1-2　植物材料半薄切片

【實驗目的】

1.了解半薄切片的原理；

2.掌握植物材料半薄切片的基本操作過程。

【實驗原理】

半薄切片技術是以樹脂作為包埋劑，用超薄切片機或石蠟切片機進行切片的技術。通過該技術得到的切片厚度一般在0.5～3μm之間，通常用于光學顯微鏡進行較細微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位。半薄切片的制備需要經固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟。固定是指通過化學試劑迅速殺死植物細胞，使細胞中的各種細胞器及大分子保持原有生活狀態，不發生位移。脫水的目的是將組織中的游離水徹底清除，便于后續包埋劑的滲入。滲透包埋過程是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細胞內外空隙被包埋劑填充。切片前通過修棄多余樹脂，使樣品暴露出來，截面大小在0.5mm2左右比較理想。切片分為安裝樣品塊和切片刀、對刀、切片、撈片等過程。片子染色后便于在光學顯微鏡下進行細致觀察。由于植物細胞具有細胞壁，部分組織具有致密的細胞結構，低黏度包埋劑Spurr樹脂與傳統的一些樹脂相比，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時間短等優點，更適用于植物材料的包埋處理。

【試劑與器材】

一、試劑

1.FAA固定液（100mL）：37%甲醛溶液10mL，冰醋酸5mL，乙醇50mL，用ddH2O定容至100mL。

2.梯度乙醇溶液：分別將乙醇配制成濃度依次為50%，70%，80%，95%，100%的溶液。3.丙酮。

4.Spurr包埋劑：VCD樹脂10g, DER7368g, NSA（nonenyl succinic anhydride）25g, DM-SA 0.3g，翻轉混合30min，4℃聚合8h以上。

5.硼砂甲苯胺藍染液：稱取甲苯胺藍1g，硼砂1g加100mL蒸餾水，溶解，過濾。

二、器材

真空泵，翻轉混勻儀，制刀機，光學顯微鏡，半薄切片機，烤片臺，烘箱。

三、實驗材料

擬南芥葉片、根尖、水稻花序等。

【實驗步驟】

一、固定

將材料放入FAA固定液，置于真空泵中抽氣至材料下沉，4℃固定過夜。

二、脫水

將材料經過以下梯度濃度的乙醇脫水：

50%乙醇1h→70%乙醇1h→80%乙醇1h→95%乙醇1h→100%乙醇1～2h，重復換2～3次→丙酮1h，重復換2～3次。

三、浸透

將材料經過以下梯度過程浸透：

3/4丙酮+1/4 Spurr包埋劑8～12h→1/2丙酮+1/2 Spurr包埋劑8～12h→1/4丙酮+3/4 Spurr包埋劑8～12h→100%Spurr包埋劑8h，重復換3次。

四、包埋

先往模具中滴加適量新的Spurr包埋劑，將浸透完畢的材料小心包埋于其中，盡量使材料的縱向靠近模具兩端，橫向居中，沉底，再補加包埋劑至稍溢出，75℃聚合過夜。

五、切片

1.修塊：削去材料表面的包埋劑，露出材料以方便切塊。在材料四周以一定角度（一般與水平面呈45°，也可隨材料性質大小靈活選擇），削去包埋劑，側面修成梯形，上窄下寬，防止材料塊斷裂，截面修成矩形或梯形，材料周圍包埋介質應盡量修去。

2.制備玻璃刀（圖1-2-1）：將玻璃條鋸齒狀花紋面朝下放置在制刀機上，截成2.5cm×2.5cm方塊，此時每個方塊的切開面有兩個切跡，此切跡面朝左下，鋸齒狀花紋面朝右下，放在制刀機上，制成45°三角形切片刀。根據王文[4]等報道，右側刀口為最佳玻璃刀口。

為了后續撈片方便，可以在玻璃刀刀口下方安裝水槽接取切片。可以用專門與玻璃刀尺寸合適的塑料水槽，用石蠟固定在切口處；也可用膠帶纏繞一圈，再用石蠟把接縫處封死（如圖1-2-2）。使用前用滴管在水槽中滴滿水。

（a）鋸齒狀花紋朝下放置；（b）切跡面朝左下，鋸齒狀花紋面朝右下；（c）左、中、右三部位刀口的切片效果

3.安裝樣品塊和切片刀：按照切片機的要求，將樣品塊和玻璃刀牢固安裝在切片機上，刀口和包埋塊修塊后暴露出的切面盡量平行。

4.對刀：對刀的目的是使材料達到最大的切面積。先粗調使刀與切面距離約0.5cm，確認切面是否與水平面垂直，再將刀與切面間距離調成近乎是一條細線，并左右移動刀座，粗略判定刀的左右高低，確定刀的使用方向。

5.切片：調好刀與材料塊后，一般先在最左邊刀口進行預修，以判斷材料面是否切全及材料面的平整性，若切面未能切全，就將刀座稍向后移，再略調切面的垂直度，直到可以將切面切全。然后進行試探性預切，并隨時鏡檢，以確定是否切到材料，切到材料后可再將刀座向左移動，用右側刀口切出高質量的切片。

6.撈片：不使用水槽時，用細鑷子小心夾取出切片；有水槽時，用鑷子或細銅絲繞制的小銅網將漂浮在水槽中的切片撈出，在滴有水的干凈載玻片上擺放整齊，100℃展片臺上烤片至切片干透。

六、染色，觀察

在載玻片上滴加硼砂甲苯胺藍染液，100℃烤片10s，用水沖洗多余染液，烤干后在顯微鏡下觀察、拍照。

【結果與分析】

在光學顯微鏡下由低倍鏡向高倍鏡尋找合適視野，觀察植物較細微的組織結構。

【注意事項】

1.植物材料抽氣一定要充分、徹底，否則會影響后續試劑的滲入。

2.植物材料在脫水過程中不可在高濃度酒精（＞70%）中放置過長時間，也不要在100%Spurr包埋劑中放置過長時間。

3.切片時要隨時鏡檢，保證切到材料合適位置時切片的質量（無刀痕，切面完整，片子厚度適宜）。預切時可根據材料性質將切片厚度設置得稍厚一些（＞5μm），切到材料后再切出更薄的切片。撈片時鑷子等用品不要碰到刀口，切片出現劃痕時要立即更換玻璃刀。

4.拍照時，注意調節曝光時間及白平衡設置等，保證所有切片背景顏色、亮度一致，以便于觀察比較。

【參考文獻】

1.賀學禮.2004.植物學實驗實習指導.北京：高等教育出版社.

2.李景原，王太霞.2007.植物學實驗技術.北京：科學出版社.

3.葉創興，馮虎元.2006.植物學實驗指導.北京：清華大學出版社.

4.王文，蔡自力，杜開和.1991.超薄切片玻璃刀制作技術及使用方法的探討.電子顯微學報，（3）：307.

5.鐘秀容，陳蓮云，陳文列.1999.制備電鏡超薄切片的技巧.福建醫科大學學報，33（2）：224-225.

6.李新榮，魏麗，靳黨英，等.1994.常規電鏡標本制作方法的改進.鄭州大學學報（醫學版）（3）.