十一、分光光度計(jì)的使用

分光光度計(jì)的基本原理：物質(zhì)在光的照射下，對(duì)光產(chǎn)生了吸收，物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜。因此，某種單色光通過(guò)溶液時(shí)，其能量就會(huì)因被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，如圖1-33所示，它們之間的定量依據(jù)是朗伯-比爾定律。物質(zhì)吸收光的程度可以用吸光度A或透光率T表示。定義：

式中　I0——入射光強(qiáng)度；

　I——透射光強(qiáng)度。

朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A=εbc

式中　A——吸光度；

　c——溶液的濃度，mol·L-1；

　b——液層厚度，cm；

　ε——摩爾吸光系數(shù)，L·mol-1 cm-1。

從以上公式可以看出，當(dāng)入射光、吸光系數(shù)和液層厚度不變時(shí)，吸光度隨溶液濃度的變化而變化。

分光光度計(jì)的基本原理是根據(jù)朗伯-比爾定律設(shè)計(jì)的。下面簡(jiǎn)單介紹兩種常用的分光光度計(jì)的使用方法。

（一）22pc型可見(jiàn)分光光度計(jì)

1.儀器外形結(jié)構(gòu)

22pc型可見(jiàn)分光光度計(jì)外形結(jié)構(gòu)如圖1-34所示。

2.22pc可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用方法

①預(yù)熱儀器　打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)16，顯示窗9顯示數(shù)字，預(yù)熱30min。

②零點(diǎn)調(diào)整　打開(kāi)暗箱蓋或用不透光材料在樣品室中遮斷光路，然后按“↓/0％”鍵7，即能自動(dòng)調(diào)整零位。

③選擇波長(zhǎng)　使用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕4，選擇當(dāng)前測(cè)試所需波長(zhǎng)，具體波長(zhǎng)由波長(zhǎng)顯示窗3顯示，讀出波長(zhǎng)時(shí)目光要垂直觀察。

④調(diào)節(jié)百分透光度　將空白液置于光路中，關(guān)閉暗箱蓋（同時(shí)打開(kāi)光門(mén)），按下“↑/100％”鍵8，即能自動(dòng)調(diào)整T=100％（一次有誤差可加按一次）。

⑤確定濾光片位置　本儀器備有減少雜光、提高340～380nm波段光度準(zhǔn)確性的濾波片，位于樣品室內(nèi)側(cè)，用一撥桿來(lái)改變位置。當(dāng)測(cè)試波長(zhǎng)在340～380nm波段內(nèi)如作高精度測(cè)試，可將撥桿推向前，通常可不使用此濾光片，可將撥桿置于400～1000nm位置。

⑥改變標(biāo)尺　本儀器有四種標(biāo)尺，各標(biāo)尺間的轉(zhuǎn)換用模式鍵5操作，由“透射比”，“吸光度”，“濃度因子”，“濃度直讀”指示燈分別指示，開(kāi)機(jī)初始狀態(tài)為“透射比”，每按一次順序循環(huán)。

⑦溶液測(cè)定　將待測(cè)液盛于比色皿并置于比色池中，關(guān)閉暗箱蓋，輕輕拉動(dòng)比色皿座架拉桿，使待測(cè)液進(jìn)入光路，進(jìn)行測(cè)定。測(cè)完后應(yīng)打開(kāi)暗箱蓋，以免光電管疲勞。

試驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿洗滌干凈并用軟紙將比色皿與座架、暗箱擦凈。

（二）752s型紫外分光光度計(jì)

1.儀器外形結(jié)構(gòu)

752s型紫外分光光度計(jì)儀器外形結(jié)構(gòu)如圖1-35所示。

2.752s型紫外分光光度計(jì)的使用方法

①預(yù)熱儀器　打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)16，顯示窗9顯示數(shù)字，預(yù)熱30min。

②零點(diǎn)調(diào)整　打開(kāi)暗箱蓋或用不透光材料在樣品室中遮斷光路，然后按“↓/0％”鍵7，即能自動(dòng)調(diào)整零位。

③選擇波長(zhǎng)　使用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕4，選擇當(dāng)前測(cè)試所需波長(zhǎng)，具體波長(zhǎng)由波長(zhǎng)顯示窗3顯示，讀出波長(zhǎng)時(shí)目光要垂直觀察。

④調(diào)節(jié)百分透光度　將空白液置于光路中，關(guān)閉暗箱蓋（同時(shí)打開(kāi)光門(mén)），按下“↑/100％”鍵8，即能自動(dòng)調(diào)整T=100％（一次有誤差可加按一次）。

⑤改變標(biāo)尺　本儀器有四種標(biāo)尺，各標(biāo)尺間的轉(zhuǎn)換用模式鍵5操作，由“透射比”，“吸光度”，“濃度因子”，“濃度直讀”指示燈分別指示，開(kāi)機(jī)初始狀態(tài)為“透射比”，每按一次順序循環(huán)。

⑥溶液測(cè)定　將待測(cè)液盛于比色皿并置于比色池中，關(guān)閉暗箱蓋，輕輕拉動(dòng)比色皿座架拉桿，使待測(cè)液進(jìn)入光路，進(jìn)行測(cè)定。測(cè)完后應(yīng)打開(kāi)暗箱蓋，以免光電管疲勞。

試驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿洗滌干凈并用軟紙將比色皿與座架、暗箱擦凈。

（三）分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

①工作環(huán)境　室溫：5～35℃，室內(nèi)相對(duì)濕度小于85％。安放在穩(wěn)定的工作臺(tái)上，避免震動(dòng)，并避免陽(yáng)光直射及強(qiáng)烈電磁場(chǎng)干擾，避免灰塵及腐蝕性氣體。

②清潔儀器外表時(shí)，宜用溫水擦拭，切勿用乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，不使用時(shí)請(qǐng)加防塵罩。

③比色皿每次使用后都用石油醚清洗，并用鏡頭紙輕拭干凈，存于比色皿盒中備用。不能用堿液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷，以免損壞透光面。

④為了防止光電管疲勞，不測(cè)定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開(kāi)，切斷光路，以延長(zhǎng)光電管的使用壽命。

⑤手拿比色皿時(shí)，手指捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污及磨損。

⑥測(cè)定時(shí)，一定要用待測(cè)液將比色皿內(nèi)壁洗2～3次，以保證溶液的濃度不變，在測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常是按從稀到濃的順序測(cè)定，以減少誤差。