第三節　蛋白質結構與功能

根據長期研究蛋白質的結果顯示，所有蛋白質的特征是具有通過共價鍵和非共價鍵形成的空間構象。

一、蛋白質分類

蛋白質的分類方法至少有4種，一是根據蛋白質分子的形狀，二是根據蛋白質組成，三是根據蛋白質的溶解性，四是根據蛋白質的功能。

1.根據分子的形狀蛋白質可分為球狀蛋白質和纖維狀蛋白質

（1）球狀蛋白質　分子似球形，較易溶解，如血液的血紅蛋白、血清球蛋白，豆類的球蛋白等。

（2）纖維狀蛋白質　形狀似纖維，不溶于水，如指甲、羽毛中的角蛋白和蠶絲的絲蛋白等。

2.根據組成蛋白質可分為單純蛋白質和結合蛋白質

（1）單純蛋白質　其組分只有α-氨基酸，自然界的許多蛋白質都屬于此類。

（2）結合蛋白質　由單純蛋白質與非蛋白質物質結合而成，主要包括如下幾類。

① 色蛋白　為簡單蛋白質與其他色素物質結合而成，如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。

② 糖蛋白　為蛋白質與糖類結合而成，如唾液中的黏蛋白、硫酸軟骨素蛋白和細胞膜的糖蛋白等。

③ 磷蛋白　為蛋白質與磷酸結合而成，如酪蛋白、卵黃蛋白等。

④ 核蛋白　為蛋白質與核酸結合而成，存在于一切細胞中。

⑤ 脂蛋白　為蛋白質與脂類結合而成，如血清α-脂蛋白、β-脂蛋白及作為細胞膜和細胞主要成分的脂蛋白。

3. 根據溶解度蛋白質又可分為下列幾類

（1）清蛋白　又稱白蛋白。溶于水，如血清清蛋白、乳清蛋白等。

（2）球蛋白　微溶于水，溶于稀中性鹽溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。

（3）谷蛋白　不溶于水、醇及中性鹽溶液，但溶于稀酸、稀堿，如米蛋白、麥蛋白。

（4）醇溶蛋白　不溶于水，溶于70%～80%乙醇，如玉米蛋白。

（5）精蛋白　溶于水及酸性溶液，呈堿性，含堿性氨基酸多（如精氨酸、賴氨酸、組氨酸），如鮭精蛋白。

（6）組蛋白　溶于水及稀酸溶液，含精氨酸、賴氨酸較多，呈堿性，如珠蛋白。

（7）硬蛋白　不溶于水、鹽、稀酸、稀堿溶液，如膠原蛋白，毛、發、蹄、角及甲殼的角蛋白和絲心蛋白以及腱和韌帶中的彈性蛋白等。

4.根據功能蛋白質可分為活性蛋白質與非活性蛋白質

（1）活性蛋白質　包括在生命過程中一切有活性的蛋白質及其前體，如酶、激素蛋白質、運輸蛋白質、運動蛋白質、貯存蛋白質、保護或防御蛋白質、受體蛋白質、毒蛋白質、控制生長和分化的蛋白質以及膜蛋白質等。

（2）非活性蛋白質　這類蛋白質對生物體起保護或支持作用。如硬蛋白，包括膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白和絲心蛋白等。

蛋白質的主要功能見表1-5。

二、蛋白質結構的組織層次

蛋白質分子不僅功能多樣，而且結構十分復雜。為便于描述和理解這種復雜的結構，通常將蛋白質結構分為四個組織層次（organization level），并采用以下專門術語描述：蛋白質的一級結構（primary structure），指多肽鏈中氨基酸的排列順序；蛋白質的二級結構（secondary structure），指在多肽鏈一級結構的基礎上，主鏈原子按照一定的方式通過氫鍵而形成的有規則的α螺旋或β折疊等結構；蛋白質的三級結構（tertiary structure），指整個多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，借助非共價力相互作用，進一步盤曲折疊形成的特定的整個空間結構；蛋白質的四級結構（quaternary structure），指2個或2個以上具有獨立的三級結構的多肽鏈（亞基），彼此借次級鍵相連，形成一定的空間結構（圖1-23）。

蛋白質的一級結構中氨基酸殘基是由共價鍵連接的。二級結構和其他高級結構主要是由非共價鍵如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水相互作用維系的。必須強調指出，一個蛋白質分子為獲得復雜結構所需的全部信息都存在于一級結構即多肽鏈的氨基酸序列中。

三、蛋白質的一級結構

蛋白質的一級結構是指蛋白質多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。維系蛋白質一級結構的主要化學鍵是肽鍵。氨基酸序列是蛋白質分子結構的基礎，它決定蛋白質的高級結構。一級結構可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N末端向C末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符（—）隔開。

1954年英國生化學家Sanger報道了胰島素的一級結構，是世界上第一例確定一級結構的蛋白質，Sanger由此獲1958年Nobel化學獎。1965年我國科學家完成了結晶牛胰島素（圖1-24）的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質。

胰島素（insulin）由51個氨基酸殘基組成，分為A、B兩條鏈。A鏈有21個氨基酸殘基，B鏈有30個氨基酸殘基。A、B兩條鏈之間通過兩個二硫鍵聯結在一起，A鏈另有一個鏈內二硫鍵。

自1953年Sanger報道了牛胰島素兩條多肽鏈的氨基酸序列以來，已有100000多個不同蛋白質的氨基酸序列被測定（簡稱蛋白質測序）。

（一）蛋白質測序的基本策略

對于一個純蛋白質，理想的方法是從N端直接測至C端，但目前一次只能連續測60個左右N端氨基酸。現在常用的蛋白質測序方法有兩種：用酶和特異性試劑直接作用于蛋白質而測定出氨基酸順序的直接法；通過測定蛋白質的基因的核苷酸順序，用遺傳密碼來推斷氨基酸的順序的間接法。用直接法測定蛋白質的一級結構，要求樣品必須是均一的（純度大于97%），而且是已知分子量的蛋白質。間接法的核苷酸的測序比蛋白質的測序工作更方便、更準確。

（二）蛋白質測序的直接法的一般步驟

① 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。根據末端分析可以確定蛋白質中不同的多肽鏈數目（因為不同的多肽鏈一般含有不同的末端殘基）。如果是單體蛋白質或同多聚蛋白質則只含一種多肽鏈；如果是雜多聚蛋白質則含有兩種或多種不同的多肽鏈。

② 拆分蛋白質分子中的多肽鏈。非共價力締合的寡聚（或多聚）蛋白質，可用變性劑如尿素、鹽酸胍或高濃度鹽處理，可使多肽亞基解離。如果多肽亞基是不同的，則各亞基要用多種方式進行分離純化。

③ 斷裂多肽鏈內的二硫鍵。如果多肽鏈間是通過二硫鍵交聯的，如胰島素（含α和β兩條鏈），則需要氧化劑或還原劑將二硫鍵斷裂，方可使多肽鏈分開。

④ 分析每一多肽鏈的氨基酸組成。經純化的多肽鏈樣品一部分進行完全水解，測其氨基酸組成，并計算出每個蛋白質分子（或亞基）中氨基酸殘基的數目。氨基酸組成的信息可以解釋其他步驟的結果。

⑤ 鑒定多肽鏈的N末端和C末端殘基。多肽鏈樣品的另一部分進行N末端殘基的鑒定，用作重建多肽鏈序列時的重要參考依據。

⑥ 多肽鏈部分裂解成肽段。用兩種或幾種不同的斷裂方法（指斷裂點不同）將多肽鏈樣品降解成兩套或幾套肽段（或稱肽碎片）。每套肽段進行分離、純化，并對每一純化了的肽段進行下一步的測序工作。

⑦ 測定各個肽段的氨基酸順序。目前最常用的肽段測序方法是Edman化學降解法，并有自動測序分析儀可供利用。

⑧ 片段重疊法重建完整肽鏈的一級結構。利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯重疊，可以拼湊出原來完整的多肽鏈的氨基酸序列。

⑨ 確定多肽鏈中二硫鍵的位置。

（三）蛋白質測序的一般方法

1.測序前的準備工作

在測定一個蛋白質的結構以前，首先必須保證被測蛋白質的純度，使結果準確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數，按照其亞基數將蛋白質分成幾個多肽鏈。蛋白質的純度鑒定要求純度在97%以上，均一。主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法等。

2. N末端分析

（1）2，4-二硝基氟苯（DNFB）法　其基本原理已在氨基酸的化學反應中作了介紹。在弱堿溶液中，肽鏈N端的氨基酸殘基可同2，4-二硝基氟苯（fluorodinitrobenzene，DNFB）起反應生成二硝基苯衍生物，后者為黃色物，可用乙醚抽提，用色譜法鑒定。其反應如圖1-25所示。

蛋白質多肽N端游離α-NH2與2，4-二硝基氟苯（DNFB）反應形成DNP-多肽，用6mol/L HCl水解斷裂所有肽鍵后，分離與二硝基苯基連接的N端氨基酸（黃色），通過色譜法與標準氨基酸比較鑒定。

（2）丹磺酰氯（DNS）法　原理同DNFB法，具強烈黃色熒光，靈敏度極高，且DNS-多肽水解后產生的DNS-氨基酸不需要提取，直接用紙電泳或薄層色譜鑒定。其反應過程如圖1-26所示。

（3）氨肽酶法　氨肽酶（amino peptidase）是一類肽鏈外切酶，從肽鏈的N端每次降解一個氨基酸殘基。原則上說，只要能跟隨酶水解進程，將釋放的氨基酸分別定量測出，就能測出肽的序列。但實際上由于酶的專一性等問題，在判斷氨基酸序列時常會遇到不少困難。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（leucine amino peptidase，LAP），除了N端的第二個氨基酸是Pro時，此酶不能將N端氨基酸水解下來外，其余所有N端的肽鍵都能被LAP水解，但水解速率相差很大。當N端為Leu時，水解速率最快。

（4）PITC法　瑞典科學家Edman首先用異硫氰酸苯酯（Edman試劑）來測定蛋白質的N端氨基酸，故此法又稱Edman降解法（圖1-27）。異硫氰酸苯酯在弱堿條件下可與多肽鏈的N端氨基酸的氨基作用，形成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質（簡稱PTC-多肽或蛋白質），再在酸性溶液中使N端的PTC-氨基酸環化成苯乙內酰硫脲氨基酸（簡稱PTH-氨基酸），并從多肽鏈上脫落下來，用乙酸乙酯抽提，對其進行鑒定。

Edman降解法的最大優點是在酸性溶液中，僅僅是靠近PTC基的肽鍵斷裂，其他肽鍵不斷。每次遞減一個氨基酸，如此重復多次就可以測定出一定數目的氨基酸序列。現代蛋白質序列儀的基本原理就是Edman降解法，逐個降解N端氨基酸。

3. C末端分析

（1）肼解法　是測定C末端殘基最重要的化學方法。無水肼（NH2NH2）與多肽加熱（100℃）發生肼解，C末端氨基酸以游離形式存在，其余的都轉變為相應的氨基酸酰肼化物。用苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C末端游離氨基酸留在上清液中。可借助DNS法或DNFB法以及色譜技術進行鑒定。

（2）羧肽酶法　是最有效、最常用的方法，但Pro不能測。羧肽酶與氨肽酶相似，都是肽鏈外切酶，不同點在于羧肽酶從肽鏈的C端每次降解一個氨基酸殘基，釋放出游離氨基酸。用氨基酸的釋放量對時間作圖，可確定C端氨基酸的序列。

常用羧肽酶有四種，見表1-6。

（3）還原法　C端氨基酸與硼氫化鋰還原成α-氨基醇，可用色譜法鑒別。 

4.二硫鍵的斷裂

蛋白質結構分析中胱氨酸殘基的二硫鍵常用氧化劑或還原劑打開。過甲酸可定量打開胱氨酸的二硫鍵，生成磺基丙氨酸（cyter acid）。還原劑如巰基化合物（R—SH）也能斷裂二硫鍵，生成半胱氨酸及相應的二硫化物。

5.肽鏈的斷裂

氨基酸順序自動分析儀只能準確測定50個氨基酸殘基以下的肽鏈，而一般的蛋白質都含有100以上的氨基酸殘基，所以，要將蛋白質打斷成多肽甚至寡肽，再進行分析，而且要2套以上，便于以后拼接。為此，經純化并斷開二硫鍵的多肽鏈選用專一性強的蛋白酶或化學試劑進行可控制的裂解。裂解時要求斷裂點少，專一性強，反應產率高。

（1）化學裂解法　獲得的肽段較大，適合自動序列儀。

① 溴化氰（CNBr）：水解—Met—X—之間的肽鍵，產率85%。

② 亞碘酰基苯甲酸：水解—Trp—X—之間的肽鍵，產率70%～100%。

③ NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）：水解—X—Cys—之間形成的肽鍵。

④ 羥胺（NH2OH）：水解—Asn—Gly—之間形成的肽鍵，專一性不強，也能裂解—Asn—Leu—和—Asn—Ala—之間的肽鍵。

（2）酶裂解法　用于肽鏈斷裂的蛋白水解酶（或稱蛋白酶）都是肽鏈內切酶或內肽酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等。幾種蛋白水解酶的專一性如表1-7所示。

6.肽段氨基酸序列的測定

自動序列分析技術應用了Edman試劑——異硫氰酸苯酯。與Sanger測序技術不同，Edman法使多肽水解掉N末端殘基后仍保留修飾肽鏈的完整性（即剩余的多肽不被水解），這一特征改變了蛋白質測序技術。在反應過程中，氨基端的氨基酸以苯乙內酰硫脲衍生物的形式釋放，然后通過HPLC進行鑒定。序列中的下一個氨基酸接著發生衍生化并釋放出來，這一過程不斷重復，30～40個（偶爾也可60～80個）氨酰基的序列可在一次連續的操作中得以完成（圖1-27）。

7.肽段拼接成肽鏈

通常采用重疊肽法確定各肽段在原多肽鏈中的正確順序，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸序列。重疊肽是指用兩種或兩種以上的不同方法（專一性不同）斷裂多肽樣品，得兩套或多套肽段。

例如：16肽，N末端—H，C末端—S

A法裂解產生的肽段　QNS，PS，EQVE，RLA，HQWT

B法裂解產生的肽段　SEQ，WTQN，VERL，APS，HQ

重疊肽法確定序列　HQWTQNSEQVERLAPS

8.二硫鍵位置的確定

二硫鍵位置的確定包括鏈內和鏈間二硫鍵的位置，用對角線電泳法來測定。在肽鏈未拆分的情況下用胃蛋白酶水解，可以得到被二硫鍵連著的多肽產物。先進行第一向電泳，將產物分開，再用過甲酸、碘代乙酸、巰基乙醇處理，將二硫鍵打斷，最后進行第二向電泳，條件與第一向電泳完全相同。選取偏離對角線的樣品（多肽或寡肽），它們就是含二硫鍵的片段，上機測氨基酸順序，根據已測出的蛋白質的氨基酸順序，把這些片段進行定位，就能找到二硫鍵的位置。

四、蛋白質的二級結構

多肽鏈在一級結構的基礎上，主鏈原子按照一定的方式通過氫鍵有規律地旋轉或折疊形成的空間構象就是蛋白質的二級結構。其實質是多肽鏈在空間的排列方式。主要包括α螺旋、β折疊、β轉角、無規卷曲等。

1.構型與構象

構型（configuration）指一個分子由于其中各原子特有的固定的空間排列，而使該分子所具有的特定的立體化學形式。構型的改變只能通過共價鍵的破壞和再形成而實現（例如D-丙氨酸轉變為L-丙氨酸）。

構象（conformation），是指一個分子中，不改變共價鍵結構，僅單鍵周圍的原子旋轉所產生的原子空間排布。構象之間的相互轉化不涉及共價鍵的破壞，而是通過非共價鍵（氫鍵、鹽鍵、疏水鍵等）的破壞與再形成而實現。即使消除了由空間相互作用所產生的構象，一個多肽鏈主鏈中2/3的共價鍵仍可自由旋轉而形成無數個可能的構象，然而對于一個蛋白質來說，只有一小部分構象具有生物學意義。

2.多肽主鏈的折疊的空間限制

一個Cα原子相連的兩個肽平面，由于N1—Cα和Cα—C2（羧基碳）兩個鍵為單鍵，肽平面可以分別圍繞這兩個鍵旋轉，從而構成不同的構象。一個肽平面圍繞N1—Cα（氮原子與α-碳原子）旋轉的角度，用Φ表示。另一個肽平面圍繞Cα—C2（α-碳原子與羧基碳）旋轉的角度，用Ψ表示。這兩個旋轉角度叫二面角。二面角（Φ、Ψ）所決定的構象能否存在，主要取決于兩個相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙。Cα—N和Cα—C鍵旋轉時將受到α-碳原子上的側鏈R基的空間阻礙影響，所以使肽鏈的構象受到限制，只能形成一定的構象。構象Φ、Ψ示意圖見圖1-28。

Ramachandran根據蛋白質中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定了哪些成對二面角（Φ、Ψ）所規定的兩個相鄰肽單位的構象是允許的，哪些是不允許的，并且以Φ為橫坐標、以Ψ為縱坐標，在坐標圖上標出，該坐標圖稱拉氏構象圖。

3.二級結構中的規則和不規則構象

蛋白質多肽骨架的構象構成了它們的二級結構，可以通過X衍射分析方法來確定。肽鍵的部分雙鍵性質和R基團的大小及形狀決定其存在的二級結構種類。

（1）α螺旋結構　如果多肽鏈以α-碳原子為核心做角度相同的旋轉，即可以形成線卷或螺旋結構。螺旋旋轉的強度和方向不同，所形成的螺旋類型也不相同。螺旋沿著它的中心軸上升，每一圈的氨基酸殘基數（n）或每圈的距離（p，螺距）決定了螺旋的類型。肽鏈中的肽平面繞Cα相繼旋轉一定角度形成α螺旋，并盤繞前進。每隔3.6個氨基酸殘基，螺旋上升一圈，每圈間距0.54nm，即每個氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升0.15nm，旋轉100°（見圖1-29）。α螺旋中氨基酸殘基側鏈伸向外側，相鄰的螺圈之間形成鏈內氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。第1個肽鍵的上的氧和第4個肽鍵的上的氫之間形成氫鍵，第n個肽鍵的上的氧和第n+3個肽鍵的上的氫之間形成氫鍵。由氫鍵封閉形成的環是十三元環：

氨基酸具有手性特征，因此形成的螺旋亦有手性，即右手螺旋和左手螺旋之分。握住手掌，拇指向外，就構成右手螺旋。對一個右手螺旋的多肽鏈來講，如果拇指指向肽鏈的羧基端，螺旋沿著手指卷曲的方向前進。絕大多數天然蛋白質都是右手螺旋（見圖1-30）。

由于α螺旋是多肽鏈中能量最低、最穩定的構象，由此可以自發地形成。但一條肽鏈能否形成α螺旋，以及形成的螺旋是否穩定，與它的空間位阻和靜電斥力有極大的關系。多個　　　　　　

側鏈較大的氨基酸（Ile、Trp、Phe等），由于極大的側鏈基團而存在空間位阻而不能形成穩定的α螺旋；連續存在的側鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基因同種電荷的互斥效應而不能形成穩定的α螺旋。例如多聚Lys，當pH=7時R基都帶正電荷，妨礙α螺旋的形成，而以無規則卷曲形式存在；當pH=12時則自發形成α螺旋。α螺旋遇到Pro會被中斷而拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸，其肽鍵N原子上沒有H，不能形成氫鍵；且Cα原子參與吡咯環的形成，環內Cα—N和Cα—C鍵不能旋轉。R為Gly時，由于C上有2個H，使Cα—C、Cα—N轉動的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩定性大大降低。

（2）β片層結構　也稱β折疊結構，β片層（β-pleated sheet）是由兩條或多條完全伸展的多肽鏈靠氫鍵連接而成的鋸齒狀片層結構。每條肽鏈稱β折疊股或β股。形成α螺旋中的氨基酸在一級結構中均為鄰近氨基酸，β片層則不同，其氨基酰殘基可以來自于多肽鏈中不同一級結構區域的5～10個氨基酸構成的區段。與α螺旋的致密性結構相比，β片層構象幾乎完全是伸展的。側鏈基團與Cα間的鍵幾乎垂直于折疊平面，R基團交替分布于片層平面兩側。β片層結構具有平行結構和反平行結構兩種形式。

圖1-31展示了反平行走向的β片層結構，相鄰的兩多肽鏈具有相反的方向；而平行的β片層結構中，兩多肽鏈的走向是相同的。每一種β片層結構都具有特有的氫鍵類型（圖1-32），并盡可能在所有可以形成氫鍵的原子之間形成氫鍵。在反平行的β片層構象中，寬窄相間的氫鍵位于兩多肽鏈之間，對構象起到穩定作用。而在平行β片層中，氫鍵則是均勻存在且與肽鏈形成一定傾斜角度。幾乎所有的β片層鏈都是右手卷曲的，卷曲的β片層可以形成球狀蛋白質的核心。一個β片層結構可以由2～15條多肽段構成，平行和反平行β片層常混合存在。

（3）β轉角結構　β轉角也稱β回折、β彎曲或發夾結構，多存在于球狀蛋白質分子的表面，是多肽鏈180°回折部分所形成的一種二級結構。由第一個氨基酸殘基的上的氧與第4個氨基酸殘基的N—H上的氫之間形成氫鍵，形成一個緊密的環，使β轉角成為穩定結構。主要有兩種類型：Ⅰ型和Ⅱ型（圖1-33），二者主要差別是中央肽基旋轉了180°。

一些氨基酸如Pro、Gly經常出現在β轉角中，而Ⅱ型β轉角中的第3個氨基酸殘基總是Gly。這是因為甘氨酸的側鏈只有一個氫原子，在構象上幾乎沒有空間障礙，可以緩和由于肽鏈彎曲造成的殘基側鏈間的作用。脯氨酸則相反，其亞氨基與側鏈形成環狀結構，比較嚴格地限制了構象角的自由度，在一定條件下能導致β轉角的形成。在球狀蛋白質中，β轉角是非常多的，可以占總殘基數的1/4。大多數β轉角位于蛋白質分子表面，多數由親水氨基酸殘基組成。

（4）無規則卷曲　無規則卷曲泛指那些不能被歸入明確的二級結構元件的多肽區域。常出現在α螺旋與α螺旋、α螺旋與β折疊、β折疊與β折疊之間。它是形成蛋白質三級結構所必需的。酶的功能部位常常處于這種構象區域。

α螺旋、β轉角、β折疊在拉氏構象圖上有固定位置，而無規卷曲的Φ、Ψ二面角可存在于所有允許區域內。

五、超二級結構和結構域

在蛋白質中經常看到若干相鄰的二級結構單元（主要是α螺旋和β折疊）組合在一起，彼此相互作用，形成有規則的、在空間上能辨認的二級結構組合體，稱為超二級結構。它們是蛋白質二級結構至三級結構層次的一種過渡態構象層次，可直接作為三級結構的“建筑塊”或域結構的組成單位，是蛋白質發揮特定功能的基礎。現在已知的超二級結構有以下幾種基本組合形式（圖1-34）。

（1）αα　這是由兩股或三股右手α螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋。主要存在于α角蛋白、肌球蛋白等蛋白質分子內。α螺旋沿超螺旋軸有相當的傾斜，重復距離從0.54nm縮短到0.51nm。超螺旋的螺距約為14nm，直徑為2nm。兩股α螺旋的側鏈能緊密相互作用，使超螺旋結構更加穩定。

（2）βxβ　是由兩段平行的β折疊通過一段連接鏈（x結構）連接而成的超二級結構，主要有如下兩種形式。

① βcβ　x為無規卷曲。

② βαβ　x為α螺旋，β片層的疏水側鏈面向α螺旋的疏水面，彼此緊密結合裝配。最常見的是βαβαβ，相當于兩個βαβ單元組合在一起，稱Rossmann折疊，存在于蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶的蛋白質中。

（3）β曲折　由多個相鄰的反平行β片層股通過緊湊的β轉角連接而成的超二級結構。

（4）回形拓撲結構（希臘鑰匙）　回形拓撲結構（“Greek key”topology）也是反平行β折疊片中常出現的一種超二級結構。這種結構直接用希臘陶瓷花瓶上的一種常見圖案命名，稱“Greek key”拓撲結構。這種拓撲結構有兩種可能的回旋方向，但實際上只存在其中的一種。這種選擇的基礎尚未確定。

長肽鏈（多于150個氨基酸）在超二級結構的基礎上通過多次折疊，在空間上形成一些半獨立的球狀結構，叫結構域，它是三級結構的一部分，結構域之間靠無規則卷曲連接。也就是說結構域是將三級結構拆開后首先看到的結構。結構域具有獨特的空間構象，與分子整體以共價鍵相連，并承擔特定的生物學功能。如一些要分泌到細胞外的蛋白質，其信號肽（負責使蛋白質通過細胞膜）就構成一個結構域。此外，還有與殘基修飾有關的結構域、與酶原激活有關的結構域等。鉸鏈區柔性較強，使結構域之間容易發生相對運動，所以酶的活性中心常位于結構域之間。小蛋白多由一個結構域構成，如核糖核酸酶、肌紅蛋白等。由多個結構域構成的蛋白質一般分子量大，結構復雜，例如免疫球蛋白的重鏈含有4個結構域。

六、三級結構

蛋白質的三級結構是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布位置，包括主鏈和側鏈。三級結構的形成使得在序列中相隔較遠的氨基酸側鏈相互靠近。一條長的多肽鏈，可先折疊成幾個相對獨立的結構域，再締合成三級結構，這在動力學上比直接折疊更為合理。三級結構是蛋白質發揮生物活性所必需的。

（一）維持三級結構的次級鍵

三級結構涉及蛋白質分子或亞基內所有原子的空間排布，但不涉及亞基之間的關系。三級結構主要靠非共價鍵如氫鍵、離子鍵、疏水鍵和范德華力等來維持。

1.氫鍵

氫鍵是次級鍵中發現最早的一種鍵，在維持蛋白質的構象中起重要作用。例如α螺旋的形成、β片層中鏈與鏈之間的結合等。氫鍵是一個電負性很強的原子（O或N）共價相連的氫原子和相鄰的另一個含有孤對電子的電負性強的原子（如O、N或F）之間形成的一種吸引力。氫鍵的鍵能為12～30kJ/mol，比共價鍵弱得多，但由于蛋白質分子中存在許多氫鍵，所以在維持蛋白質三級結構的穩定性中仍起重要作用。

氫鍵有兩個特征，一個是飽和性，即一個氫供體只能與一個氫受體形成一個氫鍵；另一個即方向性，即氫鍵的供體和受體都在同一直線上形成的氫鍵最強，如兩者之間有一角度，氫鍵就隨角度的增大而減弱。

2.離子鍵

離子鍵是由帶相反電荷的基團通過靜電引力形成的，其鍵能為20kJ/mol，在蛋白質中常被稱為鹽鍵或鹽橋。在生理pH下，構成多肽鏈的堿性氨基酸殘基側鏈帶正電，酸性氨基酸殘基側鏈帶負電；另外，游離的N端氨基酸殘基的氨基和C端氨基酸殘基的羧基也分別帶正、負電荷，這些帶相反電荷的基團之間可以形成離子鍵。

3.疏水鍵

構成蛋白質的非極性氨基酸殘基上的各種非極性R基團避開水相，互相聚集在一起而形成的作用力稱為疏水作用力，也稱疏水鍵，其鍵能＜40kJ/mol。在水溶液中它們會躲避周圍的極性溶液而自發地聚集在一起，從而在分子內部形成疏水核心。這種疏水相互作用在維持蛋白質的三級結構中起到十分重要的作用。如果一個多肽的所有氨基酸殘基都是親水的，那么用來驅動三級結構形成的力將十分有限；而如果一個多肽既含親水氨基酸又含疏水氨基酸，則有利于蛋白質在溶液中采取最終的構象狀態。

4.范德華力

這是一種普遍存在的作用力，是一個原子的原子核吸引另一個原子外圍電子所產生的作用力。它是一種比較弱的、非特異性的作用力。盡管范德華力十分弱，鍵能只有0.4～4kJ/mol，但在蛋白質分子中，這樣的力大量存在，因此其對蛋白質三級結構的形成作用不容小覷。

5.金屬離子的配位結合

金屬離子的配位結合只存在于金屬蛋白。以羧肽酶A為例，這種由307個氨基酸組成的多肽鏈大致折疊成球形，這與被結合的Zn2+和其His69、Glu72、His196的側鏈以及1個水分子配位結合形成四面體結構有一定關系。

總的來說，維持蛋白質分子三級結構的作用力是次級鍵，它們的鍵能雖然弱，但是多個次級鍵加在一起時，就產生了一種足以維持蛋白質三維結構的強大作用力。另外，絕大多數蛋白質中二硫鍵對蛋白質的穩定和三級結構的形成也起到相當重要的作用。1963年英國J.Kendrew等測出了第一個蛋白質——抹香鯨肌紅蛋白的全部原子的空間結構。抹香鯨肌紅蛋白是由一條α螺旋鏈折疊、盤繞成一個近似球狀的三級結構，分子大小約4.5nm×3.5nm×2.5nm，還有一個血紅素輔基（圖1-35）。

通過對多種球狀蛋白質的三維結構研究后發現，雖然每種球狀蛋白質都有自己獨特的三級結構，但是它們仍有如下共同特征。

（1）含有豐富的二級結構元　纖維蛋白質只含有一種類型的二級結構，而球狀蛋白質通常含有幾種二級結構。如雞卵清溶菌酶（圖1-36）含有α螺旋、β片層、β轉角和無規則卷曲等。當然，不同的球狀蛋白質各種元件的含量是不一樣的。

（2）具有明顯的折疊層次　球狀蛋白質具有豐富的結構層次，包括二級結構、超二級結構、結構域、三級結構和四級結構。

（3）分子呈現球狀或橢圓狀　多肽鏈折疊中各種二級結構彼此緊密裝配，偶爾有水分子大小或稍大的空腔存在，但它僅占構成蛋白質總體積的很小一部分，例如在α-胰凝乳蛋白酶晶體結構中發現只有16個水分子的空隙。值得注意的是鄰近活性部位的區域有較大的空間可塑性，允許活性部位的結合基團和催化基團有較大的活動范圍。這是酶與底物或調節物相互作用的結構基礎。

（4）疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在外表　蛋白質三級折疊的驅動力是引起疏水相互作用的熵效應，折疊的結果是形成熱力學上最穩定的三維結構。球狀蛋白質分子約80%～90%疏水側鏈被埋藏，分子表面主要是親水側鏈，因此，球狀蛋白質是水溶性的。

（5）分子表面常常有空穴　這個空穴為配體結合部位（活性中心）。空穴大小能容納1～2個小分子配體或大分子配體的一部分。空穴的周圍分布著許多疏水側鏈，為底物等發生化學反應營造了一個疏水環境（低介電區域）。

（二）研究三級結構的方法

測定蛋白質三級結構的方法主要有兩種，一種是X射線晶體衍射，另一種是核磁共振影像。兩種方法各有利弊。前一種方法首先需要得到蛋白質的晶體，但得到一種蛋白質的晶體并非易事，特別是膜蛋白，某些蛋白質的晶體可能永遠無法得到。只有在得到蛋白質晶體以后，才可以進行X射線晶體衍射，但得到的并不是原子的直接圖譜，而是電子密度圖譜，因此需要傅里葉逆轉化去分析電子密度，再還原成三維結構。但典型的蛋白質晶體相對較軟，常發生移位，因此它們的電子密度圖難以揭示個別原子的準確位置。而且，有些蛋白質只能穩定地存在于溶液中，無法結晶，所以不能應用此方法。核磁共振技術（NMR）則提供了蛋白質在溶液中的結構信息。一些在生物學上十分重要的原子核，例如1H、13C、15N和31P都有特征性的磁矩或自旋。核磁共振儀可以用于分析這些原子核的化學環境并提供有關分子中的原子之間距離的信息。在分析蛋白質的結構時，將此信息與氨基酸的序列、鍵角、各種基團的平面特征、范德華力等相結合可以解出蛋白質的三維結構。核磁共振技術測蛋白質三維結構可以達到相當于0.25nm X射線晶體結構分析的分辨率。

自從1985年第一個蛋白質的三維結構由NMR法確定以來，已有幾百種蛋白質的空間結構通過這種方法得到，約占已被確定空間結構的蛋白質總數的20%。其中有些蛋白質分別被NMR和X射線晶體衍射兩種方法測定過。比較它們的溶液結構和晶體結構可以看出二者總體上是相同的，但局部的表面區域由于它們所處的環境不一樣而呈現明顯的差異，這是因為兩種狀態下蛋白質分子所處的環境不同而造成的。

七、四級結構

蛋白質的四級結構是指兩個或兩個以上的具有完整三級結構的多肽鏈依靠次級鍵相連，形成特定的空間結構。可以根據蛋白質有無四級結構對其進行分類：僅由一個亞基組成并無四級結構的蛋白質稱為單體蛋白質，如核糖核酸酶、胰島素等；由兩個或兩個以上亞基組成的蛋白質統稱為寡（多）聚蛋白質。寡聚蛋白質只由一種亞基組成，稱為同多聚蛋白質，如谷氨酰胺合成酶；由幾種不同的亞基組成，稱為雜多聚蛋白質，如血紅蛋白。

蛋白質的四級結構內容包括亞基的種類、數目、空間排布以及亞基之間的相互作用。亞基的表面是不規則的，這使得亞基之間能夠結合，成為四級結構形成的基礎。亞基之間是否結合不僅與其形狀有關，而且與將亞基聯系在一起的次級鍵有關，包括氫鍵供體對氫鍵受體、疏水基團對疏水基團、正電荷基團對負電荷基團。這些互補的性質在所有的結合作用中都可以觀察到，無論是蛋白質和小分子之間，還是蛋白質和其他大分子之間。

蛋白質四級結構中亞基締合在結構和功能上具有優越性，主要體現在以下幾點。

① 降低比表面積，增加蛋白質的穩定性。

② 提高基因編碼的效率和經濟性。

③ 使酶的催化基團匯集，提高催化效率。

④ 豐富蛋白質的結構，以行使更復雜的功能。

⑤ 形成一定的幾何形狀，如細菌鞭毛。

⑥ 適當降低溶液滲透壓。

⑦ 具有協同效應和別構效應，實現對酶活性的調節。

別構效應指別構蛋白的別構部位與效應物結合改變蛋白質的構象，從而對活性部位所產生的影響。酶的別構效應包括涉及酶與底物結合時催化部位與催化部位之間的相互作用，即同促別構效應（homoteric allosteric effect）；涉及酶與調節物結合時調節部位與活性部位之間的相互作用，即異促別構效應（heterotropic allosteric effect）。

八、蛋白質的結構與功能

蛋白質的性質和生物功能是以其化學組成和結構為基礎的。各種蛋白質雖然都是由20種基本氨基酸所組成，但它們分子中的氨基酸種類、排列次序、肽鏈的多少和大小以及空間結構等各不相同。因此，一種蛋白質的生物功能的表現，不僅需要一定的化學結構，而且需要一定的三維結構。

蛋白質的一級結構與其三維結構具有密切聯系。一般來說，具有相似的一級結構通常具有相似的三維結構，但有時非常不同的一級結構（同源相似序列小于20%）能形成相似的三維結構。蛋白質的功能取決于它的三維結構，而三維結構是由其一級結構決定的，蛋白質結構的改變會導致某些疾病的發生。

1.分子病

由于DNA分子核苷酸發生錯差，導致蛋白質分子合成異常引起的疾病稱為分子病。蛋白質中氨基酸的改變是由于基因突變的結果，所以，分子病是一類基因突變引起的遺傳病。鐮刀狀細胞貧血病是人類認識的第一個分子病。它是一種慢性溶血性貧血，病人的紅細胞在氧氣不足的情況下變形而呈鐮刀狀，故由此得名。正常人的紅細胞是球狀的，而病人血液中相當一部分紅細胞是鐮刀狀（圖1-37）。進一步分析鐮刀狀細胞貧血病病人的紅細胞成分，發現其與正常人不同，這種病人紅細胞的數量只有正常人一半，血紅蛋白的含量也是正常人的一半，對白細胞數量的影響相對小一些。

正常人的血紅蛋白（以HbA代表）同鐮刀狀細胞貧血病病人的血紅蛋白（以HbS代表）的生物功能大小懸殊，但在結構上，它們之間的差異僅僅是β鏈上的一個氨基酸殘基，即HbA的β鏈的第6位為谷氨酸，而HbS的β鏈的第6位為纈氨酸。

HbA　β鏈　Val—His—Leu—Thr—Pro—Glu—Glu—Lys…

HbS　β鏈　Val—His—Leu—Thr—Pro—Val—Glu—Lys…

2.蛋白質構象與疾病

若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生。有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。

阮病毒是一種不含有核酸的感染性蛋白質，它們可以引起許多致命的神經退行性疾病。例如流行性海綿狀腦病（transmissible spongiform encehapathies，TSE）或叫阮病毒病。阮病毒病可以是遺傳性的、感染性的或散在性的疾病。它們主要涉及作為阮病毒的蛋白質的二級結構和三級結構的改變。這一類疾病包括人的早老癡呆病（CJD）、羊的羊瘙癢癥、牛的牛海綿狀腦病（瘋牛病，BSE）。這些疾病的特征改變是由淀粉樣原纖維中不溶性蛋白質的沉積引起的海綿狀、星型膠質細胞增生和神經元喪失。