5.10　紅茂草生物堿正交提取工藝模式的建立

5.10.1　材料與方法

（1）材料

①樣品

紅茂草采自小隴山林區，由王廷璞研究員鑒定，經自然風干、粉碎，過篩。

②儀器及試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀（Agilent公司）、RE52-99型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、UV-751GD型紫外-可見光分光光度計（上海分析儀器廠）、KQ-500D型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、AB104-S型電子分析天平（瑞士梅特勤公司）、索氏提取器等。

異紫堇堿標準品（購自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批號166401，規格10mg）、乙腈（上海陸忠工貿有限公司、色譜純）、磷酸二氫鈉、95%乙醇、雙氧水，其余試劑均為國產或進口分析純。

（2）方法

①紅茂草生物堿提取工藝

稱取紅茂草粉末10.0g，選取乙醇體積分數、液料比、浸泡時間、回流作用時間、超聲波作用功率、超聲波作用溫度、超聲波作用時間、浸提液pH值、浸提次數、浸提液作用溫度等10個單因素水平進行測定。首先固定液料14mL/g、浸泡時間18h、回流作用時間2.5h、超聲波作用功率300W、超聲波作用溫度45℃、超聲波作用時間25min、浸提液pH=5、浸提次數1次，減壓濃縮時浸提液作用溫度40℃，考察乙醇體積分數為60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%時對提取效果的影響。然后將優選的最佳乙醇體積分數做為固定數值，依次選取考察液料比為12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1，浸泡時間為0、6h、12h、18h、24h、30h，回流作用時間為1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，超聲波作用功率為200W、250W、300W、350W、400W，超聲波作用溫度25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，超聲波作用時間為15min、20min、25min、30min、35min，浸提液pH值為2、3、4、5、6、7、8，浸提次數為1～4次，減壓濃縮時浸提液作用溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃時對提取效果的影響。將每次優選后的最佳條件固定，再逐次篩選其余最佳條件，直至結束。

②生物堿溶液的制備

在裝有提取物的錐形瓶中加入少許活性炭脫色，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號裝入容量瓶，并定容至50mL，靜置。

③樣品含量的測定

a.異紫堇堿標準曲線的繪制　準確配制0.5mg/mL異紫堇堿標準品溶液100mL，依次量取1～11mL，分別置于100mL容量瓶中，加無離子水稀釋至100mL，搖勻，使之為5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL的梯度溶液，以三重蒸餾水為空白，查閱文獻，選取OD210值進行測定。以濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

b.樣品含量的測定　將25個50mL容量瓶中的提取液稀釋后測定其吸光度，對照標準曲線，得出提取液中生物堿的濃度，最后計算出紅茂草樣品中生物堿提取率。

×100%

④HPLC測定紅茂草提取液中生物堿含量

a.色譜條件　Zorbax eclipse XDB C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相V乙腈∶V0.03mol/L磷酸二氫鈉=26∶74；流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫（30±1）℃；進樣量20μL。

b.HPLC測定時使用的標準溶液配制　準確配制0.1mg/mL的異紫堇堿標準溶液，將其稀釋成0.002mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.015mg/mL、0.020mg/mL、0.025mg/mL等不同濃度的溶液，進行HPLC檢測。

5.10.2　結果與分析

（1）異紫堇堿標準曲線的繪制

根據異紫堇堿標準品系列濃度梯度在OD210的吸光度，得回歸方程：Y=0.0110X+0.0652，R2=0.9998（n=11），其標準曲線如圖5-46所示，在5～55μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

（2）紅茂草生物堿單因素提取實驗

①乙醇體積分數對提取效果的影響

隨著浸提液乙醇體積分數的變化，在65%時生物堿含量最大；隨著乙醇體積分數的增大，生物堿含量依次呈明顯下降趨勢，此時乙醇體積分數對提取效果的影響變得不顯著；故選取適宜生物堿提取的乙醇體積分數為65%（圖5-47）。

②液料比對提取效果的影響

隨著液料比的增加，生物堿的含量也隨之增大；當液料比為15∶1時生物堿含量達到最大值；故選取適宜生物堿提取的液料比為15∶1（圖5-48）。

隨著液料比的增加，生物堿的含量也隨之增大；當液料比為15∶1時生物堿含量達到最大值；故選取適宜生物堿提取的液料比為15∶1。

③浸泡時間對提取效果的影響

使用65%乙醇浸泡時間在6～10h時，生物堿含量達到最大峰值；當浸泡時間超過12h后，隨著浸泡時間的延長，生物堿含量迅速降低。故選取適宜生物堿提取的浸泡時間為8h（圖5-49）。

④回流作用時間對提取效果的影響

使用索氏提取器回流作用時間為2.5h時，生物堿含量呈明顯單一峰值，故選取適宜生物堿提取的回流作用時間為2.5h（圖5-50）。

⑤超聲波作用功率對提取效果的影響

當超聲波作用功率為300W時，生物堿含量呈明顯單一峰值，故選取適宜生物堿提取的超聲波作用功率為300W（圖5-51）。

⑥超聲波作用溫度對提取效果的影響

超聲波作用溫度在25～55℃時，生物堿含量隨溫度的升高而增加，并達到最大峰值；當溫度超過55℃后，生物堿含量隨溫度升高而減小。故選取適宜生物堿提取的超聲波作用溫度為55℃（圖5-52）。

⑦超聲波作用時間對提取效果的影響

超聲波作用時間在15～30min時，生物堿含量隨時間的增加而增大，并達到最大峰值；當時間超過30min后，生物堿含量隨時間增加而減小。故選取適宜生物堿提取的超聲波作用時間為30min（圖5-53）。

⑧浸提液pH值對提取效果的影響

當65%乙醇浸提液pH值在2～6時，生物堿含量隨pH值的增加而增大，并達到最大峰值；當pH值超過6以后，生物堿含量隨pH值增加而減小。故選取適宜生物堿提取的浸提液pH=6（圖5-54）。

⑨浸提次數對提取效果的影響

浸提次數為1次時，生物堿含量最大，然后呈明顯下降趨勢；隨著浸提次數的增加，生物堿含量基本趨近于零。表明生物堿浸提次數為1次時效果最佳（圖5-55）。

⑩減壓濃縮時浸提液作用溫度對提取效果的影響

當減壓濃縮時浸提液作用溫度為20～50℃時，生物堿含量隨溫度的升高而增加，并達到最大峰值，當溫度超過50℃后，生物堿含量隨溫度升高呈明顯減小趨勢，故選取適宜生物堿提取的減壓濃縮時浸提液作用溫度為50℃（圖5-56）。

（3）紅茂草生物堿正交提取實驗

根據單因素實驗結果，進行極差分析，最終優選出乙醇體積分數、超聲波作用時間、液料比、回流時間、浸提液pH值和浸泡時間，做為影響紅茂草中生物堿提取效果的主要考察因素。按照L25（56）正交表進行正交實驗，用標準曲線計算出提取液中生物堿含量，用SPSS 17.0軟件對其結果進行統計學比較分析，得出最佳正交提取工藝模式，其正交實驗結果如表5-41～表5-43所示。

①差異顯著（P<0.05）。

對該正交實驗結果直觀分析表明，影響紅茂草中生物堿含量的主次因素和水平分別為C>E>D>A>B>F，優選出的最佳提取工藝為A4B1C3D3E5F1，即乙醇體積分數65%、超聲波作用時間20min、液料比15∶1、回流時間2.5h、浸提液pH=8、浸泡時間4h。采用SPSS 17.0統計軟件所獲數據顯著性分析表明，正交實驗因素對紅茂草生物堿含量的影響，僅C因素（P<0.05）達顯著水平，其余F值均小于1，說明這些因素對提取率有影響，但其實驗水平的設定仍有調節的空間。

（4）紅茂草提取液中生物堿含量測定

HPLC檢測波長選定在210nm，采用優化后的正交提取工藝模式，提取紅茂草中生物堿，將提取液減壓濃縮至無醇味，過濾靜置。將異紫堇堿標準品與提取的紅茂草生物堿分別進行HPLC檢測，其色譜如圖5-57、圖5-58所示。

可知將異紫堇堿標準品系列的色譜峰面積Y對進樣濃度進行線性回歸分析，得回歸方程為Y=104699X+169.57，R2=0.9997，線性范圍為2.0～100.0μg/mL；異紫堇堿標準品保留時間tR的范圍為5.410～5.593min。通過正交設計提取的紅茂草生物堿樣品在5.584min時出峰，峰形對稱，與標樣接近，經計算其中異紫堇堿含量為9.2794%。

5.10.3　結論

使用正交實驗設計，可以減少實驗次數，較全面地反映各因素水平對有效成分的提取效果。當乙醇體積分數為65%時，可以降低紅茂草中的油脂、糖類等物質的析出，減小生物堿本身的溶解小。改變浸提液的pH，可使紅茂草中部分生物堿轉化成其相應的生物堿鹽，增大其溶解度。浸泡時間過長不但將生物堿溶出，也會將糖類和油脂等溶出，使提取效果下降；長時間浸泡會使生物堿提取周期增大，不利于工藝模式的建立。超聲波的振動作用能夠使整個生物體及生物細胞壁破裂，加快細胞內物質的溶解，提高擴散速度和提取效率。

本實驗通過對一系列影響因素的考察，確定了紅茂草中生物堿最佳正交提取工藝模式為A4B1C3D3E5F1，即乙醇體積分數65%、超聲波作用時間20min、液料比15∶1、回流時間2.5h、浸提液pH=8、浸泡時間4h。采用SPSS 17.0統計軟件對正交結果進行分析，發現液料比對提取率的影響最顯著。紅茂草生物堿經正交實驗優化設計，HPLC法檢測，其異紫堇堿含量為9.2794%，表明該法比較合理可靠。通過對紅茂草生物堿正交提取工藝模式的建立研究，為紅茂草生物堿的提取利用提供了依據，拓展了該植物資源新產品的開發思路，為該藥用資源的其進一步研究提供了可能。