第二節　納豆激酶的提純

納豆發酵先獲得納豆粉，再從納豆粉純化出納豆激酶。納豆激酶提取、分離、過濾設備見圖3-6至3-8。

一、納豆激酶的提取

方法一　固體發酵得到的納豆發酵粉用0.1 mol/L NaCl溶液于4～10℃攪拌提取，過濾，濾液加0.03%CaCl2，低溫超濾濃縮，加冷酒精至乙醇含量達75%～[4]

80%，得納豆激酶沉淀。

方法二　將納豆激酶發酵液過濾，6000 r/min離心20min，于65%（NH4）2SO4條件下將離心后的發酵液進行超聲波輔助鹽析，鹽析后靜置5min，然后再離心，得沉淀物用磷酸鹽緩沖液溶解，即得納豆激酶粗酶液。

方法三　用4℃的蒸餾水和納豆以1：1（蒸餾水體積/納豆質量）的比例混勻，搗碎，得到泥狀物。4℃，6000 r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥得到納豆激酶粉末。

方法四　將納豆激酶發酵液用0.1μm陶瓷膜進行固液分離，透析液用截留相對分子質量為10 000的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，冷凍干燥得納豆激酶粉末。

二、分離純化

分離純化是納豆激酶的生產和研究中最關鍵的步驟。納豆激酶作為一種溶栓物質，對純度要求很高，分離純化的難度也相對較大。已用于分離納豆激酶的方法有各種柱層析法、膨脹床吸附分離方法等。[5]目前，納豆激酶的分離純化工藝采用最多的仍是傳統的蛋白質純化方法，包括有機溶劑沉淀、鹽析、離心、凝膠色譜柱純化等方法。

1998年的美國專利[6]報道了兩種納豆激酶純化工藝：

①從發酵液中用乙醇分級沉淀。分別用濃度為50%和75%的乙醇處理，離心后沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中，采用丁基瓊脂糖凝膠疏水層析柱，洗脫收集活性部分，脫鹽、濃縮后過陰離子交換柱（Mono-Q），洗脫液再以烷基瓊脂糖凝膠柱分離，得到收率為22.0%的納豆激酶。②從丁基瓊脂糖凝膠洗脫，得到的活性部分作為原料，采用陽離子交換樹脂柱分離，得到的活性洗脫部分再采用Sephacryl S-200分子篩柱分離，得到純品，收率為18.0%。

1994年日本專利[7]采用（NH4）2SO4沉淀。經丁基瓊脂糖凝膠柱后用G-25柱脫鹽，再上Sephacryl S-200分子篩柱，收率為50%。以上專利的純化方法都經過了三步柱層析。

液態發酵生產納豆激酶分離純化的路線[8]如圖3-9所示：

1.鹽析法

中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，稱為鹽溶。當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，此時稱為鹽析。鹽析的發生在于鹽濃度增高到一定數值使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間相互聚集，并從溶液中析出。鹽析法分離純化納豆激酶的操作步驟如下：將納豆激酶粗酶液用（NH4）2SO4鹽析，根據鹽析曲線圖，先調節粗酶液的（NH4）2SO4濃度為較低濃度，4℃冰箱靜置過夜，離心，去除沉淀。上清液調節粗酶液的（NH4）2SO4濃度為較高濃度，再于4℃冰箱靜置過夜，離心，去上清液，沉淀用蒸餾水溶解。得到的即為經過去除雜蛋白的酶液，將酶液脫鹽，濃縮，并考察鹽析操作對納豆激酶活力的影響。

2.離子交換層析法

其基本工藝流程是：離心除菌→鹽析→超濾濃縮→凝膠過濾層析脫鹽→離子交換層析或疏水層析。一般是將多種層析方法結合起來使用。

3.（NH4）2SO4沉淀和層析法將納豆激酶發酵液經離心處理得到上清液，再用30%～70%的飽和（NH4）2SO4進行分段鹽析，得到的沉淀再用10 mmol/L pH 7.4鹽酸鹽緩沖液溶解，然后再進行Sephadexg-50層析，收集活性組分進行QAE-Sephadex A-50離子交換層析，最后采用梯度洗脫。[9]

上述實驗采用了（NH4）2SO4沉淀、凝膠層析和離子交換層析的方法對納豆激酶進行分離純化。其中凝膠層析又稱為分子篩層析或排阻層析，是利用分子大小分離蛋白質混合物的最有效方法之一。

4.離子交換層析

離子交換層析主要是對凝膠層析后的酶液進行精制。其步驟分為：

①進樣。將低溫保存的經過預處理的納豆激酶樣品溶液進樣于層析柱中。

②洗雜。用樣品緩沖液繼續洗脫，洗掉不能吸附的色素等物質，收集穿透峰并檢測有無納豆激酶活性。

③洗脫。采用階段洗脫法，洗脫過程中調節洗脫緩沖液（磷酸鹽緩沖液）的比例，每一階段進行到電導值恒定為止。最后用蒸餾水洗柱。

④收集。以紫外分光光度法檢測洗脫液，分別收集各階段洗脫峰。

⑤酶活檢測。用纖維蛋白平板法檢測洗脫液納豆激酶酶活，找到并收集具有活性的洗脫峰。

⑥酶液的脫鹽及濃縮。將收集的具有活性的洗脫峰溶液透析脫鹽，透析外液為蒸餾水。

5.膨脹床吸附

納豆激酶發酵液泵入膨脹床進行吸附→對膨脹床進行沖洗→納豆激酶的洗脫→在位清洗。該方法具有快速分離純化的特點。

影響膨脹床吸附效果的重要因素有發酵液的pH和電導率。在pH 5.5～7.0范圍內，隨著pH的降低，納豆激酶與吸附劑的作用增強。當pH為6.0時，納豆激酶的回收率最高。但pH過低，會增加雜蛋白的污染，降低納豆激酶的純度。發酵液的電導率過高，納豆激酶不能被吸附。當發酵液經稀釋后電導率降低，納豆激酶的吸附量增加。當電導率低于6.2 mS/cm時，平衡吸附量變化不大。

以下是納豆激酶分離過程的一般處理流程（圖3-10）：

6.反膠團（束）萃取

納豆激酶前萃取的動力是帶正電荷的納豆激酶和帶負電荷的AOT（丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉）親水磺酸基團之間的靜電引力作用。可在50mL具塞三角瓶中進行萃取和反萃實驗，設置體積都為5mL的萃取水相和有機相。在萃取實驗中，有機相為50 mmol/L的AOT-異辛烷反膠團AOT溶液，水相為含20 mmol/L pH 3.0～7.0醋酸或Tris-HCl緩沖液、1.0mg/mL枯草菌溶素、0.1 mol/L NaCl水溶液。以240 r/min的速度在搖床上振蕩，將溫度控制在20℃。再以4000 r/min的速度離心5min，以獲得分組。對照實驗以不含蛋白質的水相同時進行。然后取有機相與反萃水相等體積混合，在35℃的條件下以240 r/min的速度在搖床上振蕩，再以4000 r/min的速度將混合液離心5min，以獲得分組。

實驗中要綜合考慮反萃取率和酶活力之間的關系及各種影響因素。

①在萃取過程中，萃取水相中的pH、離子強度會對納豆激酶的反萃取率產生影響，pH升高蛋白質回收率明顯下降，納豆激酶活力的回收率在pH 6.0～6.5范圍內達到最大，約為80%。

②研究表明，水相中添加異丙醇會強化反萃取過程，極大地提高納豆激酶的反萃取率。隨著異丙醇濃度的增加，蛋白質和酶活力的回收率同步增加。

③在前萃取過程中，有機相和發酵上清液體積比越大，酶活回收率和蛋白回收率越高，以二者等體積混合為宜。

④溫度因素的影響。前萃取過程和反萃取過程的最適溫度分別是25和35℃。

⑤反萃取時負載有機相與反萃水相等體積混合效果最好，酶活性的回收率超過80%。

⑥反萃取時間選擇。隨反萃取時間的延長，反萃取率逐漸升高，大約在20min左右達到平衡。但是反萃取時間過長，使酶活回收率下降。研究表明，以納豆激酶的粗提液為水相與反膠團溶液按比例混合，在10～35℃下進行萃取，使納豆激酶進入反膠團溶液。再在20～45℃下進行反萃取，當異丙醇濃度為20%，反萃取時間為10min時，納豆激酶酶活力回收率最高，并且同時具有濃縮和脫色作用。[10，11]

7.金屬螯合雙水相親和分配技術（IMAP）

此方法中的雙水相萃取具有可以直接處理發酵液的優勢，同時把金屬螯合親合作用引入到雙水相系統，加強了分配的選擇性。金屬螯合雙水相親和分配法具有選擇性好、分離條件溫和、與生物質兼容性好等特點。但該法的缺點是Cu2+容易脫落，對人體造成危害。

金屬螯合雙水相親和分配技術對于表面具有His-Gly-His位點的天然蛋白質或帶有組氨酸標簽的基因工程蛋白具有高度的親和作用。納豆激酶是由275個氨基酸殘基組成的單鏈多肽。氨基酸一級序列結構中存在-His-Gly-Thr-His-結構，可利用二價或三價金屬離子對該結構產生螯合親和作用，再引入雙水相分配系統進行分離。所以，應用IMAP技術進行納豆激酶的分離具有可行性。

實驗對PEG4000的羥基進行活化，以亞氨基二乙酸（IDA）為螯合劑，制取含有Cu2+的金屬螯合親和配基PEG-IDA-Cu2+；以PEG（聚乙二醇）和羥丙基淀粉（PES）形成雙水相，用于直接處理納豆激酶的發酵液，經過兩次分配分離流程回收納豆激酶。并考察聚合物（PEG、PES）的相對分子質量、各自濃度、親和配基（PEG-IDA-Cu2+）加入量、溶液的pH以及納豆激酶發酵液加入量等因素對納豆激酶分配的影響，得到較優的分配體系為：PEG-IDA-Cu2+，5%；相比1.2；pH 8.2；發酵液加入量15%。經過兩次分配，純化因子達到了3.52，總收率為81%。證明用金屬螯合雙水相分配技術從發酵液中直接分離納豆激酶是可行的，[12]見圖3-11，3-12。

8.發酵與泡載分離耦合方法

此方法是在發酵過程中利用泡沫分離法對蛋白質進行富集分離，達到發酵與分離相耦合，可解除終產物反饋抑制作用，縮短生產周期，提高酶活。

9.模擬移動床分離純化

效率較高，可進行連續化生產，縮短時間，節約成本，適合大規模生產。

10.超濾法分離純化納豆激酶

超濾法以壓差為驅動力，是一種有效的膜分離技術。按照截留相對分子質量的大小，可分離0～1000 000的大分子物質。比膜孔小的物質和溶劑一起透過膜，而較大的物質則被截留。

超濾技術具有如下優點：①在操作過程中無相變化。因此，不會改變產品的性能和活性，純化提取條件溫和；②超濾設備和工藝較其他分離方法簡單，耗能低，濾膜可以反復多次使用，是一種工藝簡單、節能環保的提取工藝；③超濾工藝產品處理量大，處理時間短，樣品殘留小，產品收率高。

通過第二章的描述已知，納豆激酶的催化中心由Asp-32、His-64和Ser-221組成，其底物結合位點由Ser-125，Leu-126，Gly-127組成。因此，納豆激酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，其符合絲氨酸蛋白酶（圖3-13）的許多生物學特征。同時，影響其活性的因素也很多。它的提取、分離、純化及活性測定方法也很多，這些方法都各有利弊，在對納豆激酶進行研究及生產時應根據具體情況選擇最佳方法。

參考文獻

[1]高大海.納豆激酶的分離純化和酶學性質的研究.杭州：浙江大學生命學院，2008.

[2]王剛.納豆激酶的固體發酵、分離純化及應用研究.長春：吉林農業大學，2005.

[3]焦曉黎，孫艷萍.發酵納豆中加入中藥后對納豆激酶活力的影響.中國醫藥導報，2008，（9）：36—37.

[4]章震興，孫狄.納豆激酶的生產方法及用途.中國專利，1273274，2000-11-15.

[5]陽承利，邢建民，劉俊果，等.納豆激酶分離純化技術的研究進展.現代化工，2004，（2）：23—25.

[6]Nakanisbi K, Nomuta K, Tma K, et a1.Fibrinolytic protein and production method.US 5750650，1998-05-12.

[7]竹內尚，三遲悟.纖溶活性蛋白酶制造法.JP公開特許6-153977，1994-06-03.

[8]王萍.納豆激酶的深層發酵工藝及分離純化的研究.天津：天津科技大學，2006.

[9]徐慧，吳暉，尹志娜，等.層析法分離純化納豆激酶.食品科技，2013，（4）：241—244.

[10]劉俊果，邢建民，暢天獅，等.反膠團萃取分離純化納豆激酶.科學通報，2006，51（2）：133—137.

[11]楊明俊，楊曉彤，楊慶堯.納豆激酶的發酵和純化方法.大豆科學，2007，26（6）：165—169.

[12]聶光軍，岳文瑾.納豆激酶.生命的化學，2009，29（1）：134—137.