5.8　紅茂草中兩種生物堿單體的分離與鑒定

5.8.1　材料與藥品

UV-1型高效液相色譜儀（日本島津公司），CP2250型1/10萬電子天平（德國Sartorius），DK-98-11A型電熱恒溫水浴（上海恒科學(xué)儀器有限公司），有機(jī)玻璃柱（40mm×700mm，廣州東巨實(shí)驗(yàn)儀器公司）。

紅茂草，柱色譜硅膠（化學(xué)純，100～00目，青島海洋化工廠分廠），白屈菜紅堿、血根堿對照品（HPLC均≥98%，阿拉丁生物制品有限公司，批號(hào)111718-200501），乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑為分析純。

5.8.2　方法與結(jié)果

（1）紅茂草中總生物堿的提取

稱取紅茂草提取物干燥粉末100g，加95%乙醇1L，再加適量氨水，將pH調(diào)至9～10，混勻，于90℃水浴中冷凝回流90min，連續(xù)提取若干次，合并提取液，放冷，加入硫酸將pH調(diào)至1～2，此時(shí)產(chǎn)生大量橙紅色絮狀沉淀，靜置過夜，抽濾出沉淀，置于60℃干燥箱中烘干，稱定質(zhì)量，即得紅茂草總生物堿硫酸鹽。

（2）白屈菜紅堿和血根堿的提取與分離

稱取紅茂草總生物堿硫酸鹽50g，加適量氨水將pH調(diào)至9～10，混勻；加三氯甲烷200mL，于65℃水浴中冷凝回，流120min，過濾；殘?jiān)尤燃淄?00mL于同樣條件下提取，過濾；合并2次提取液，減壓濃縮至干，得到紫白色固體粉末。用少量三氯甲烷溶解粉末，待柱色譜分離。另取100～200目柱色譜硅膠300g，經(jīng)105℃活化60min，用乙酸乙酯調(diào)制成糊狀，濕法裝入有機(jī)玻璃柱（40mm×700mm）中，靜置過夜，加入樣品三氯甲烷溶液，用乙酸乙酯展開至柱底。此時(shí)柱子最下層呈橙紅色，上層呈現(xiàn)黃色，用95%乙醇洗脫，分別用容器接收橙紅色和黃色洗脫液，減壓回收乙醇至溶液體積約150mL，分別吸出濃縮液于250mL燒杯中，室溫放置2～3d后，黃色部分濃縮液得晶體Ⅰ，橙紅色部分濃縮液得晶體Ⅱ。分別濾過2種晶體，用無水乙醇清洗晶體各3次，用氨性無水甲醇重結(jié)晶，進(jìn)一步干燥，稱定質(zhì)量，避光保存。

（3）HPLC鑒定

①色譜條件

Diamonsil ODS，C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μL），流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸（30∶70），流速1mL/min，檢測波長270nm，柱溫室溫，進(jìn)樣量5μL。

②對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取自屈菜紅堿對照品20.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解，超聲30min，冷卻定容，用甲醇定容，用0.45μL微孔濾膜濾過，即得，備用。同法制備0.2g/Ld的血根堿對照品溶液，備用。

③供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取晶體Ⅰ和晶體Ⅱ各20.0mg，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解，超聲30min，冷卻定容，用0.45μL微孔濾膜濾過，備用。

④進(jìn)樣順序

在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣試液，直至相鄰兩針生物堿響應(yīng)值相對變化<1.5%后，按標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行色譜測定。

（4）提取率測定

取前述沉淀，經(jīng)干燥后稱重，得總生物堿約57g，總得率57%。

（5）白屈菜紅堿和血根堿純度的檢測

取紅茂草提取物100g，經(jīng)95%乙醇提取后制得總生物堿硫酸鹽約57g，取其中50g進(jìn)行柱色譜分離，分別得晶體Ⅰ和晶體Ⅱ約2.37g、2.14g。HPLC鑒定圖5-36，晶體Ⅰ為白屈菜紅堿，晶體Ⅱ?yàn)檠鶋A，且2種單體分離度均較高，純度分別為98.3%，95.6%，說明該分離工藝良好。

5.8.3　結(jié)論

硅膠柱色譜是根據(jù)混合物質(zhì)中不同極性成分吸附保留時(shí)間的差異，達(dá)到分離提純目的的方法。硅膠表面帶有羥基，能與極性物質(zhì)形成氫鍵，極性越強(qiáng)的物質(zhì)與硅膠吸附得越牢固。用不同極性的溶劑對硅膠進(jìn)行洗脫時(shí)，溶劑極性越強(qiáng)，越容易洗脫與硅膠吸附的物質(zhì)，極性弱的溶劑洗脫能力越差。白屈菜紅堿和血根堿同為季銨堿，極性較大，能被硅膠所吸附。在吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的整個(gè)層析過程中，制備高純度白屈菜紅堿和血根堿單體。

由于白屈菜紅堿和血根堿結(jié)構(gòu)較為相似，因此在濃縮橙紅色洗脫液時(shí)會(huì)有少量白色粉末析出。經(jīng)HPLC檢測，血根堿純度72.3%，白屈菜紅堿純度25.8%。收集白色粉末，用少量三氯甲烷溶解，經(jīng)硅膠色譜柱分離得到純度較高的血根堿，經(jīng)驗(yàn)證，其純度與之前分離得到的血根堿晶體相當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱色譜法可對紅茂草中兩種生物堿單體進(jìn)行分離，整個(gè)過程操作簡單，得到的產(chǎn)品純度與對照品相當(dāng)，是一種較為理想的分離方法。