第四節(jié)　蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離純化

蛋白質(zhì)是氨基酸的多聚體，因此它所具有的很多性質(zhì)是由組成它的氨基酸殘基帶來(lái)的，例如紫外吸收、兩性解離和等電點(diǎn)。但作為生物大分子的蛋白質(zhì)又由于其特有的共價(jià)結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)的影響，具有許多特有的性質(zhì)，例如變性、復(fù)性和水解等。利用蛋白質(zhì)的特有性質(zhì)和不同蛋白質(zhì)某些性質(zhì)上的差異而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。

一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)

（一）蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)

蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團(tuán)除肽鏈末端的α-氨基和α-羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團(tuán)，如ε-氨基、β-羧基、γ-羧基、咪唑基、胍基、苯酚基、巰基等。在一定的pH條件下，這些基團(tuán)能解離為帶電基團(tuán)，從而使蛋白質(zhì)帶有電荷。常見(jiàn)氨基酸側(cè)鏈的解離見(jiàn)表1-8。

當(dāng)某蛋白質(zhì)在一定的pH溶液中，所帶的正負(fù)電荷相等，它在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極移動(dòng)也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI。由于一個(gè)蛋白質(zhì)分子含有多個(gè)氨基酸殘基，其解離情況要比單個(gè)氨基酸或一個(gè)小肽復(fù)雜得多，因此一種蛋白質(zhì)的pI不能直接計(jì)算，只能使用等電聚焦等方法測(cè)定。由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在同一pH時(shí)所帶電荷不同，在電場(chǎng)作用下移動(dòng)的方向和速度也不同，所以可用電泳來(lái)分離提純蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的兩性解離如圖1-38所示。

（二）蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)

Trp、Tyr和Phe三種芳香族氨基酸的R基團(tuán)在280nm波長(zhǎng)附近有最大的吸收峰，由于絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都具有這三種氨基酸，所以蛋白質(zhì)也會(huì)有紫外吸收現(xiàn)象，最大吸收峰在280nm。盡管核酸也有紫外吸收，但其最大吸收峰在260nm。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值已成為測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量的最便捷的方法。

（三）蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量在10000～100萬(wàn)，其分子直徑1～100nm，是膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)樵谄浔砻娣植己芏鄻O性基團(tuán)（—NH2、—COOH、—OH、—SH、—CO、—NH等），親水性強(qiáng)，易吸附水，形成水化膜（水化層），使蛋白質(zhì)溶于水，又可隔離蛋白質(zhì)，使其不易沉淀；又因?yàn)樵诜堑入姞顟B(tài)時(shí)，都帶有相同的凈電荷，互相排斥而不易沉淀，并與周圍的相反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層，所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射、電泳、不能透過(guò)半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來(lái)分離純化蛋白質(zhì)，此方法稱透析（dialysis）。

蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)具有重要的生理意義。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)與水結(jié)合構(gòu)成各種流動(dòng)性不同的膠體系統(tǒng)。實(shí)際上，細(xì)胞的原生質(zhì)就是一種復(fù)雜的膠體系統(tǒng)，體內(nèi)許多的代謝反應(yīng)即在此系統(tǒng)中進(jìn)行。

（四）沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)在溶液中靠水化膜和雙電層保持其穩(wěn)定性，水化膜和雙電層一旦失去，蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中絮結(jié)沉淀下來(lái)，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。根據(jù)沉淀后是否能重新溶解成溶液分為可逆沉淀和不可逆沉淀。

1.可逆沉淀

在溫和條件下，改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況或除去水化層，蛋白質(zhì)將從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，又可重新溶解形成溶液的沉淀叫做可逆沉淀，又稱為非變性沉淀。

可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法。主要包括以下幾種。

（1）等電點(diǎn)沉淀法　在蛋白質(zhì)溶液中加酸使其達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（一般蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)皆偏酸性），破壞蛋白質(zhì)表面電荷的排斥作用，蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。

（2）鹽析法　在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽可使蛋白質(zhì)溶解度降低并沉淀析出的現(xiàn)象叫鹽析。鹽在水中迅速解離后，與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜；另外，離子可大量中和蛋白質(zhì)表面上的電荷，使蛋白質(zhì)成為既不含水化膜又不帶電荷的顆粒而聚集沉淀。硫酸銨是最常用的中性鹽。

（3）有機(jī)溶劑沉淀法　某些與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇、丙酮）等可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這是由于有機(jī)溶劑的親和力比水大，能破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，從而使蛋白質(zhì)的溶解度降低并產(chǎn)生沉淀。

2.不可逆沉淀

不可逆沉淀是在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水，又稱為變性沉淀。主要有以下幾種。

（1）加熱沉淀　幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類能促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱變性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然構(gòu)象解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時(shí)也破壞了帶電狀態(tài)。

（2）強(qiáng)酸堿沉淀　由于破壞了氫鍵而造成不可逆沉淀。

（3）重金屬鹽沉淀　當(dāng)pH大于pI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它容易與重金屬離子（Hg2+、Ag+、Pb+等）結(jié)成不溶性鹽而沉淀。

（4）生物堿試劑及某些酸類沉淀法　當(dāng)溶液pH小于pI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。常見(jiàn)的生物堿試劑有單寧酸、苦味酸、鎢酸、三氯乙酸、磺基水楊酸。

（五）蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，使其空間構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能隨之改變或喪失，但未導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，這種現(xiàn)象叫變性（denaturation）。變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白質(zhì)。二硫鍵的改變引起的失活可看作變性。

影響蛋白質(zhì)變性的原因很多，主要是受溫度、pH、有機(jī)溶劑和別構(gòu)激活劑等影響。

（1）溫度　多數(shù)酶在60℃以上開(kāi)始變性，熱變性通常是不可逆的。多數(shù)酶在低溫下穩(wěn)定，但有些酶在低溫下會(huì)鈍化，其中有些酶的鈍化是不可逆的。如固氮酶的鐵蛋白在0～1℃下15h就會(huì)失活，一個(gè)可能的原因是寡聚蛋白發(fā)生解聚，如TMV的丙酮酸羧化酶。

（2）pH　酶一般在pH4～10范圍較穩(wěn)定。當(dāng)pH超過(guò)pK幾個(gè)單位時(shí)，一些蛋白內(nèi)部基團(tuán)可能會(huì)翻轉(zhuǎn)到表面，造成變性。如血紅蛋白中的組氨酸在低pH下會(huì)出現(xiàn)在表面。

（3）有機(jī)溶劑　有機(jī)溶劑能破壞氫鍵，削弱疏水鍵，還能降低介電常數(shù)，使分子內(nèi)斥力增加，造成肽鏈伸展、變性。

（4）胍、尿素等　變性劑胍、尿素等破壞氫鍵和疏水鍵而使蛋白質(zhì)變性。硫氰酸胍比鹽酸胍效果好。

（5）某些鹽類　鹽溶效應(yīng)強(qiáng)的鹽類，如氯化鈣、硫氰酸鉀等，有變性作用，可能是與蛋白質(zhì)內(nèi)部基團(tuán)或溶劑相互作用的結(jié)果。

（6）表面活性劑　如SDS-、CTAB+、triton等。triton因?yàn)椴粠щ姾桑员容^溫和，經(jīng)常用來(lái)破碎病毒。

蛋白質(zhì)變性后分子性質(zhì)改變，黏度升高，溶解度降低，結(jié)晶能力喪失，旋光度和紅外、紫外光譜均發(fā)生變化；變性蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感性增大，易被水解，即消化率上升；變性蛋白質(zhì)基團(tuán)位置改變，包埋在分子內(nèi)部的可反應(yīng)基團(tuán)暴露出來(lái)，反應(yīng)性增加；生物活性失去，抗原性也發(fā)生改變。

這些變化的原因主要是高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，氫鍵等次級(jí)鍵被破壞，肽鏈松散，變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲。由于其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，所以如果變性條件不是過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程，在適當(dāng)條件下還可以恢復(fù)功能。高級(jí)結(jié)構(gòu)松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性。如胃蛋白酶加熱至80～90℃時(shí)，失去活性，降溫至37℃，又可恢復(fù)活力，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性（renaturation）。但隨著變性時(shí)間的增加，條件加劇，變性程度也加深，則達(dá)到不可逆的變性。

研究蛋白質(zhì)的變性，可采取某些措施防止變性，如添加明膠、樹(shù)膠、酶的底物和抑制劑、輔基、金屬離子、鹽類、緩沖液、糖類等，可抑制變性作用。但有些酶在有底物時(shí)會(huì)降低熱穩(wěn)定性。有時(shí)有機(jī)溶劑也可起穩(wěn)定作用，如豬心蘋(píng)果酸脫氫酶，在25℃下保溫30min，酶活力為50%；加入70%甘油后，經(jīng)同樣處理，活力為100%。

變性現(xiàn)象也可加以利用，如用酒精消毒，就是利用乙醇對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用來(lái)殺菌。在提純蛋白質(zhì)時(shí)，可用變性劑除去一些易變性的雜蛋白。工業(yè)上將大豆蛋白變性，使它成為纖維狀，就是人造肉。

蛋白質(zhì)經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用發(fā)生變性后，仍能溶解于強(qiáng)堿或強(qiáng)酸溶液中，若將pH調(diào)至等電點(diǎn)，則變性蛋白質(zhì)立即結(jié)成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍可溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，如再加熱則絮狀物可變成較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸與強(qiáng)堿中，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。如雞蛋煮熟后本來(lái)流動(dòng)的蛋清變成了固體。實(shí)際上凝固是蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆的結(jié)果。

（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)也和氨基酸一樣，游離的α-氨基、α-羧基和R基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)基團(tuán)類似的反應(yīng)；N端的氨基酸殘基也能與茚三酮發(fā)生定量反應(yīng)，生成呈色物質(zhì)。但蛋白質(zhì)因?yàn)榫哂刑厥饨Y(jié)構(gòu)而具有氨基酸不具有的反應(yīng)——雙縮脲反應(yīng)。通常可用此反應(yīng)來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色深淺在540nm處進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

（七）蛋白質(zhì)的水解

酸、堿及蛋白質(zhì)水解酶皆可破壞蛋白質(zhì)的肽鍵使蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列的中間產(chǎn)物，最后產(chǎn)生氨基酸，這些中間產(chǎn)物中最主要的是蛋白胨。蛋白胨可溶于水，遇熱不凝固，不被飽和的硫酸銨溶液所沉淀，常被用作細(xì)菌培養(yǎng)基的成分。

二、蛋白質(zhì)的分離、純化

蛋白質(zhì)的分離和純化不僅有助于研究蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)與功能，也有助于研究其基因的結(jié)構(gòu)與功能，而且具有工業(yè)或醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值的蛋白質(zhì)也需要得到它們的純品。例如，如果無(wú)法直接得到一種蛋白質(zhì)的基因，那么通過(guò)純化蛋白質(zhì)，就可以測(cè)出它的一部分的氨基酸序列，然后根據(jù)遺傳密碼表設(shè)計(jì)和制作核酸探針，去“釣”出它的基因；或者以純化的蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物得到抗體，從cDNA表達(dá)文庫(kù)中分離出它的基因。如果已經(jīng)分離得到一種蛋白質(zhì)的基因，那么在純化到這種基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物以后，可以對(duì)其性質(zhì)、構(gòu)象及其功能進(jìn)行全方位的研究。

（一）分離純化的一般步驟

分離純化某一種蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)分離、細(xì)分級(jí)分離和結(jié)晶四步。

（1）前處理　制備一個(gè)蛋白質(zhì)樣品首先要考慮它是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，如果在細(xì)胞外（如血清、尿等體液）就可以直接進(jìn)行分離。但實(shí)際上大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)，就要將細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。細(xì)胞破碎的方法很多，破碎動(dòng)物細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器或超聲波破碎法。對(duì)植物組織可使用勻漿器或采用石英砂與抽提液混合研磨的方法。微生物細(xì)胞的破碎由于細(xì)胞壁的存在而比較困難，常用的方法是用溶菌酶（破壞細(xì)胞壁的肽聚糖）處理除去細(xì)胞壁后再加超聲波處理破碎的方法，而工業(yè)上常采用微小石英砂混合研磨法、減壓法等。如果待制備的蛋白質(zhì)位于某一個(gè)細(xì)胞器中，可在破碎細(xì)胞后通過(guò)差速離心法得到該細(xì)胞器，這樣就可以除盡細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)。如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。

（2）粗分級(jí)分離　當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物的提取液獲得后，選用一套適當(dāng)分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開(kāi)。一般這一步采用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。

（3）細(xì)分級(jí)分離　即將樣品進(jìn)一步提純的過(guò)程。樣品經(jīng)粗分級(jí)以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去，但還需進(jìn)一步純化，以獲得單一的蛋白質(zhì)樣品。通常采用色譜法（凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜、吸附色譜、親和色譜、疏水色譜）、電泳法（自由界面電泳、凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳、盤(pán)電泳、等電聚焦、雙向電泳）、密度梯度離心等。

（4）結(jié)晶　結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。當(dāng)溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)，通過(guò)控制溫度、加鹽鹽析、加有機(jī)溶劑或調(diào)節(jié)pH等方法能使蛋白質(zhì)結(jié)晶，接入晶種能加速結(jié)晶。

（二）蛋白質(zhì)分離純化的方法

分離純化蛋白質(zhì)的各種方法都是利用蛋白質(zhì)的各種理化性質(zhì)，例如，質(zhì)量和形狀、溶解性、表面電荷、表面吸附性、與特定配體結(jié)合性、表面疏水性等。

常用的方法有：沉淀（溶解性）、離子交換（電荷性）、聚焦色譜（電荷性）、凝膠過(guò)濾（大小和形狀）、疏水作用色譜（疏水性）等。

在純化過(guò)程中，有時(shí)候樣品體積較大，需要進(jìn)行濃縮以縮小體積。常用的濃縮法有：沉淀、凍干、對(duì)50%甘油透析、對(duì)固體聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）透析、超濾等。

下面就蛋白質(zhì)的性質(zhì)對(duì)一些方法和原理做簡(jiǎn)單介紹。

1.根據(jù)分子大小差異分離蛋白質(zhì)

（1）透析（dialysis）　利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)，使它與其他小分子化合物如無(wú)機(jī)鹽、單糖、氨基酸以及表面活性劑等分離的方法。此方法常被用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)或改變蛋白質(zhì)的溶液組成。常用的半透膜有玻璃紙、火棉紙和其他改型的纖維素材料，截止分子量一般為10000。

（2）超濾（ultrafiltration）　對(duì)透析原理進(jìn)行了改進(jìn)，在一定的壓力或離心力下，使蛋白質(zhì)溶液在通過(guò)一定孔徑的超濾膜時(shí)，小分子量的物質(zhì)濾過(guò)，而大分子量的蛋白質(zhì)被截留，從而達(dá)到脫鹽、濃縮或更換緩沖液的目的。

（3）密度梯度（區(qū)帶）離心　在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行的一種沉降速度離心，被離心的物質(zhì)根據(jù)其沉降系數(shù)不同進(jìn)行分離。沉降速度與顆粒的質(zhì)量、密度和形狀有關(guān)。質(zhì)量和密度大的顆粒沉降較快，離心后按沉降的速度不同，彼此分開(kāi)形成區(qū)帶（停止于與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度）。常用蔗糖或甘油來(lái)制備梯度。密度梯度離心是依賴時(shí)間的，如果離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，已經(jīng)分離的物質(zhì)均可沉降到離心管的底部或某一區(qū)域。

（4）平衡密度梯度離心　也是在密度梯度中進(jìn)行的，但被分離的物質(zhì)是依靠它們的密度不同進(jìn)行分離的，此種離心常用CsCl等無(wú)機(jī)鹽類制備密度梯度。在梯度介質(zhì)中，當(dāng)被分離的物質(zhì)分別達(dá)到與其密度相同的介質(zhì)部位時(shí)就不再移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。平衡密度梯度離心是不依賴于時(shí)間的，只要梯度不破壞，時(shí)間延長(zhǎng)也不影響分離。

（5）凝膠過(guò)濾（gelfiltration）　又稱分子排阻或分子篩色譜，即以具有分子篩效應(yīng)的惰性顆粒狀多孔網(wǎng)狀物質(zhì)為支持物，根據(jù)分子大小的不同分離物質(zhì)的技術(shù)（圖1-39）。較大的分子不能或很難進(jìn)入多孔凝膠顆粒內(nèi)部，通過(guò)顆粒間隙向下流動(dòng)，行程短，被先洗脫下來(lái)；較小的分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，路徑迂回曲折，行程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)。從而達(dá)到按不同分子量將溶液中各組分分開(kāi)的目的。

凝膠過(guò)濾介質(zhì)是凝膠珠（或稱凝膠顆粒），內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其交聯(lián)度或孔度決定凝膠的分級(jí)分離范圍。常用的凝膠：交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose，或Bio-GelA）、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）。

凝膠過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)是分離條件溫和，不影響樣品的生物活性，樣品損失小，回收率高，所以廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化。目前已有將離子交換色譜與凝膠過(guò)濾兩者結(jié)合起來(lái)，如DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose等，分離過(guò)程中既有電荷效應(yīng)又有分子篩效應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化更為有效。

2.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離

影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素主要有溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)、溫度等。根據(jù)蛋白質(zhì)這一性質(zhì)分離的方法主要有以下幾種。

（1）鹽析（salting out）　硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽因能破壞蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定存在的兩大因素（鹽類離子與水的親和性大，又是強(qiáng)電解質(zhì)，可與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜；大量地中和蛋白質(zhì)顆粒上的表面電荷），故能使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。不同蛋白質(zhì)分子顆粒大小不同，親水程度不同，故鹽析所需要的鹽濃度不同。如用硫酸銨分離清蛋白和球蛋白，在半飽和的硫酸銨溶液中，球蛋白即可從混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在飽和硫酸銨中才會(huì)沉淀。鹽析的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。

鹽析時(shí)所需的鹽濃度稱為鹽析濃度，用飽和百分比表示。由于不同蛋白質(zhì)的分子大小及帶電狀況各不相同，所以鹽析濃度亦不同。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度使混合液中不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，稱之為分段鹽析。

（2）鹽溶（salting in）　當(dāng)在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽的濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。這是由于蛋白質(zhì)顆粒上吸附某種無(wú)機(jī)鹽離子后，使蛋白質(zhì)顆粒帶同種電荷而相互排斥，并且與水分子的作用加強(qiáng)，從而使溶解度增加。

同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比單價(jià)中性鹽如NaCl、NH4Cl等大得多，這與離子強(qiáng)度相關(guān)。

（3）有機(jī)溶劑分級(jí)分離法　凡能與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇、丙酮等）均可用于沉淀蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑能降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間相互吸引而沉淀（庫(kù)侖定律：介電常數(shù)的降低將增加兩個(gè)相反電荷之間的吸引力）；而其還能與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子破壞其水化膜而使其沉淀分離。為防止蛋白質(zhì)在分離過(guò)程中發(fā)生變性，有機(jī)溶劑濃度不能太高（30%～50%），且需要在低溫條件下進(jìn)行。

3.根據(jù)電荷差異分離

即根據(jù)蛋白質(zhì)酸堿性質(zhì)的不同分離蛋白質(zhì)的技術(shù)方法，常包括電泳和離子交換色譜技術(shù)。帶電顆粒在外加電場(chǎng)下，向著帶相反電荷的電極發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳或離子泳（ionphoresis）。蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中為帶電顆粒，故可在電場(chǎng)中發(fā)生泳動(dòng)。移動(dòng)的方向和速度取決于所帶凈電荷的正負(fù)性、所帶電荷的多少以及分子顆粒的大小和形狀。由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以在同一pH溶液中所帶電荷不同，在電場(chǎng)中移動(dòng)的方向和速度也各不相同，因此可以通過(guò)電泳的方法將混合的各種蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。影響電泳遷移率的因素有很多，主要是：電位梯度、電流密度、導(dǎo)電性、環(huán)境pH（分子電荷）、離子強(qiáng)度、分子的大小和形狀。根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設(shè)計(jì)不同的電泳方法以達(dá)到預(yù)期的目的。

電泳有不同的分類方式。按照分離的原理電泳可以分為區(qū)帶電泳、移動(dòng)界面電泳、等速電泳和等電聚焦；按照支持物的有無(wú)又可以分為自由電泳和支持物電泳。

（1）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-PAGE）　這是一種不加變性劑，直接以具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠為支持物分離天然蛋白質(zhì)的凝膠電泳方法。主要根據(jù)電荷性質(zhì)的不同，分子的大小和形狀也起一定作用。尤其是用分子篩效應(yīng)較明顯的凝膠作支持物時(shí)，分子的大小和形狀起著較大的作用。小的、近球形的分子遷移速度快。

（2）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）　利用變性劑SDS處理蛋白質(zhì)后，在變性條件下進(jìn)行的聚丙烯酰胺凝膠電泳，即“變性”電泳（圖1-40）。SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水作用，之后以烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合，結(jié)合比例為1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)。其分離依據(jù)為蛋白質(zhì)分子的大小（質(zhì)量）。SDS-PAGE的基本原理和特點(diǎn)如下。

① 蛋白質(zhì)經(jīng)還原劑處理后，二硫鍵斷裂，非共價(jià)鍵相互作用被破壞，亞基分離。

② 蛋白質(zhì)經(jīng)SDS處理后帶大量負(fù)電荷，掩蓋了原來(lái)的電荷差異，且負(fù)電荷量與蛋白質(zhì)分子量成比例。

③ 凝膠中的泳動(dòng)速度僅取決于分子量的大小。在1萬(wàn)～20萬(wàn)范圍內(nèi)，遷移率（移動(dòng)距離）與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。

④ 可測(cè)定蛋白質(zhì)的純度、分子量及分子中的亞基數(shù)。

（3）等電聚焦（isoelectrofocusing，IEF）　是在具有pH梯度的介質(zhì)（如濃蔗糖溶液）中進(jìn)行的電泳，是一種具有高分辨率的自由界面電泳。

等電聚焦電泳技術(shù)就是在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場(chǎng)力作用而泳動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達(dá)它的等電點(diǎn)位置，分子所帶凈電荷為0，就不能再遷移。因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”，保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點(diǎn)。

pH梯度的形成依靠有緩沖作用的兩性載體電解質(zhì)，載體電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5～10.0，載體兩性電解質(zhì)溶液的pH大約是該溶液pH范圍的平均值。在沒(méi)有電流時(shí)，所有載體兩性分子都帶電荷，所帶總的凈電荷為0。

（4）雙向電泳（two dimensional electrophoresis）（2-DE）　雙向電泳（圖1-41）是等電聚焦與SDS-PAGE結(jié)合得到的一種高分辨率的電泳方法，是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。第一向：等電聚焦；第二向：SDS-PAGE，先后分別按蛋白質(zhì)所帶電荷和分子大小（質(zhì)量）進(jìn)行分離，分辨率提高。

電泳完畢，可用多種方法使蛋白質(zhì)在2-DE凝膠中顯現(xiàn)。常用的有：用顯色劑（如考馬斯亮藍(lán)、AgNO3）浸染后可顯示出蛋白質(zhì)組分區(qū)帶；也用免疫印跡法，即將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜片的過(guò)程。

4.根據(jù)物質(zhì)的電離性質(zhì)差異進(jìn)行分離

被分離物質(zhì)的離子與離子交換劑上的平衡離子進(jìn)行交換，然后用適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫。由于各種被分離物質(zhì)離子的凈電荷量不同，與載體上的可解離基團(tuán)的結(jié)合力大小不同，所以被先后洗脫下來(lái)。色譜柱中填充的是能與溶液中的正離子或負(fù)離子進(jìn)行交換的離子交換劑，由不溶性載體上共價(jià)連接可電離的基團(tuán)制成。

在離子交換色譜中，蛋白質(zhì)對(duì)離子交換的結(jié)合力取決于彼此間相反的電荷基團(tuán)的靜電吸引，因此與溶液的pH和鹽濃度有關(guān)。蛋白質(zhì)混合物的分離可以通過(guò)改變洗脫液的鹽離子強(qiáng)度和pH來(lái)完成。改變洗脫劑的鹽濃度和pH的方式有兩種：一種是跳躍式的分段改變，稱為分段洗脫（stepwise elution）；另一種是漸進(jìn)式的連續(xù)改變，稱為梯度洗脫（gradient elution），梯度洗脫一般分離效果好，分辨率高。

5.根據(jù)蛋白質(zhì)與特定配體結(jié)合的親和力分離

親和色譜是利用蛋白質(zhì)與配體的特異性親和力而建立的色譜分離方法。其固定相是惰性的帶有共價(jià)結(jié)合的配體基質(zhì)，而配體（ligand）是能被生物大分子識(shí)別并與之結(jié)合的原子、原子團(tuán)和分子。其基本原理和操作如下。

① 將配體共價(jià)結(jié)合于惰性多孔載體上（即固定化），灌裝制成親和色譜柱。

② 讓蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)色譜柱，使目的蛋白與配體結(jié)合。用緩沖液充分流洗，洗去不結(jié)合和非特異結(jié)合的雜蛋白。

③ 用含較高濃度游離（可溶）配體的緩沖液將特異結(jié)合的蛋白質(zhì)（競(jìng)爭(zhēng)）洗脫下來(lái)；或改變洗脫液的pH或鹽濃度等，使目的蛋白與配體的結(jié)合力下降而被洗脫。

④ 透析除去目的蛋白質(zhì)分子上的配體。

可用于親和色譜的具有特異性親和力的生物分子對(duì)主要有：酶與底物/抑制劑；受體與激素；抗體和抗原；抗體與蛋白質(zhì)A；His標(biāo)簽與金屬鎳；GST標(biāo)簽與谷胱甘肽；蛋白質(zhì)與染料；糖蛋白與植物凝集素（lectin）；特異結(jié)合蛋白與被結(jié)合的配體。

親和色譜純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速、高效，有時(shí)能夠“一柱到位”。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)特別有效。

6.根據(jù)疏水性分離

疏水作用色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）也稱疏水色譜，是利用蛋白質(zhì)表面的非極性基團(tuán)和介質(zhì)上的非極性基團(tuán)間的疏水作用來(lái)分離蛋白質(zhì)的色譜方法。在水溶液中蛋白質(zhì)表面的Leu、Val和Phe等非極性側(cè)鏈形成疏水區(qū)，因而容易與介質(zhì)上的疏水基團(tuán)作用而被吸附。由于不同蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)強(qiáng)弱有較大差異，造成與介質(zhì)上的疏水基團(tuán)間相互作用的強(qiáng)弱不同，改變色譜條件，使不同的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

疏水作用色譜的介質(zhì)一般以瓊脂糖為母體，偶聯(lián)上非極性基團(tuán)，如苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖等。離子濃度對(duì)疏水作用色譜有較大影響，高離子濃度會(huì)增加疏水作用，特別是硫酸銨效果尤為明顯。因此疏水作用色譜一般在高濃度的硫酸銨存在下將蛋白質(zhì)吸附在介質(zhì)上，然后改變色譜條件，減弱疏水作用，如采用逐漸降低硫酸銨的濃度進(jìn)行洗脫，這樣可按蛋白質(zhì)與介質(zhì)的疏水作用的強(qiáng)弱程度將蛋白質(zhì)分別洗脫下來(lái)，達(dá)到純化的目的。

7.其他分離方法

（1）高效液相色譜（HPLC）　也稱為高壓液相色譜。它實(shí)際上是離子交換色譜、凝膠過(guò)濾、吸附色譜和分配色譜等技術(shù)的新發(fā)展。因此一方面它以這些色譜的原理為基礎(chǔ)，另一方面在技術(shù)上作了很大的改進(jìn)，使這些色譜有高效率、高分辨率和更快的過(guò)柱速度。HPLC已成為當(dāng)前最通用、最有力和最多能的色譜形式。HPLC可用于蛋白質(zhì)、氨基酸和其他生物分子的分析與制備。

（2）快速蛋白質(zhì)液相色譜（FPLC）　由高流率代替了HPLC的高壓力，并具有容量大和高分離度的雙重特點(diǎn)，可使用各種色譜填料（載體）。在色譜過(guò)程中，上樣、洗脫、收集、監(jiān)控全部自動(dòng)化，只要根據(jù)被分離物質(zhì)的特性來(lái)選擇不同的色譜填料，設(shè)置操作程序，所有操作全部自動(dòng)完成。目前已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽及重組質(zhì)粒等的分離純化。

（三）蛋白質(zhì)分離純化的一般注意事項(xiàng)

在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)的純化時(shí)，都要時(shí)刻注意維護(hù)它的穩(wěn)定性，保護(hù)它的活性，有一些注意事項(xiàng)需要牢記，具體如下：

① 操作時(shí)盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)進(jìn)行。

② 不要太稀，蛋白質(zhì)濃度維持在μg/ml～mg/ml。

③ 合適的pH，除非是進(jìn)行聚焦色譜，所使用的緩沖液pH避免與pI相同。

④ 使用蛋白酶抑制劑，防止蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解。

⑤ 避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動(dòng)，以防止蛋白質(zhì)的變性。

⑥ 緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

⑦ 在緩沖液中加入0.1～1mmol/L DTT（或β-巰基乙醇），防止蛋白質(zhì)的氧化。

⑧ 加1～10mmol/L EDTA金屬螯合劑，防止重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞。

⑨ 使用滅菌劑，防止微生物生長(zhǎng)。

三、蛋白質(zhì)的鑒定

用各種方法將蛋白質(zhì)分離、純化后，要對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。主要包括純度鑒定、分子量測(cè)定、含量測(cè)定、等電點(diǎn)及生物活性的測(cè)定等。

1.純度鑒定

純凈的蛋白質(zhì)樣品通常不含其他雜蛋白和雜質(zhì)。一般認(rèn)為，當(dāng)一種蛋白質(zhì)被純化到恒定的比活性以后或達(dá)到所謂的均一性以后，就認(rèn)為是純品了。然而，單憑恒定的比活性尚不夠，還需要用其他方法加以驗(yàn)證。其他鑒定蛋白質(zhì)純度的方法如下。

（1）電泳法　如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦和毛細(xì)管電泳等，純凈的蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果應(yīng)該是一條帶。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則應(yīng)特別小心，因?yàn)镾DS能夠破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，如果一種蛋白質(zhì)由不同的亞基組成，則會(huì)出現(xiàn)幾條帶。此外，電泳法檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度時(shí)，應(yīng)取分布在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)不同的pH分別進(jìn)行檢測(cè)，這樣得出的結(jié)論才可靠。

（2）化學(xué)法　N端測(cè)定，C端測(cè)定。純品蛋白質(zhì)應(yīng)具有恒定的N端或C端組成。如果一種蛋白質(zhì)只由一條鏈組成，則只會(huì)檢測(cè)到一種N端或C端氨基酸。

（3）儀器法　HPLC或質(zhì)譜分析儀。如果一種蛋白質(zhì)樣品在HPLC上只表示單一的峰，則可以視為純品；如果純化的是一種已知的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析測(cè)定出來(lái)的分子量與實(shí)際值一致，那么則可認(rèn)為是純品。

一般檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度必須綜合兩種機(jī)制不同的分析方法才能做出準(zhǔn)確的判斷。例如，一個(gè)用凝膠過(guò)濾和SDS-PAGE證明是純的蛋白質(zhì)的樣品，由于這兩種方法的機(jī)制是一樣的，都是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小，因而此判斷是欠考慮的。

2.分子量測(cè)定

（1）幾個(gè)基本單位

① 分子量　用“Mr”表示，是該分子質(zhì)量與C12原子質(zhì)量的1/12的比值，既然是個(gè)比值，故它沒(méi)有單位。

② 分子質(zhì)量　它是分子的質(zhì)量，用“m”表示，用道爾頓（Da）作單位，1Da=C12原子質(zhì)量的1/12，1kDa=1×103Da，1MDa=1million daltons=1×106Da。

如一個(gè)分子的質(zhì)量是水分子的1000倍，則可以說(shuō)該分子：Mr=18000或m=18000Da=18kDa，但不能說(shuō)：Mr=18000Da。

另外還有一個(gè)是原子質(zhì)量單位“u”，1u=1.6606×10-24g，這種單位多見(jiàn)于質(zhì)譜圖中。

（2）測(cè)定方法

① 化學(xué)法　根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低分子量，用化學(xué)分析方法測(cè)出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)分子中只有一個(gè)這種元素的原子，就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。

例如，肌紅蛋白含鐵0.335%，其最低分子量可依下式計(jì)算：

最低分子量=鐵的原子量÷鐵的百分含量

計(jì)算結(jié)果為16700，與其他方法測(cè)定結(jié)果極為接近，可見(jiàn)肌紅蛋白中只含一個(gè)鐵原子。

真實(shí)分子量是最低分子量的n倍，n是蛋白質(zhì)中鐵原子的數(shù)目，肌紅蛋白n=1。血紅蛋白鐵含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因?yàn)楹?個(gè)鐵原子，所以n=4，因此其真實(shí)分子量為66800。

有時(shí)蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸含量很少，也可用這種方法計(jì)算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量為35200，用其他方法測(cè)得分子量為69000，所以其分子中含兩個(gè)色氨酸。最低分子量只有與其他方法配合才能確定真實(shí)分子量。

② 凝膠過(guò)濾色譜法　物質(zhì)分子的分子量大小與洗脫體積（Ve）有關(guān)，反過(guò)來(lái)可根據(jù)某物質(zhì)的Ve或Ve/Vo推測(cè)出其分子量。

③ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量　前面談到，蛋白質(zhì)分子在介質(zhì)電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等。1967年Shapiro等發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量的巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與原來(lái)所帶的電荷和分子形狀無(wú)關(guān)，利用此則可以測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。

④ 質(zhì)譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)分子量　質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)分子量是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，其分辨率和精確度都較前幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其近幾年發(fā)展起來(lái)的磁質(zhì)譜可精確測(cè)定分子質(zhì)量2000Da以下的多肽；而電噴霧（ESI）質(zhì)譜可以測(cè)50000Da的蛋白質(zhì)，而且只需要皮摩爾（pmol）量的蛋白質(zhì)，精確度為0.01%。

⑤ 沉降速度法測(cè)分子量　蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時(shí)，由于密度關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，離心管底部的蛋白質(zhì)濃度增高，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用（sedimentation）。每單位引力場(chǎng)沉降分子下沉的速率稱為沉降常數(shù)，它表示沉降分子的大小特性。蛋白質(zhì)分子量與沉降常數(shù)成正比，與擴(kuò)散常數(shù)成反比，從蛋白質(zhì)的沉降常數(shù)和擴(kuò)散常數(shù)，即可求得蛋白質(zhì)的分子量。

3.蛋白質(zhì)含量測(cè)定

（1）凱式定氮法　蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，這是蛋白質(zhì)元素組成的一個(gè)特點(diǎn)，是凱式定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.25

式中　6.25——即16%的倒數(shù)，為1g氮所代表的蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）。

（2）雙縮脲法　用于需快速但不需十分精確地測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

（3）Folin-酚試劑法　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，基于Folin-酚試劑能與Cu+定量反應(yīng)，而Cu+是由蛋白質(zhì)的易氧化成分（如巰基、酚基）還原Cu2+產(chǎn)生的。

（4）紫外吸收法（280nm）　精度不高，操作簡(jiǎn)便。

（5）考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法（Bradford法）　靈敏度高，微克（μg）水平，重復(fù)性也好。G250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（Arg）和芳香族氨基酸結(jié)合，呈青色，A值與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。

對(duì)于特定蛋白組分的含量測(cè)定，通常采用特定的方法。比如，酶和激素等常采用酶活性或激素活性表示（比活性）。