篩法，是指根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化的一種方法。這種方法比較簡便，不要求復雜的儀器就能相當精確地測出蛋白質的相對分子質量。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。一種利用帶孔凝膠珠作基質，按照分子大小分離蛋白質或其他分子混合物的層析技術。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。

2鹽析作用[山東大學2016研]

答：鹽析作用是指在蛋白質水溶液中加入中性鹽，隨著鹽濃度增大而使蛋白質沉淀出來的現象；中性鹽是強電解質，溶解度又大，在蛋白質溶液中，一方面與蛋白質爭奪水分子，破壞蛋白質膠體顆粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白質顆粒上的電荷，從而使水中蛋白質顆粒積聚而沉淀析出。常用的中性鹽有硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，但硫酸銨最常用。

3超二級結構[山東大學2016研]

答：超二級結構是指在多肽鏈內順序上相互鄰近的二級結構（主要是α-螺旋和β-折疊）常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規則的二級結構聚集體，在多種蛋白質中充當三級結構的構件。

4親和層析[山東大學2016研]

答：親和層析是指在生物分子中有些分子的特定結構部位能夠同其他分子相互識別并結合，如酶與底物的識別結合、受體與配體的識別結合、抗體與抗原的識別結合，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結合解除的層析技術。

5必需氨基酸[山東大學2016研]

答：必需氨基酸是指人體（或其他脊椎動物）必不可少，而機體內又不能合成的，必須從食物中補充的氨基酸；對成人來說，這類氨基酸有8種，包括賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，對嬰兒來說，組氨酸也是必需氨基酸。

6結構域[山東大學2017研]

答：結構域是指在較大的球狀蛋白質分子中，多肽鏈彼此分開并以松散的肽鏈相連而形成的球狀構象。酶蛋白的活性中心往往位于結構域之間，因為結構域有利于活性中心與底物的結合。

7分子伴侶[華中農業大學2017研]

答：分子伴侶是指在細胞內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質結構執行功能組分的蛋白質，是一類在序列上沒有相關性但有共同功能的蛋白質。

8鋅指結構[浙江大學2018研]

答：鋅指結構是指許多轉錄因子所共有的DNA結合結構域，具有很強的保守性。在DNA結構域中含有較多的半胱氨酸和組氨酸的區域，借助肽鏈的彎曲使2個Cys和2個His與一個鋅離子，或者4個Cys與一個鋅離子絡合成的一個形似指狀的三級結構。

9Electrophoresis[武漢大學2015研]

答：Electrophoresis的中文名稱是電泳，又稱離子泳，是指在外電場的存在下，利用分子攜帶的凈電荷不同以分離混合物的一種實驗技術。其原理是根據相對分子質量的差異來分離混合物的，相對分子質量越大，在電泳中移動速度就越慢，移動距離越短，條帶離電泳孔越近，反之，相對分子質量越小，條帶離電泳孔越遠。電泳技術可用于氨基酸、肽、蛋白質和核酸等生物分子的分析分離和制備。

10谷胱甘肽[武漢大學2014研]

答：谷胱甘肽是指由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的三肽物質，可作為體內重要的還原劑，保護蛋白質和酶分子中的疏基免遭氧化，使蛋白質或酶處在活性狀態。

11pI[武漢大學2014研]

答：pI即等電點，是指使蛋白質或氨基酸在溶液中解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零時的溶液pH。

12肽單位[華中師范大學2009研]

答：肽單位，又稱為肽鍵，是肽鏈主鏈上的重復結構，由參與肽鍵形成的氮原子、碳原子和它們的4個取代成分（羰基氧原子、酰胺氫原子和兩個相鄰α-碳原子）組成的一個平面單位。

13蛋白質變性作用[華中師范大學2008研]

答：蛋白質的變性作用是指天然蛋白質因受物理因素或化學因素影響，其分子內部原有的高度規律性結構發生變化，致使蛋白質的理化性質和生物學性質都有所改變，但并不導致蛋白質一級結構的破壞的現象。

14別構調節[廈門大學2007研]

答：別構調節是指別構調節酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價結合后發生構象的改變，進而改變酶活性狀態的現象。

15protein tertiary structure[華中農業大學2008研]

答：protein tertiary structure即蛋白質三級結構，是指多肽鏈中所有原子和基團的構象，它是在二級結構的基礎上進一步盤曲折疊形成的，包括所有主鏈和側鏈的結構。

16quaternary structure of protein[中南民族大學2009研]

答：quaternary structure of protein即蛋白質的四級結構，是組成寡聚蛋白亞基的種類、數目、各種亞基在寡聚蛋白中的空間排布，以及亞基之間的相互作用。

17外肽酶[武漢大學2014研]

答：外肽酶又稱肽鏈端解酶，或端解酶，是蛋白水解酶一類，可催化多肽鏈末端肽鍵水解，游離末端氨基酸。根據其所剪切肽鏈末端為氨基端或羧基端又可分為氨基肽酶和羧基肽酶；此外，還包括催化二肽水解的二肽酶，從多肽鏈末端剪切二肽的二肽基肽酶。

18內肽酶[武漢大學2015研]

答：內肽酶又稱蛋白酶，是指主要作用于蛋白質多肽鏈內部的肽鍵從而使蛋白質長鏈分解成短肽片段的蛋白質酶類。蛋白酶水解蛋白質時，作用部位因肽鍵種類而異，如胰蛋白酶的切點的羧基側為堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）肽鍵；胃蛋白酶的切點兩端為芳香族氨基酸；枯草桿菌堿性蛋白酶的切點的羧基側為疏水性芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）等，這種蛋白酶對切點的特異性要求稱為蛋白酶的底物專一性，利用蛋白酶的底物專一性可以定向獲得特殊結構的多肽。

五、問答題

1簡要說明為什么大多數球狀蛋白質在溶液中具有如下性質：[山東大學1999研]

（1）在低pH時沉淀。

（2）當離子強度從零增至高值時，先是溶解度增加，然后溶解降低，最后沉淀。

（3）在給定離子強度的溶液中，等電pH值時溶解度呈現最小。

（4）加熱時沉淀。

（5）當介質的介電常數因加入與水混溶的非極性溶劑而下降時，溶解度降低。

（6）如果介電常數大幅度下降以至介質以非極性溶劑為主，則產生變性。

答：球狀蛋白質的整個肽鏈沒有均一的二級結構，而是具有α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規則卷曲。正因為這樣，它才容易折疊成球狀三級結構。疏水基團在內部，親水基團在外部，所以球狀蛋白質多數都是可溶的。一旦由于外在因素的破壞，導致其疏水基團暴露出來，蛋白質就會沉淀或者變性。

（1）在低pH時氨基被質子化，使蛋白質帶有大量的凈正荷。這樣造成的分子內的電荷排斥引起了很多蛋白質的變性，并由于疏水內部暴露于水環境而變得不溶。

（2）增加鹽濃度，開始時能穩定帶電基團，但是當鹽濃度進一步增加時，鹽離子便與蛋白質競爭水分子，因此，降低了蛋白質的溶劑化，這樣又促進蛋白質分子間的極性相互作用和疏水相互作用，從而導致沉淀。

（3）蛋白質在等電點時分子間的靜電斥力最小。

（4）由于加熱使蛋白質變性，因此暴露出疏水內部，溶解度降低。

（5）非極性溶劑能降低表面極性基的溶劑化作用，因此促進蛋白質之間的氫鍵形成以代替蛋白質與水之間形成的氫鍵。

（6）低介電常數能穩定暴露于溶劑中的非極性基團，因此，促進蛋白質的伸展。

2測定氨基酸的氨基態氮，使用NaOH標準溶液測定氨基酸的羧基，再直接求出氨基態氮的量。試問在NaOH滴定前為什么要加甲醛？[上海師范大學研]

答：氨基酸分子在溶液中主要以兩性離子形式存在，因其毗鄰的羧基與氨基間相互影響而導致等當點pH過高（12～13）或過低（1～2），沒有適當的指示劑選用，因此不能直接采用酸、堿滴定法準確定量。通常可通過在溶液中加入中性甲醛以降低其氨基的堿性，即生成-NH（CH₂OH）和-N（CH₂OH）₂之類的羥甲基衍生物而不形成兩性離子，相對增強了-NH₃的酸性解離，使其氨基等電點減少2～3而移至pH9左右以達到酚酞類指示劑的顯示范圍。

3什么是蛋白質的變性作用？舉例說明實際工作中應用和避免蛋白質變性的例子。[武漢大學2015研]

答：（1）蛋白質的變性作用是指天然蛋白質分子由于受到理化因素的影響使次級鍵斷裂，引起天然構象的改變，導致其生物活性的喪失及一些理化性質，如紫外吸收光譜等的改變，但并未引起肽鍵的斷裂的現象。有些變性蛋白質在除去引起變性的理化因素后，又可以復性。

（2）實際工作中應用和避免蛋白質變性的例子

①工作中應用蛋白質變性的例子

如用乙醇加熱和紫外線消毒滅菌，用熱凝固法檢查尿蛋白等。

②工作中避免蛋白質變性的例子

如制備或保存酶、疫苗、免疫血清等蛋白質制劑時，應選擇適合條件，防止其變性失活。

42,3-二磷酸甘油酸（BPG）是如何調節血紅蛋白運氧功能的？[華中農業大學2017研]

答：2,3-二磷酸甘油酸（BPG）是血紅蛋白的一個重要的別構效應物。在BPG存在下，血紅蛋白的氧合作用可用下面的方程式表示：

HbBPG＋4O₂→HbBP（O₂）₄＋BPG

紅細胞中的2,3-DPG與脫氧血紅蛋白結合，使脫氧血紅蛋白的空間構象穩定，從而降低血紅蛋白對O₂的親合力，促使O₂和血紅蛋白解離。尤其當血液通過組織時，紅細胞中2,3-DPG的存在就能顯著促進O₂的釋放以供組織需要。

5簡述蛋白質二級結構的類型及基本結構特征。 [華中農業大學2017研]

答：蛋白質二級結構是指肽鏈中的主鏈借助氫鍵，有規則的卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結構的構象。

蛋白質二級結構的類型有α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲。

（1）α-螺旋：肽鏈主鏈繞假想的中心軸盤繞成螺旋狀，一般都是右手螺旋結構，螺旋是靠鏈內氫鍵維持的。每個氨基酸殘基（第n個）的羰基氧與多肽鏈C端方向的第4個殘基（第n＋4個）的酰胺氮形成氫鍵。在典型的右手α-螺旋結構中，半徑為0.23nm，螺距為0.54nm，每一圈含有3.6個氨基酸殘基，每個殘基沿著螺旋的長軸上升0.15nm。

（2）β-折疊：折疊片的構象是通過一個肽鍵的羰基氧和位于同一個肽鏈或相鄰肽鏈的另一個酰胺氫之間形成的氫鍵維持的。

（3）β-轉角：連接蛋白質分子中的二級結構（α-螺旋和β-折疊），使肽鏈走向改變的一種非重復多肽區，一般含有2～16個氨基酸殘基。

（4）無規卷曲：它泛指那些不能被歸入明確的二級結構如折疊片或螺旋的多肽區段。

此外，還有Ω環，它是普遍存在于球狀蛋白質中的一種新的二級結構。Ω環由6～16個氨基酸殘基組成，而且第一個殘基的α碳原子和最后一個殘基的α碳原子間的距離小于1nm。Ω環幾乎只出現在蛋白質分子的表面，而且以親水氨基酸殘基為主，它們在分子識別過程中可能起重要作用。

6什么是蛋白質變性？哪些環境因素可以造成蛋白質變性？[浙江大學2017研]

答：（1）蛋白質變性是指蛋白質在某些強烈的物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被改變，但一級結構保持完整，從而導致其理化性質改變和生物活性喪失的現象。

（2）蛋白質變性的環境因素

①化學因素

強酸、強堿、重金屬鹽、尿素、丙酮、去污劑等。

②物理因素

高溫、紫外線或X光照射、超聲波、劇烈震蕩或攪拌等。

7蛋白質的分離純化可以利用蛋白質溶解度的差異。下列每對多肽中哪個多肽在對應的pH條件下在水溶液中的溶解度最大？[山東大學2016研]

（1）（Gly）₂₀和（Glu）₂₀；pH＝7.0

（2）（Lys-Ala）₃和（Phe-Met）₃；pH＝7.0

（3）（Ala-Ser-Gly）₅和（Asn-Ser-His）₅；pH＝6.0

答：多肽在水中的溶解性主要取決于側鏈基團的極性，尤其取決于可電離基團的數目，可電離基團越多，溶解性就越大，而可電離基團的解離又取決于溶液的pH。若兩個多肽的凈電荷相同，則含極性側鏈多者，溶解性大；若兩個多肽的凈電荷相同，極性集團的數目也想通，那么非極性小的則溶解性稍大。根據上述原則可知：

①在pH＝7.0，（Gly）₂₀﹥（Glu）₂₀

②在pH＝7.0，（Lys-Ala）₃﹥（Phe-Met）₃

③在pH＝6.0，（Ala-Ser-Gly）₅ ﹤（Asn-Ser-His）₅

六、論述題

1請列舉三種蛋白質分子量的測定方法，并簡述其原理。[四川大學2001研]

答：（1）測定蛋白質分子量的方法很多，例如滲透、折散速率，沉降分析等，主要的分子量的測定方法有：

①沉降法：又稱超速離心法，蛋白質溶液經高速離心時由于比重關系，蛋白質分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，利用m＝RTS/D（1－Vρ）即可求出其分子量m。

②凝膠過濾法：又稱分子排阻層析或分子篩層析法，在層析柱中裝入葡聚糖凝膠，這種凝膠顆粒中具有大量微孔，這些微孔只允許較小的分子進入膠粒，而大于膠粒微孔的分子則不能進入而被排阻，當用洗脫液洗脫時，被排阻的分子質量大的蛋白質先被洗脫下來，分子質量小的后下來，根據檢測樣品的洗脫體積可以求出其分子量。

③SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：蛋白質在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳的速度取決于分子質量的大小。根據蛋白質分子在電泳中的相對遷移率和分子質量的對數成直線關系，可以求出蛋白質分子量。

（2）測定蛋白質相對分子質量的最重要的方法是利用超速離心機的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系數（s）的定義是單位離心場強度的沉降速度。s也常用來近似地描述生物大分子的大小。凝膠過濾是一種簡便的測定蛋白質分子量的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于測定單體蛋白質或亞基的分子量。

2簡述3種生物化學中常用的層析技術及原理。[中山大學2018研]

答：生物化學中常用的層析技術和原理如下：

（1）凝膠過濾層析

原理：凝膠過濾層析是指當把蛋白質混合樣品加入到凝膠柱中時，由于不同蛋白質的分子大小不同，小分子物質可以進入凝膠網孔內部，而大分子物質則只能在凝膠顆粒分子的縫隙中流動，當用洗脫液洗脫時，大分子物質流程短，速度快，因此先被洗脫出來；而小分子物質流程長，速度慢，因此最后被洗脫出來，這樣就可以達到分離的目的。

（2）親和層析

原理：親和層析是利用生物大分子與某些相對應的專一分子特異識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法，它是根據不同蛋白質對特定配體的特異而非共價結合的能力不同進行蛋白質分離的。將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然后選用適當的洗脫液， 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。

（3）離子交換層析

原理：離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。蛋白質的帶電性是由蛋白質多肽中帶電氨基酸決定的。由于蛋白質中氨基酸的電性又取決于介質中的pH，所以蛋白質的帶電性也就依賴于介質的pH。不同的蛋白質有不同的等電點，在一定的條件下解離后所帶的電荷種類和電荷量都不同，因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。當緩沖液中的離子基團與結合在離子交換劑上的蛋白質相競爭時，親和力小的蛋白質分子首先被解吸附而洗脫，而親和力大的蛋白質則后被解吸附和洗脫。因此，可通過增加緩沖液的離子強度或改變酸堿度，便可改變蛋白質的吸附狀況，使不同親和力的蛋白質得以分離。

3簡述蛋白質一級、二級、三級及四級結構，并說明一級結構與空間結構的關系。[武漢大學研]

答：（1）蛋白質一級、二級、三級及四級結構

蛋白質是生物大分子，具有明顯的結構層次性，由低層到高層可分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構。

①一級結構是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質分子結構的基礎，它決定蛋白質的高級結構。

②二級結構是指肽鏈主鏈的空間走向（折疊和盤繞方式），是有規則重復的構象。肽鏈主鏈具有重復結構，其中氨基是氫鍵供體，羰基是氫鍵受體。通過形成鏈內或鏈間氫鍵可以使肽鏈卷曲折疊形成各種二級結構單元。復雜的蛋白質分子結構，就由這些比較簡單的二級結構單元進一步組合而成。

③三級結構是指多肽鏈中所有原子和基團的構象。它是在二級結構的基礎上進一步盤曲折疊形成的，包括所有主鏈和側鏈的結構。

④四級結構是指由蛋白質亞基的空間排布和亞基次級鍵間的相互連接而組成的空間結構。由兩條或兩條以上肽鏈通過非共價鍵構成的蛋白質稱為寡聚蛋白。其中每一條多肽鏈稱為亞基，每個亞基都有自己的一、二、三級結構。亞基單獨存在時無生物活性，只有相互聚合成特定構象時才具有完整的生物活性。四級結構就是各個亞基在寡聚蛋白的天然構象中空間上的排列方式。

（2）一級結構與空間結構的關系

一級結構是蛋白質的共價鍵的全部情況，一級結構包含著決定高級結構的因素，蛋白質的種類和生物活性都與肽鏈的氨基酸種類和排列順序有關，蛋白質分子肽鏈的排列順序包含了自動形成復雜的三維結構（即正確的空間構象）所需要的全部信息，所以一級結構決定其高級結構，蛋白質的空間結構取決于蛋白質的一級結構。

4一位15歲的非洲裔美國小女孩癥狀為發燒、肌肉疼痛、兼貧血和尿路感染，初步診斷為鐮刀狀細胞貧血?。⊿ickle cell disease）。鐮刀狀細胞貧血病患者的紅細胞之所以變形是由于不正常的血紅蛋白引起的。

（1）解釋血紅蛋白的結構和其結合氧氣的相關性。

（2）分別從一級和空間結構層次比較鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞血紅蛋白的不同。

（3）用什么實驗方法區別鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞的血紅蛋白？[華中科技大學2016研]

答：（1）血紅蛋白是由四條多肽鏈組成的，分別是兩條α鏈和兩條β鏈。每條多肽鏈的螺旋結構形成一個疏水性的空間，可保護血紅素分子不與水接觸，以及Fe^2＋不被氧化。Fe^2＋位于血紅素卟啉環的中央，與卟啉環的4個吡咯基、O₂及多肽鏈上的組氨酸形成六配位體。每個血紅蛋白分子有四個亞基，可以與4個氧分子可逆結合。

血紅蛋白與氧氣的結合過程為：

當O₂與血紅蛋白的Fe^2＋結合后，鹽鍵逐步斷裂，血紅蛋白分子逐步由T型變為R型，對O₂的親和力逐步增加，R型的O₂親和力為T型的數百倍。也就是說，Hb的4個亞單位無論在結合O₂或釋放O₂時，彼此間有協同效應，即1個亞單位與O₂結合后，由于變構效應的結果，其他亞單位更易與O₂結合；反之，當HbO₂的1個亞單位釋出O₂后，其他亞單位更易釋放O₂，因此血紅蛋白與氧結合的氧離曲線呈S形。

（2）從一級結構上來說，鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞血紅蛋白都有兩條α鏈和兩條β鏈組成，正常人血紅細胞β鏈N端的第六位氨基酸為谷氨酸，而患鐮刀狀細胞貧血癥的人的血紅細胞β鏈N端的第六位氨基酸變為纈氨酸。

從空間結構上來說，谷氨酸為酸性氨基酸，具有親水性，而纈氨酸為非極性脂肪族氨基酸，具有疏水性，氨基酸發生變化之后，原來親水的部位變為疏水部位，蛋白質內部的氫鍵連接和疏水鍵連接改變，引起了三級結構的變化，所以血紅蛋白在進行空間折疊時，血紅蛋白由正常的球形變為棒狀，以致成為鐮刀狀細胞血紅蛋白。

（3）可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法將區別鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞的血紅蛋白區別開來，原理是：血紅蛋白中的珠蛋白和其他蛋白質一樣為兩性電解質，在不同的緩沖液中可帶正或負電荷，因此在電場中可以向陰極或陽極移動，由于鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞的血紅蛋白的等電點、分子大小和形狀及所帶電荷的不同，在電場中的移動速率也不一樣，反映出來的是遷移率不一樣，因此可以將鐮刀狀細胞血紅蛋白和正常細胞的血紅蛋白區別開來。

5列舉并闡述五種研究蛋白質和DNA相互作用的方法。[華中科技大學2016研]

答：研究蛋白質和DNA相互作用的方法主要有以下幾種：

（1）凝膠阻滯實驗

凝膠阻滯實驗又稱DNA遷移率變動試驗或條帶阻滯實驗，是在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。

原理：在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比。如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，于是朝正極移動的距離也就相應的縮短，因而在凝膠中出現滯后的條帶。

（2）甲基化干擾實驗

原理：是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割，然后再進行凝膠電泳，最后作放射自顯影，讀片并分析結果。

（3）DNA pull down

DNA pull down-MS是體外研究DNA與蛋白互作的有力工具。該技術將生物素標記的DNA片段結合在鏈霉親和素磁珠上，再與細胞核蛋白孵育，純化出與DNA片段互作的蛋白，洗滌洗脫得到的蛋白產物，做western-blot檢測特定蛋白是否與靶DNA片段結合；做質譜鑒定即可篩選出與DNA片段可能互作的蛋白信息（如具體某個或某些轉錄因子/組蛋白等）。

原理：DNA pull down實驗首先針對靶標區域設計DNA探針，探針經過脫硫生物素標記，跟偶聯在磁珠上的鏈霉親和素結合；細胞核提取物與磁珠-DNA探針孵育，純化出與靶DNA片段結合的蛋白復合體，洗脫得到DNA片段的結合蛋白質。

（4）足跡實驗

足跡實驗是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。

原理：當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之后便可以得到保護而免受DNaseI酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，稱為“足跡”。

（5）DNA競爭實驗

原理：在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA，如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結合狀態，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；如果反應體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子，結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶。

6研究蛋白質分離純化時，有關等電點的技術有哪些？[華中科技大學2017研]

答：研究蛋白質分離純化時，有關等電點的技術有：

（1）等電點沉淀法。利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同兩性電解質等電點不同的特性，通過調節溶液pH，使蛋白質或雜質沉淀析出，從而使蛋白質與雜質分離。

（2）離子交換層析。常用的有陽離子交換和陰離子交換。蛋白質與離子交換劑的結合能力取決于彼此間相反電荷基團的靜電吸引，在某一pH條件下，不同蛋白質氨基酸組成不同，等電點不同，所帶的靜電荷性質、數量、與離子交換纖維素的吸附能力不同。通過改變洗脫液的pH和離子強度，可把不同的蛋白質依次洗脫下來。

（3）等電聚焦：使電泳的介質中形成一定范圍的pH梯度，電泳時待分離的兩性分子可以在這種pH梯度中遷移，直到聚集于與其等電點相同的區域。該技術特別適用于分子量相近而等電點不同的蛋白質分離和分析。

（4）層析聚焦。將蛋白質等兩性電解質的等電點的特性和層析的特性結合在一起，實現分離的技術。

7丙氨酸在等電點時，凈電荷為零。凈電荷為零時，丙氨酸的結構式如下所示有兩種，但是在等電點時丙氨酸的主要存在形式是兼性離子形式。（pKa₁＝2.34；pKa₂＝9.69）[山東大學2016研]

（1）為什么丙氨酸在等電點的時候主要以兼性離子的形式存在，而不以不帶電荷的形式存在？

（2）丙氨酸在等電點時，有多少分子以不帶電荷的結構形式存在？寫出推導過程。

答：（1）因為羧基的酸性（pKa₁＝2.34）比質子化的氨基（pKa₂＝9.69）酸性強得多，因此羧基將傾向于供出質子是氨基質子化，并且其平衡常數是10⁷，這表明平衡常數非常強烈地偏向右邊移動：

（2）因丙氨酸的等電點為pH＝6.0，首先需要測定丙氨酸處在等電點時[-COO^－]/[-COOH]和[H₃^＋N]/[-NH₂]的比例。利用Henderson-Hass-elbalch，得到：

所以

即

所以

兩者合并起來考慮，兩性離子與完全不帶電荷的比例是：

因此，丙氨酸處在等電點時，大約有0.4×10^－7分子以不帶電荷的形式存在的。

綜合上述分析，丙氨酸處在等電點時，氨基酸即使以完全不帶電的形式存在，其含量也是非常低的，因此絕大部分丙氨酸在等電點時是以兼性離子形式存在的。

8比較肌紅蛋白與血紅蛋白結合的動力學過程有哪些不同？為什么會造成這樣差別？哪些因素影響血紅蛋白與氧的親和力，分析其原理？[山東大學2016研]

答：（1）肌紅蛋白與血紅蛋白氧飽和曲線，又稱氧結合或解離曲線，肌紅蛋白的氧結合曲線呈雙曲線，而血紅蛋白是S型曲線。因為每個肌紅蛋白分子僅有一個與O₂的結合位置，因此每一肌紅蛋白分子和O₂的結合均是獨立的，和其他肌紅蛋白分子無關；而血紅蛋白分子是由四個亞基所組成，每一個亞基均有一個與O₂的結合位置，血紅蛋白分子對O₂的結合是四個亞基的協同作用的結果。

（2）以下因素可以影響血紅蛋白與氧的親和力

①二氧化碳分壓和pH值

a．二氧化碳分壓增高，氧解離曲線右移，血紅蛋白結合氧的能力降低（血紅蛋白釋放氧的能力增高）。

b．血液pH值降低，氧解離曲線右移，血紅蛋白結合氧的能力降低（血紅蛋白釋放氧的能力增高）。

②溫度

機體溫度增高，氧解離曲線右移，血紅蛋白結合氧的能力降低（血紅蛋白釋放氧的能力增高），促進血紅蛋白快速釋放氧；低溫（低溫麻醉手術時）不利于氧的解離。

③2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）

2,3-DPG含量增加，氧解離曲線右移，血紅蛋白同氧氣的結合力降低。

④其他：Hb自身性質的影響。

9詳述蛋白質一級結構測定的基本步驟，原理及相關實驗技術。[山東大學2017研]

答：（1）蛋白質的一級結構是指蛋白質多肽鏈中氨基酸的序列，一級結構中主要的連接鍵是肽鍵。蛋白質一級結構的測定基本步驟為N端分析、C端分析、肽鏈的拆分、肽鏈的分離純化、肽段的氨基酸序列測定、找“重疊肽”，從而推斷整個肽鏈的氨基酸序列肽鏈氨基酸全序列的確定和二硫鍵位置的確定。

（2）蛋白質一級結構測定的原理為：一級結構的測定多半用小片段重疊的原理，即用兩種或兩種以上不同的方法將蛋白質多肽鏈水解，各自得到一系列肽段，然后將這些肽段分離純化，分別測定這些肽段的氨基酸序列，最后比較這些肽段之間的重疊關系，從而推出整個蛋白質分子中氨基酸的序列。

（3）蛋白質一級結構測定的相關實驗技術如下表所示。

表3-14　蛋白質一級結構測定的相關實驗技術