第一章　形態(tài)觀察常用技術方法

1-1　植物組織石蠟切片的制作

【實驗目的】

1.掌握植物組織石蠟切片的制樣方法；

2.學習觀察光學顯微鏡下的細胞形態(tài)與結構。

【實驗原理】

石蠟切片是生物形態(tài)學觀察中應用最廣泛的技術，樣品經(jīng)過固定后，用乙醇逐級脫水，再用二甲苯取代乙醇進行透明，最后通過浸蠟使樣品最終包埋到純石蠟里，經(jīng)簡單修塊后即可進行切片。切出帶有樣品的蠟帶經(jīng)過后續(xù)的脫蠟、復水、染色后，即可使用光學顯微鏡觀察。如果想要長期保存，還可以制成永久切片。

石蠟切片雖然步驟較為煩瑣，但原理簡單，切片厚度較薄，并且可以連續(xù)切片，因此，一直是植物細胞形態(tài)學常用的方法。通常良好的制樣與染色方法再加上高分辨率的光學顯微鏡，可以觀察到細胞許多細微的結構。

【試劑與器材】

一、試劑

1.固定液：

（1）FAA固定液：乙醇50mL，冰醋酸5mL，37%甲醛溶液（市售福爾馬林）10mL，用水定容至100mL。Triton X-10050μL，加入Triton X-100可以增加滲透性，可根據(jù)自己的材料決定是否添加。

（2）卡諾氏（Carnoy’s）固定液：無水乙醇與冰醋酸以3:1配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.染液：

（1）1%甲苯胺藍染液：甲苯胺藍1g，溶于100mL水。

（2）1%番紅染液：番紅1g，溶于100mL80%乙醇。

（3）0.5%固綠染液：固綠0.5g，溶于100mL95%乙醇。

（4）0.5%伊紅染液：伊紅0.5g，溶于100mL95%乙醇。

（5）蘇木精染液：將蘇木精1g溶于6mL乙醇中，逐滴滴入100mL10%硫酸鋁銨溶液中，充分攪拌后用紗布蒙住瓶口，于陽光直射處放置7～10d。最后加入甘油25mL和甲醇25mL，混勻。染液配制好后，靜置1～2個月，待其氧化成熟變成深紫色后，過濾使用，可長期保存。

3.甘油蛋白粘片劑：蛋白50mL，甘油50mL，水楊酸鈉（防腐劑）1g。

配制方法如下：將一個雞蛋去除蛋黃，只留下蛋白，用玻璃棒快速攪拌成雪花狀泡沫，然后4℃下，用雙層紗布過濾到小燒杯中，此步驟較慢，需經(jīng)數(shù)小時或過夜，濾出的透明蛋白液加入等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合，然后加入水楊酸鈉用于防腐。在4℃可保存幾個月。

4.無水乙醇（分析純），二甲苯（分析純），切片石蠟，中性樹膠，多聚賴氨酸。

二、器材

真空泵，切片機，展片臺，蠟臺，電熱恒溫箱，光學顯微鏡，刀片，鑷子，燒杯，染色缸，載玻片，蓋玻片，解剖針等。

【實驗步驟】

一、取材與固定

用于石蠟切片的樣品大小限制較為寬泛，但最好體積控制在5mm×5mm×2mm以內(nèi)。取樣要快，刀片要鋒利。取樣后，要將組織材料盡快固定。通常采用的固定液有FAA固定液、卡諾氏（Carnoy’s）固定液等。

FAA固定液又稱萬能固定液，在植物細胞形態(tài)學研究領域應用最廣泛。其固定效果很好。固定時間較為寬泛，從24h到數(shù)月皆可。由于FAA固定液本身乙醇濃度為50%，所以材料固定后，脫水步驟可直接從50%乙醇開始。

卡諾氏固定液滲透力較強。常用于固定根尖和花藥，對細胞分裂時期染色體的固定較好。但固定時間不宜過長。

對于植物材料，由于細胞壁和液泡阻礙固定液迅速滲入，一般需用真空泵抽氣2～4h。抽氣時間因樣品幼嫩程度而異，一般判斷標準是恢復到正常大氣壓后，樣品能沉入固定液底部即可，并4℃充分固定過夜。

二、脫水

使用梯度濃度的乙醇置換樣品中的水分。一般按照如下梯度和時間處理：

50%乙醇30min→70%乙醇30min→85%乙醇30min→95%乙醇30min，最后在無水乙醇中脫水3次，每次30min。脫水時間也因樣品幼嫩程度而異，可適當進行調(diào)整。

三、透明

由于二甲苯既能與乙醇互溶，也能與石蠟互溶，因而常用在脫水與浸蠟之間，并且二甲苯具有透明材料的效果。一般將已經(jīng)脫水的樣品放入二甲苯和無水乙醇以1:1混合的混合液中處理1h，再換成純二甲苯透明3次，每次1h。

四、浸蠟

將保存在純二甲苯中的樣品轉(zhuǎn)移至二甲苯和融化石蠟以1:1混合的混合液中（也可以直接在保存于二甲苯的樣品中加入與二甲苯等體積的固體石蠟片，并蓋在樣品上），42℃浸蠟過夜。此后，將樣品換新的純石蠟浸透，并將溫度升至62℃。每天換蠟2～3次，連續(xù)換3d，以最大限度除去二甲苯。

五、包埋

用干凈的銅版紙疊成合適的紙槽，置于60℃蠟臺上，迅速用預熱的鑷子夾取樣品于紙槽中，倒入熔化的純蠟液，沒過樣品。蠟液應具有一定高度，以防止凝固后包埋塊易斷折。樣品要在蠟液中擺正，一般應與紙槽長邊平行，可用酒精燈加熱的解剖針調(diào)整樣品位置。如果紙槽中要放入多個樣品，樣品間最好預留8～10mm的距離以方便后續(xù)的修塊與固定。待紙槽表面的蠟液凝固后，將蠟臺關閉降溫，小心拿出紙槽并置于室溫冷卻，或放入水中冷卻。

六、修塊與切片

切片之前，要將包住石蠟塊的紙槽撕去，并根據(jù)樣品的位置用刀片修塊，蠟塊要修成正方形或梯形，樣品周圍應保留1～2mm寬的石蠟，頂部應修水平。注意：樣品底部也應保留部分石蠟，以便于在木塊上固定。對于較為細長的樣品，周圍應保留更寬的石蠟，以防切片時斷裂。切片時，將樣品垂直對準刀片，根據(jù)所需的切片厚度進行調(diào)整，切片。用鑷子小心夾取蠟帶一端，根據(jù)連續(xù)切出的蠟帶，逐漸伸展，并放在干凈的紙上。依次按照此方法，并記住順序，便可得到連續(xù)的蠟帶。

七、展片與烤片

載玻片需要事先涂上薄薄一層甘油蛋白或者多聚賴氨酸作為粘片劑，待干燥后，滴上適當?shù)乃瑢⑾瀻谐珊线m的大小，按順序伸展在載玻片上。并放置在37℃展片臺上將水分蒸干。待切片干燥后，再直立擺放在切片盒中，置于37℃溫箱中干燥過夜。

八、脫蠟與復水

干燥后的蠟帶需要脫蠟復水后才能進行染色。將載有蠟帶的載玻片整齊擺放于染缸中，按照下列步驟進行逐級脫蠟與復水：

純二甲苯15min（脫蠟時間可根據(jù)蠟帶的厚度適當?shù)卣{(diào)整）→1/2二甲苯+1/2乙醇5min→無水乙醇2min→無水乙醇2min→95%乙醇2min→80%乙醇2min→70%乙醇5min→50%乙醇5min→30%乙醇5min→水5min。

九、染色觀察

根據(jù)不同的觀察目的，細胞可以采用多種染色方法。簡單介紹如下：

1.1%甲苯胺藍染色：可以對全細胞進行染色。將切片用染液染色1～10min，用水洗去殘色，干燥后，即可進行鏡檢。

2.番紅-固綠染色：適用于植物根、莖、葉等組織的染色，可將木質(zhì)化的細胞壁以及細胞核染成紅色，細胞質(zhì)染成綠色。這種染色方法不需要復水，在前面“脫蠟與復水”步驟中用80%乙醇進行處理后，即將切片置于1%番紅染液中染色過夜，然后用80%乙醇脫色5min，再用1%固綠染液染色10s，之后直接進入“永久切片制作”環(huán)節(jié)，從95%乙醇處理開始，完成剩余的步驟制成永久切片。

3.蘇木精-伊紅（HE）染色：可將細胞核染成藍色，細胞質(zhì)染成紅色。將切片用蘇木精染色5～8min后，用水洗去殘色，并用0.1%鹽酸分色數(shù)秒，直至鏡檢顯示細胞核顏色褪為淺紅色后，用水洗去鹽酸，繼續(xù)進行第十步，但在進行后續(xù)第十步“永久切片制作”用95%乙醇處理之前，用0.5%伊紅染液染色數(shù)秒鐘，再繼續(xù)進行剩余的步驟。

十、永久切片制作

在完成染色鏡檢后，如需長期保存切片，可以再次進行脫水、透明，然后用中性樹膠封片。制作過程按照下列步驟進行：

水15s→30%乙醇15s→50%乙醇15s→70%乙醇15s→80%乙醇15s→95%乙醇15s→無水乙醇15s→無水乙醇15s→1/2二甲苯+1/2乙醇15s→純二甲苯15s。

脫水透明完畢后，用濾紙吸去多余的二甲苯，在樣品上滴加一滴中性樹膠，從一側(cè)輕輕加上一片干凈的蓋玻片至完全蓋住樣品，并注意不要產(chǎn)生氣泡。通風處放置約數(shù)天，等待樹脂凝固即可進行觀察照相。

【結果與分析】

【注意事項】

1.二甲苯有毒性，涉及二甲苯的操作請于通風櫥中進行。

2.蠟帶脫蠟以及脫水時間因樣品而異，最好先進行不同處理時間的預實驗，摸索出最佳條件。

【參考文獻】

1.賀學禮.2004.植物學實驗實習指導.北京：高等教育出版社.

2.李景原，王太霞.2007.植物學實驗技術.北京：科學出版社.

3.葉創(chuàng)興，馮虎元.2006.植物學實驗指導.北京：清華大學出版社.