第三篇　紅茂草藥用成分的提取、分離及鑒定

5　紅茂草中的生物堿

5.1　紅茂草生物堿提取方法及指紋檢測技術的建立

5.1.1　材料與方法

（1）材料

①樣品

采集規范化種植的紅茂草，用保鮮袋封袋，立即帶回實驗室，將材料洗凈，自然風干，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過80目篩，將樣品放入磨口廣口瓶，置于干燥器中保存、備用。

②儀器與試劑

WD-9403D型紫外分析儀（北京市六一儀器廠）；KD-1.2KD型組合式數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；凝膠層析系統（8823B-紫外檢測儀、MCR-R微電自動儀、HL-2恒流泵）；UV-2450紫外-可見分光光度計（日本島津）。

紅茂草生物堿對照品　本室制備、保存，批號20010620，濃度20mg/mL、CMC（羧甲基纖維素鈉）、薄層層析硅膠G（分析純，青島海洋化工有限公司生產）、sephadex G-50（購于Amersham-Pharmacia公司），氯仿、氨水、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、冰乙酸、丙酮、苯均為分析純，其余試劑均為國產或進口分析純。

（2）方法

①生物堿的提取

a.水溶法提取生物堿　精密稱取12.5g紅茂草粉，溶于400mL水中，置于密封的玻璃容器中，用超聲波清洗器處理1h。抽濾藥渣，煎熬濃縮至糖漿狀，加乙醇至75%，靜置沉淀24h后過濾、蒸餾，調pH值至7.0。用0.1%活性炭脫色，沉淀24h過濾，定容至100mL，分裝后高壓柜滅菌，室溫保存備用。

b.醇溶法提取生物堿　精密稱取12.5g紅茂草粉，溶于400mL 75%的乙醇溶液中，置于密封的玻璃容器中，用超聲波清洗器處理1h抽濾藥渣，濾液蒸餾至無醇味。然后加無水乙醇至85%，靜置沉淀24h后過濾，濾液用1mol/L NaOH調pH值至8.0，沉淀、過濾、蒸餾至無醇味，用HCl調pH值至7.0。用0.1%活性炭脫色，沉淀24h過濾，定容至100mL，分裝后高壓柜滅菌，室溫保存備用。

②紅茂草生物堿粗提率測定

將提取過程中的藥渣減壓抽濾近干，取出自然干燥，稱其質量，得紅茂草生物堿粗提率。

③最大吸收光譜波長的選擇

精密量取對照品溶劑和樣品溶劑100μL置于10mL的容量瓶中，加無離子水定容至10mL，以無離子水為空白對照，在UV-2450紫外-可見分光光度計上于190～500nm波長范圍內掃描，確定紅茂草總生物堿的最大吸收波長。

④標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL，分別置于試管中，加無離子水稀釋至10mL，搖勻，使成為濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL的梯度溶液，以無離子水為空白對照，測定OD210值。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，作標準曲線。

⑤樣品含量測定

在1～6號試管內，分別加入100μL提取液，均稀釋至10mL，測定紅茂草提取液吸光度，對照標準曲線，得出提取液生物堿的濃度。

⑥紅茂草中生物堿的分離

a.凝膠柱層析　按常規法裝Sephadex G-50柱后，用0.9%NaCl洗脫平衡，緩慢地加入紅茂草試樣100μL，控制流速1mL/min，根據光譜變化依次收集各組分。

b.薄層層析

ⅰ.薄層層析板的制備　稱取CMC 0.15g、KOH 0.85g溶于30mL蒸餾水中，待其完全溶解后，加入硅膠G，邊加邊攪拌，使黏度適中。攪勻，置于平整的層析板上，室溫風干后，置于50～60℃烘箱中烘干0.5h，然后將溫度調到110℃進行活化1h。

ⅱ.展開劑的篩選　以展開系統Ⅰ[V無水乙醇∶V冰乙酸：V水（3∶0.1∶1）]、展開系統Ⅱ[V甲醇∶V冰乙酸∶V水（13∶0.5∶7）]、展開系統Ⅲ[V氯仿∶V甲醇∶V濃氨試液（5∶0.6∶0.2）]、展開系統Ⅳ[V苯∶V丙酮∶V甲醇（8∶3∶0.5）]、展開系統Ⅴ[V乙酸乙酯∶V丙酮∶V苯∶V濃氨試液（4∶3∶2∶0.2）]、展開系統Ⅵ[V甲醇∶V冰乙酸∶V水（13∶0.5∶7）]為展開劑，展開劑臨用時配置。

ⅲ. Thin-Layer Chromatography（TLC）檢測　精密吸取供試樣品4μL點于0.5%CMC的硅膠G薄層板上，以展開系統Ⅰ、展開系統Ⅱ、展開系統Ⅲ、展開系統Ⅳ、展開系統Ⅴ、展開系統Ⅵ作為展開劑，展開約10cm，取出、晾干，紫外分析儀（254）或碘熏蒸檢測，記錄顯色熒光點的顏色，并計算Rf值。

碘熏蒸法　將層析好的樣板放入一加碘的密閉容器中，置于37℃烘箱內2～3min，然后取出，將熏制好的板放在酒精燈上小心烘烤，直至板上的顯色點清晰可辨。

5.1.2　結果與分析

（1）最大吸收光譜波長的選擇

掃描結果表明對照品溶劑和醇溶樣品溶劑水溶樣品溶劑均在210nm波長處有最大吸收值，210nm作為紅茂草生物堿的含量測定的測定波長。

（2）紅茂草提取液生物堿含量測定

根據測得標準試劑濃度梯度OD210值（0.229、0.466、0.687、0.943、1.172、1.385、1.575），繪制標準曲線，如圖5-1所示。

經回歸分析得到回歸方程：Y=-0.00546+0.43956X，R=0.9999（n=7）

實驗表明紅茂草生物堿在0.1～0.7mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

精密吸取紅茂草6批醇溶、水溶提取液各100μL，稀釋至10mL，測其OD210值。根據回歸方程計算生物堿含量，由藥渣質量計算其粗提率，結果如表5-1所示。

對醇溶與水溶提取液生物堿含量進行方差分析，結果如表5-2所示。

從表5-1得出醇溶提取生物堿平均為含量為3.33%，水溶提取生物堿平均含量為1.83%，前者比后者高1.5%。方差分析結果顯示P<0.01，說明兩提取方法差異性極顯著，所以建議在工業化生產中使用醇溶法。

（3）紅茂草中生物堿的分離

①Sephadex G-50柱層析分離

從Sephadex G-50柱層析被洗脫的醇溶樣品（0.1mL）經波長254nm的紫外光譜分析，結果如圖5-2所示。

從Sephadex G-50柱層析被洗脫的水溶樣品（0.1mL）經波長254nm的紫外光譜分析，結果如圖5-3所示。

從圖5-2中看出，03、04號生物堿在254nm波長處有相近最大光吸收峰值，波峰面積最大，含量最多，其余3種含量均較少。

從圖5-3中看出，04號生物堿在254nm波長處有最大光吸收峰值，波峰面積最大，含量最多，其余4種含量均較少。

Sephadex G-50常用于除去蛋白質等大分子物質中的鹽分和其他小分子物質，這里只是初步分離。

②薄層層析分離

通過提取結果來看，紅茂草生物堿主要是脂溶性，極性弱的，展開系統Ⅲ、展開系統Ⅳ、展開系統Ⅴ、展開系統Ⅵ分離效果均不佳。因此本實驗采用展開系統Ⅰ和展開系統Ⅱ為展開劑。展開劑展開系統Ⅱ不如展開系統Ⅰ的分離效果好，它只能觀察到4個熒光點，亮度較暗，Rf值相近且不易觀察，且甲醇極性比乙醇大，對視神經有很強的毒害作用。同時，也對比得出醇溶提取液比水溶提取液的分離效果更好。結果如表5-3所示。

通過對不同的展開劑層析效果比較，得出展開劑的最佳配比為展開系統Ⅰ[V乙醇∶V冰乙酸∶V水（3∶0.1∶1）]，用醇溶提取液點樣效果最好，通過紫外分析儀和碘熏蒸法可觀察到5個顏色不同的熒光點，而水溶提取效果不佳。顏色從原點算起分別為：黃綠色、淺藍色、橘黃色、藍紫色、深綠色。經反復實驗，測量計算得出它們的遷移率Rf值依次為：0.22，0.34，0.50，0.68，0.76。結果比較如圖5-4～圖5-6所示。

水溶提取液薄層層析碘熏蒸圖與醇溶的效果相同。從顯色效果來看，紫外檢測與碘熏蒸法均較好。紫外檢測可以立即觀察到不同顏色的熒光點，但如果放置時間過長，熒光點會擴散消失；碘熏蒸法則適合于長期保存。這兩種方法都適用于紅茂草生物堿的檢測與鑒定，建議同時使用。

5.1.3　結論

游離狀態的生物堿根據溶解性能分為親脂性生物堿和水溶性生物堿。親脂性生物堿易溶于苯、乙醚、氯仿、鹵代烷烴等極性低的有機溶劑，在丙酮、乙醇等親水性有機溶劑中有較好的溶解度，而在水中溶解度較小或幾乎不溶；水溶性生物堿易溶于水、酸水和堿水，在甲醇和正丁醇等極性大的有機溶劑中可溶解，但不溶于無極性或極性低的有機溶劑。紅茂草中生物堿以親脂性和親水性兩種狀態存在，所以我們采用醇溶和水溶法兩種方法提取生物堿。從醇溶和水溶提取液的分離結果來看，都分離到5種生物堿，結合粗提率與生物堿含量測定結果，證明醇溶法優于水溶法，適于在工業生產中的應用。

根據紅茂草的提取與分離結果來看，用75%與85%的乙醇對其進行提取，其展開劑選用極性弱的展開系統Ⅰ為展開系統，分離效果好，斑點較圓整，形值適中。展開系統Ⅱ采用的展開劑，斑點雖能夠分開，但不圓整，有擴散現象，形值較低，展開效果不及展開系統Ⅰ。故最終選用展開系統Ⅰ為紅茂草薄層鑒別的展開劑。

薄層層析點樣量要適宜，點樣量多，熒光點之間就不易分開，相互間有拖帶現象；點樣量少，分辨率會提高，但成分偏少的點在圖片上就不清晰，顏色也比較弱；圖片本身是黑白的，距離較近的點之間又有斑點拖帶現象，肉眼清晰可辨的點在圖片上卻不易區分，所以紅茂草醇溶提取液的薄層層析紫外檢測圖譜中清晰可辨的點只有4個。不過，本實驗所用的薄層層析展開劑是目前實驗階段分離鑒定紅茂草生物堿的最好配比，為以后的探究提供一定的實驗依據。

薄層層析法可以對所含的生物堿進行定量和定性分析，每種生物堿有其對應的Rf值和展開劑，而且在其含量少的情況下，不能用氣相和高壓液相色譜法進行測定，而薄層層析法就可將其有效靈敏分離其特別適用于分離很少量的物質。本實驗采用薄層層析對紅茂草中所含的生物堿進行分離，根據樣品斑點面積可以估計該生物堿在紅茂草中含量，通過每種生物堿透過紫外分析儀的顏色不同、Rf值不同對其進行定性分析。該方法定性鑒別，可節約溶劑和時間，樣品處理量大，是一種廉價高效、簡便快捷的分離方法。分離效果滿意，專一性強，穩定性、重現性均好，可為質控定性鑒別提供依據。