第五節 微生物的遺傳
微生物遺傳學是研究和揭示微生物遺傳變異規律的一門學科。遺傳性和變異性是微生物最基本的屬性之一。所謂遺傳性就是在一定環境條件下,微生物性狀相對穩定,能把親代性狀傳給子代,維持其種屬的性狀,從而保持物種的延續。在某些條件下,由于微生物遺傳物質的結構變化,而引起某些相應性狀發生改變的特性,稱為變異性。這種變異性是可遺傳的。遺傳性和變異性的關系:遺傳中有變異,變異中有遺傳。遺傳和變異是一對既互相對立,又同時并存的矛盾。沒有變異,生物界就失去進化的材料,遺傳只能是簡單的重復;沒有遺傳,變異不能積累,變異就失去意義,生物也就不能進化。
研究微生物的遺傳變異具有重大的理論與實踐意義。對微生物遺傳變異特性的深入研究,特別是隨著各種微生物基因組全序列測定的完成,使人們在基因組水平全面深刻認識微生物遺傳變異規律及其多樣性,從而有目的定向利用豐富的微生物資源,創造出更多具有生產性能優良的菌種,使之在相同發酵或培養條件下,達到優質高產,更好地造福于人類。
一、遺傳的物質基礎
20世紀50年代前后,人們以微生物為研究對象,用三個著名的實驗證明了DNA才是一切生物遺傳變異的物質基礎。
(一)三個經典實驗
1.經典轉化實驗
1928年,細菌學家F.Griffith以肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(舊稱肺炎雙球菌)為研究對象進行轉化實驗。肺炎鏈球菌是一種球形細菌,常成雙或成鏈排列,可使人患肺炎和小白鼠患敗血癥致死。它有兩種不同菌株,一種為有莢膜的致病菌株,菌落表面光滑,故稱S型菌株;另一種不形成莢膜,菌落外觀粗糙,稱為R型菌株。將加熱殺死的S型細菌注入小鼠體內后,小鼠并不死亡,也不能從小鼠體內分離出肺炎球菌;但是將加熱殺死的S型細菌和少量活的R型細菌一起注入小鼠體內,卻意外發現小鼠死亡,并從死小鼠體內分離出活的S型細菌(圖2-13)。對這一現象的合理解釋是:在S型細菌細胞內可能存在一種具有遺傳轉化能力的物質,它能通過某種方式進入R型細胞,并使R型細菌獲得表達S型莢膜性狀的遺傳特性。1944年,O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty從熱死的S.pneumoniae中提純了幾種有可能作為轉化因子的成分,并深入到離體條件下進行轉化實驗。從活的S型菌株中抽提各種細胞成分(DNA、蛋白質、莢膜多糖等),而后對各種生化組分進行轉化試驗。其實驗結果是轉化組分中有較完整的DNA,使實驗組的小鼠均患敗血癥而死亡。這表明只有S型菌株的DNA才能將肺炎鏈球菌的R型菌株轉化為S型;而且DNA純度越高,其轉化效率也越高,甚至只取用6×10-8g的純DNA時,仍保持轉化活力。這有力地說明了S型菌株轉移給R型菌株的絕不是遺傳性狀(指莢膜多糖)本身,而是以DNA為物質基礎的遺傳信息。

圖2-13 肺炎鏈球菌轉化試驗
2.噬菌體感染實驗
1952年,A.D.Hershey和M.Chase發表了證實DNA是噬菌體的遺傳物質基礎的著名實驗——噬菌體感染實驗(圖2-14)。首先,將大腸桿菌(E.coli)培養在以放射性32 P作為磷源或以放射性35S作為硫源的組合培養基中,從而制備出含32P-DNA核心的噬菌體或含35S-蛋白質外殼的噬菌體。接著,將這兩種不同標記的病毒分別與其宿主大腸桿菌混合。由圖2-14可見,在噬菌體感染過程中,35S標記的實驗組多數放射活性留在宿主細胞的外面,其蛋白質外殼未進入宿主細胞;32P標記的實驗組多數放射活性進入宿主細胞的里面。由此可知,進入宿主細胞的是DNA。雖然只有噬菌體的DNA進入了宿主細胞,但卻有自身的增殖、裝配能力,最終會產生一大群既有DNA核心,又有蛋白質外殼的完整子代噬菌體。這充分證明,在噬菌體的DNA中,存在著包括合成蛋白質外殼在內的整套遺傳信息。

圖2-14 噬菌體感染試驗
3.植物病毒的拆分和重建實驗
為了證明核酸是遺傳物質,H.Fraenkel-Conrat在1956年用含RNA的煙草花葉病毒(TMV)進行著名的植物病毒的拆分和重建實驗。將TMV置于一定濃度的苯酚溶液中振蕩,使其蛋白質外殼與RNA核心相分離。結果發現裸露的RNA也能感染煙草,并使其患典型癥狀,而且在病斑中還能分離到完整的TMV粒子。當然,由于提純的RNA缺乏蛋白質外殼的保護,故感染頻率比正常TMV粒子低些。實驗中,還選用了另一株與TMV近緣的霍氏車前花葉病毒(HRV),其外殼蛋白的氨基酸組成與TMV只存在2~3個氨基酸的差別。試驗的過程是這樣的:①用表面活性劑處理TMV,得到它的蛋白質;②用弱堿處理HRV得到它的RNA; ③通過重建獲得雜種病毒;④TMV抗血清使雜種病毒失活,HRV抗血清不使它失活,證實雜種病毒的蛋白質外殼來源是TMV,病毒重建成功;⑤雜種病毒感染煙草產生HRV所特有的病斑,說明雜種病毒的感染特性是由HRV的DNA所決定,而不是二者的融合特征;⑥從病斑中再分離得到的子病毒的蛋白質外殼是HRV蛋白質,而不是TMV的蛋白質外殼。以上實驗結果說明雜種病毒的感染特征和蛋白質的特性是由它的RNA所決定,而不是由蛋白質所決定,遺傳物質是RNA。
(二)遺傳物質存在的七個水平
1.細胞水平
在細胞水平上,真核微生物和原核生物的大部分DNA都集中在細胞核或核質體中。
2.細胞核水平
真核生物的細胞核與原核生物細胞的核區都是該種微生物遺傳信息的最主要裝載者,被稱為核基因組、核染色體組或簡稱基因組。除核基因組外,在真核生物(僅酵母菌的2μm質粒例外,在核內)和原核生物的細胞質中,多數還存在一類DNA含量少、能自主復制的核外染色體。原核細胞的核外染色體通稱為質粒。
3.染色體水平
不同微生物的染色體數差別很大,如米曲霉單倍體染色體數為7,大腸桿菌為1,啤酒酵母為17。原核微生物如細菌一般為單倍體(1個細胞中只有1套染色體),真核微生物如啤酒酵母的營養細胞及霉菌的接合子為二倍體(1個細胞中含有2套功能相同的染色體)。
4.核酸水平
多數生物的遺傳物質為雙鏈DNA,只有少數病毒,如大腸桿菌的?X174和fd噬菌體等為單鏈DNA。雙鏈DNA有的呈環狀(如原核生物和部分病毒),有的呈線狀(部分病毒),而有的細菌質粒DNA則呈超螺旋狀(麻花狀)。真核生物的DNA總與纏繞的組蛋白同時存在,而原核生物的DNA卻單獨存在。
5.基因水平
基因是生物體內具有自主復制能力的最小遺傳功能單位。其物質基礎是一條以直線排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。眾多基因構成了染色體,每個基因長度大體在1000~1500bp范圍。從基因功能上看,原核生物的基因是通過操縱子和其調節基因共同構成的調控系統而發揮作用,每一操縱子又包括結構基因、操縱基因和啟動基因(又稱啟動子或啟動區)。結構基因是決定某一多肽鏈結構的DNA模板;操縱基因與結構基因緊密連鎖并通過與相應阻遏物的結合與否,控制是否轉錄結構基因;啟動基因既是DNA多聚酶的結合部位,又是轉錄的起始位點。操縱基因和啟動基因不能轉錄mRNA。調節基因能調節操縱子中結構基因的活動。調節基因能轉錄出自己的mRNA,并經轉譯產生阻遏物(阻遏蛋白),后者能識別并附著在操縱基因上。由于阻遏物和操縱基因的相互作用可使DNA雙鏈無法分開,阻礙了RNA聚合酶沿著結構基因移動,使結構基因不能表達。
6.密碼子水平
遺傳密碼是指DNA鏈上決定多肽鏈中各具體氨基酸的特定核苷酸排列順序。遺傳密碼的信息單位是密碼子,每一密碼子由mRNA上3個核苷酸序列(三聯體)組成,除決定特定氨基酸的密碼子外,還有不代表任何氨基酸的“無意義密碼子”(如UAA、UAG和UGA僅表示轉譯中的終止信號)。
7.核苷酸水平
核苷酸單位(堿基單位)是一個最低突變單位或交換單位,基因是遺傳的功能單位,密碼子是信息單位。在多數生物的DNA中,均只含腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鳥苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4種脫氧核苷酸,但也有少數例外。
(三)微生物的基因組
基因組(genome)是指存在于細胞或病毒中的所有基因,它通常是指單倍體細胞的全部一套基因。由于現在發現許多非編碼的DNA序列具有重要功能,因此目前基因組的含義實際上是指細胞質編碼基因與非編碼的DNA序列組成的總稱,包括編碼蛋白質的結構基因、調控序列,以及目前功能尚不清楚的DNA序列。不同生物的DNA長度,即基因組的大小各不相同,一般可用bp(base pair,堿基對)和Mb(mega bp,百萬或兆堿基對)為單位表示基因組大小。真核與原核微生物的基因組都比較小,最小的大腸桿菌MS2噬菌體只有3000bp,3個基因(通常以1000~1500bp為1個基因計)。微生物基因組隨種類不同而表現出多樣性,下面分別以大腸桿菌和啤酒酵母為代表介紹常見微生物的基因組。
1.大腸桿菌的基因組
大腸桿菌基因組為雙鏈環狀的DNA分子,其長度是菌體長度的1000倍,所以DNA分子是以緊密纏繞成較致密的不規則小體(擬核)形式存在于細胞中,其上結合有類組蛋白蛋白質和少量RNA分子,在細胞中基因組執行著復制、重組、轉錄、翻譯以及復雜的調節過程。1997年由Wisconsin大學的Blattner等人完成了大腸桿菌全基因組的測序工作。
大腸桿菌基因組的大小為4.7×106bp,4288個基因,與其他原核微生物的基因數基本接近,說明這些微生物的基因組DNA絕大多數是可編碼的序列,不含有內含子。大腸桿菌總共有2584個操縱子,基因組測序推測出2192個操縱子,如此多的操縱子結構可能與原核基因表達大多采用轉錄調控有關。此外,由16 SrRNA、23S rRNA、5S rRNA這3種RNA組建了核糖體,它們在核糖體中的比例為1∶1∶1。多數情況下結構基因在基因組中是單拷貝的,但是編碼rRNA的基因rrn是多拷貝的,大腸桿菌有7個rRNA操縱子,7個rrn操縱子中就有6個分布于DNA的雙向復制起點oric附近,這有利于rRNA的快速裝配,以便在急需蛋白質的合成時短時間內大量生成核糖體。原核生物基因組存在一定數量的重復序列,但與真核生物相比少得多,而且重復的序列亦較短,一般為4~40bp。
2.啤酒酵母的基因組
1996年由歐洲、美國、加拿大和日本共96個實驗室的633位科學家共同首次完成了啤酒酵母這一真核生物的全基因組的測序工作。該基因組大小為13.5×106bp,5800個基因分布在16個不連續的染色體中,其DNA與4種主要組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)結合構成染色體。染色體DNA上有著絲粒和端粒,沒有操縱子結構,但有內含子序列。啤酒酵母的基因組最顯著的特點是高度重復,如tRNA的基因在每個染色體上至少有4個,多則30多個,總共約有250個拷貝(大腸桿菌約60個拷貝),tRNA的基因只位于Ⅻ號染色體的近端粒處,每個長9137bp,有100~200個拷貝。此外,啤酒酵母基因組中有許多較高同源性的DNA重復序列。如此高度重復的序列是啤酒酵母的一種進化策略,如果少數基因突變失去功能,則可不影響其生命活動,并能適應復雜多變的環境。
真核微生物和原核微生物的基因組差別較大。前者一般無操縱子結構,但存在大量非編碼序列和高度重復序列,由于基因有許多內含子(非編碼序列),從而使編碼序列變成不連續的外顯子(可編碼序列)狀態;后者有操縱子結構,但絕大多數原核微生物不含有內含子,遺傳信息的編碼序列是連續的,而且重復序列較少。
(四)原核微生物的質粒
1.質粒定義
質粒是游離并獨立存在于染色體以外,能進行自主復制的細胞質遺傳因子,通常以共價閉合環狀(簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子形式,存在于各種微生物細胞中。
2.質粒的主要特性
(1)可自主復制和穩定遺傳。質粒能在細胞質中自主復制,并能將質粒轉移到子代細胞中,可維持許多代。
(2)為非必需的基因。質粒攜帶某些核基因組中所缺少的基因,控制細菌獲得某些對其生存非必需的性狀,失去質粒的細菌仍可存活。但在特殊條件下賦予細菌特殊功能,使其得到生長優勢。例如抗藥性質粒和降解性質粒,能使宿主細胞在相應藥物或化學毒物環境中生存,并在細胞分裂時穩定傳給子代細胞。
(3)可轉移。某些質粒可以較高的頻率(>10-6)通過細胞間的接合、轉化等方式,由供體細胞向受體細胞轉移。
(4)可整合。在一定條件下,質粒可以整合到染色體DNA上,并可重新脫落下來。
(5)可重組。不同質粒或質粒與染色體上的基因可以在細胞內或細胞外進行交換重組,并形成新的重組質粒。
(6)可消除。如果質粒的復制受到抑制而核染色體的復制仍繼續進行,則引起子代細胞不帶質粒。質粒消除可自發產生,也可用一定濃度的吖啶橙染料或絲裂霉素C、溴化乙啶、利福平、重金屬離子以及紫外線或高溫等處理消除細胞內的質粒。
3.質粒的種類
根據質粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應,可將其分為以下幾類。
(1)F質粒:又稱致育因子(F因子)。其大小約100kb,這是最早發現與大腸桿菌接合作用有關的質粒。攜帶F質粒的菌株稱為F+菌株(相當于雄性),無F質粒的菌株稱為F-菌株(相當于雌性)。F質粒整合到宿主細胞染色體上的菌株稱之為高頻重組菌株(簡稱Hfr)。由于F因子能以游離狀態(F+)和以與染色體相結合的狀態(Hfr)存在于細胞中,所以又稱之為附加體。當Hfr菌株上的F因子通過重組回復成自主狀態時,有時可將其相鄰的染色體基因一起切割下來,而成為攜帶某一染色體基因的F質粒,如F-lac、F-gal等,因此將這些攜帶不同基因的F質粒統稱為F′,常用F′表示帶有F′質粒的菌株。
(2)抗性質粒:又稱抗性因子(R因子),簡稱R質粒,主要包括抗藥性和抗重金屬兩大類。帶有抗藥性質粒(如R1質粒)的細菌對氯霉素、鏈霉素、磺胺、氨芐青霉素和卡那霉素具有抗性,R質粒能使細菌對金屬離子(如碲、砷、汞、鎳、鈷、銀、鎘等)呈現抗性。
(3)細菌素質粒:Col質粒含有編碼大腸桿菌素的基因,其編碼的產物是一種細菌蛋白,只殺死其他近緣腸道細菌且不含Col質粒的菌株。由G+菌產生的細菌素也由質粒基因編碼,例如乳酸乳球菌(舊稱乳酸鏈球菌)產生的乳酸鏈球菌素(Nisin)以及枯草芽孢桿菌產生的枯草菌素,均能強烈抑制某些G+菌的生長,故可用作食品的生物防腐劑。
(4)毒性質粒:許多致病菌攜帶的毒性質粒均含有編碼毒素的基因。例如,致病性大腸桿菌含有編碼腸毒素的質粒,產生的腸毒素能引起腹瀉;蘇云金桿菌含有編碼δ內毒素(伴孢晶體)的質粒,產生的δ內毒素對多種昆蟲有強烈毒殺作用;根瘤土壤桿菌攜帶一種Ti質粒(又稱誘瘤質粒),是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子,經過改造的Ti質粒可廣泛應用于轉移及植物載體;發根土壤桿菌攜帶一種Ri質粒,是引起雙子葉植物患毛根瘤的致病因子。Ri質粒在功能上與Ti質粒有廣泛的同源性,也可用于轉基因植物載體。
(5)代謝質粒:又稱降解性質粒。它攜帶有編碼降解某些復雜有機物的酶的基因。帶有代謝質粒的細菌(如假單胞菌)能將有毒化合物,如苯、農藥、辛烷和樟腦等降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單物質,從而使它在污水處理等方面發揮重要作用。每一種具體的質粒常以其降解的底物而命名,如XYL(二甲苯)質粒、OTC(辛烷)質粒、CAM(樟腦)質粒等。此外,代謝質粒中還包括一些能編碼固氮功能的質粒。例如根瘤菌中與結瘤和固氮有關的基因均位于共生質粒中。
(6)隱秘質粒:上述質粒均具有某種可檢測的遺傳表型,但隱秘質粒不顯示任何表型效應,它們的存在只有通過物理方法,例如用凝膠電泳檢測細胞抽提液等方法才能發現。
4.質粒在基因工程中的應用
少數質粒(如F因子或R因子等)可在不同菌株間發生轉移,并可表達質粒多攜帶的基因信息。根據這一特性,通過轉化作用,利用細菌質粒作為基因的載體,將人工合成或分離的特定的基因片段導入受體細菌中,使受體細菌產生人們所需的代謝產物,故質粒已成為重要的基因載體而應用于基因工程中。
二、基因突變
基因突變簡稱突變,泛指細胞內(或病毒粒子內)遺傳物質的分子結構或數量突然發生了可遺傳的變化。基因突變可自發或經誘導產生。狹義的突變專指基因突變(點突變),包括一對或幾對堿基的缺失、插入或置換;而廣義的突變則包括基因突變和染色體畸變。染色體畸變又包括染色體的缺失、重復、插入、倒位和易位。
(一)基因突變的類型
1.堿基變化與遺傳信息的改變
不同堿基變化引起遺傳信息的改變不同,主要有以下四種類型:

同義突變是指因為某個堿基的變化雖然使密碼子發生了改變,但是由于密碼子的簡并性,并未使產物氨基酸發生變化。錯義突變是指堿基變化引起了產物氨基酸的變化。例如編A氨基酸的密碼子變成編B氨基酸的密碼子。如果堿基發生變化,代表某種氨基酸的密碼子變成終止密碼子(UAA、UAG、UGA),使蛋白質合成提前終止。例如三聯密碼子中,1對堿基的突變使原編碼氨基酸的密碼變成非氨基酸密碼。移碼突變是指由于缺失或插入了1~2個堿基,使得此處之后的堿基序列發生了改變,其后翻譯的氨基酸序列亦全部變化。
2.表型變化
表型指某一生物體所具有的一切外表特征和內在特性的總和,是其基因型在合適環境條件下通過代謝和發育而得到的具體體現。基因型又稱遺傳型,是某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因組所攜帶的遺傳信息。從篩選菌株的實用目的出發,常用的表型變化的突變類型可分為以下幾種:
(1)營養缺陷型:從自然界分離到的任何微生物在其發生營養缺陷突變前的原始菌株稱野生型菌株,簡稱野生型。如果以A和B兩個基因表示其對這兩種營養物質的合成能力,則野生型菌株的遺傳型應是[A+B+]。野生型菌株發生突變(自發突變或誘發突變)后形成的帶有新性狀的菌株,稱突變型菌株,簡稱突變株。野生型菌株由于發生基因突變而喪失了某種(或某些)酶,隨之失去了合成某種(或某些)生長因子(如堿基、維生素或氨基酸)的能力,因而成為必須從培養基或周圍環境中獲得這些生長因子才能正常生長繁殖的菌株,這類突變株稱為營養缺陷型突變株,簡稱營養缺陷型。A營養缺陷型的遺傳型用[A-B+]表示,而B營養缺陷型的遺傳型用[A+B-]表示。此類菌株可在加有相應營養物質的基本培養基平板上生長并檢出。例如,大腸桿菌的野生型菌株有合成色氨酸的能力,基本培養基上缺乏色氨酸能正常生長。如果該菌株成為色氨酸營養缺陷型,則無法再在基本培養基上正常生長,而必須添加色氨酸才能生長。營養缺陷型經回復突變或重組后產生的菌株稱原養型菌株,簡稱原養型。其營養要求在表型上與野生型相同,遺傳型均用[A+B+]表示。營養缺陷型可作為重要選擇性遺傳標記,廣泛用于遺傳學、分子生物學、遺傳工程的研究和育種工作中。
(2)抗性突變型:指野生型菌株因發生基因突變而產生的對某化學藥物或致死物理因子產生抗性的一種變異類型。抗性突變型作為重要選擇性遺傳標記,在加有相應藥物或用相應物理因子處理的培養基平板上,只有抗性突變株能生長,從而較容易地被分離篩選。
(3)條件致死突變型:某菌株或病毒經基因突變后,在某種條件下具有致死效應,而在另一種條件下沒有致死效應的突變類型。常見的條件致死突變型是溫度敏感突變型,用Ts表示。例如,大腸桿菌的某些菌株在42℃下是致死的,但能在37℃下得到Ts突變株。引起Ts突變的原因是:突變使某些重要蛋白質的結構和功能發生改變,導致在某一特定溫度下具有功能,而在另一溫度(一般為較高溫度)下喪失功能。條件致死突變型亦可作為選擇性標記。
(4)形態突變型:形態突變型是指形態發生改變的突變型,包括引起微生物個體形態、菌落形態、顏色的變化,以及影響噬菌體的噬菌斑形態的變異,一般屬非選擇性突變。例如,細菌的鞭毛或莢膜的有無,霉菌或放線菌的孢子有無或顏色變化,菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小或清晰度等的突變。
(5)抗原突變型:指由于基因突變引起的細胞抗原結構發生的變異類型。
(6)產量突變型:由于基因突變引起的代謝產物產量有明顯改變的突變類型。若突變株的產量顯著高于原始菌株稱正變株,該突變株稱正突變株,反之則稱負突變。
(二)突變率
某一細胞(或病毒粒子)在每一世代中某一性狀發生突變的幾率稱突變率。為方便起見,突變率可用某一單位群體在每一世代(即分裂1次)中產生突變株的數目來表示。例如,10-6的突變率意味著每106個細胞在分裂成2×106個細胞過程中,平均產生1個突變株。
突變率=(突變細胞數/分裂前群體細胞數)×100%
據測定,一般基因的自發突變率為10-9~10-6,轉座突變率為10-4,無義突變或錯義突變的突變率約為10-8。由于突變率很低,因此要篩選出突變株猶如大海撈針,所幸的是可以利用檢出營養缺陷型的回復突變株(即野生型菌株的表型)或抗藥性突變株的方法達到目的。
(三)基因突變的特點
基因突變一般有以下7個共同特點:
(1)自發性。指即使不經誘變劑處理也能自發地產生突變。
(2)不對應性。指突變性狀與引起突變的原因之間無直接對應關系。如抗藥性突變不是因為接觸了某種藥物(如青霉素)才發生的,而是在接觸前突變就已發生,加入抗生素只是將相應的突變株選擇出來。
(3)稀有性。通常自發突變的幾率很低(10-9~10-6)。
(4)獨立性。引起各種性狀改變的基因突變彼此是獨立的,某基因的突變率不受他種基因突變率的影響。
(5)誘變性。自發突變的頻率可因誘變劑的誘變作用而顯著提高(提高10~105倍),但并不改變突變的本質。
(6)穩定性。基因突變是遺傳物質結構的改變,因而突變后的新遺傳性狀是穩定的可遺傳的,但新突變后的基因仍可以再發生突變。
(7)可逆性。野生型菌株某一性狀某次發生的突變稱為正向突變,這一性狀也可發生第二次突變,使其又恢復原來的性狀,這第二次相反的突變稱回復突變。突變后的某一性狀可以相同的幾率回復到原有性狀,即回復突變的幾率與突變幾率相同。突變可以回復的具體含義是,野生型菌株可以通過突變,成為突變型菌株;相反,突變型菌株會再次發生突變而成為野生型狀態。
(四)誘發突變機制
誘發突變是指人為的理化因子的刺激使微生物的性狀發生了可遺傳的變化。凡是能使突變率顯著高于自發突變頻率的物理、化學和生物因子統稱為誘變劑。
誘發突變的機制包括堿基的置換、移碼突變和染色體畸變三種方式。
(五)自發突變機制
自發突變是指沒有人工參與下(不經誘變劑處理)微生物所發生的突變。稱它為自發突變絕不意味著這種突變沒有誘變原因。自發突變的機制目前了解較多的有下面三種。
(1)射線和環境因素的誘變效應:低劑量的誘變因素、長時期綜合誘變效應常使微生物發生自發突變。如宇宙空間中各種短波的輻射或高溫以及自然界普遍存在的低濃度誘變物質的作用等均可引起微生物自發突變。
(2)微生物自身有害代謝產物的誘變效應:微生物在培養過程中,菌體本身產生有害的代謝產物(H2O2、酸、堿),可作為內源性誘變劑對菌體自身遺傳物質產生影響。
(3)互變異構效應:已知只有5-溴尿嘧啶的分子結構由酮式轉變為烯醇式時,才能引起突變。由于A、T、C、G四種堿基的第6位上不是酮基(T、G),就是氨基(C、A),所以T和G可以以酮式或烯醇式狀態存在;而C、A則可以氨基式或亞氨基式狀態存在。因為平衡一般傾向于酮式或氨基式,故DNA雙鏈結構中,一般總是以A∶T和G∶C堿基配對形式出現。只是在偶然情況下,T和G會以稀有的烯醇式狀態出現,因而在DNA復制到達這一位置的瞬間,通過DNA多聚酶的作用,在其相對位置上,就不出現A和C,而是G與T;同理,如果C和A以稀有的亞氨基形式出現,在DNA復制到達這一位置的瞬間,則在新合成的DNA單鏈的與C和A相應的位置上就不出現G和T,而是A和C。這可能就是發生相應的自發突變的原因。據統計,堿基對發生自發突變的幾率為10-9~10-8。
(六)艾姆氏試驗
由于生物的遺傳物質都是核酸,故凡能使核酸結構發生改變的因素都可影響生物學功能。例如有些化學物質會引起DNA結構損傷并對生物具有致突變、致畸變和致癌變(簡稱“三致”)作用。由于癌變效應主要出現于人類等高級哺乳動物中,以及產量性狀等非選擇性突變難以檢出,故根據生物化學統一性的原理,人們設計選用了細菌為模型,以了解各種有害物質引起人類和動物“三致”的原因。艾姆氏試驗(Ames test)是一種利用細菌營養缺陷型的回復突變來檢測環境或食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效方法。Ames test測定潛在化學致癌物的方法如下:①將不同濃度的試驗藥品與從老鼠肝臟抽提的酶混合。這是因為許多化學藥品本身在動物體外無誘變作用,而必須在肝臟中與酶接觸,經代謝變化后才有誘變作用。②將上述混合物適當保溫,以圓濾紙片吸取不同濃度的試樣制成試驗濾紙片。③以基本培養基倒成平板,將鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸缺陷型突變株涂布于平板上,再將不同濃度的濾紙放入平板中央,同時做一空白對照。④經培養后在基本培養基上濾紙片周圍長出的菌落即為營養缺陷型的回復突變株,而營養缺陷型突變株在空白對照平板上濾紙片周圍未長菌落。分析計算試驗藥品是否具有誘變作用,以及最有效的誘變濃度。
供試驗用的營養缺陷型突變株應具備兩個條件:①不含DNA修復酶,使其在誘變時無法修復因堿基變化而引起的突變,使試驗結果較準確;②大部分為單點突變的營養缺陷型菌株。因此只要根據營養缺陷型突變株在誘變劑(化學藥品)的作用下是否回復突變而成為野生營養型菌株的現象,即可了解該化學藥品是否為致癌物,試驗結果表明,化學物質對細菌的誘變性與其對動物的致癌性成正比,即95%左右的致癌物質有誘變劑的作用,而90%左右的非致癌物質沒有誘變劑的作用。
目前,艾姆氏試驗已廣泛用于檢測食品、飲料、藥物、飲水和環境等試樣中的致癌物,此法具有快速(約3d)、準確(符合率>85%)和費用低等優點;而采用動物試驗檢測藥物的致癌性具有周期長、費用高和人工需要量大等缺點。
三、基因重組和雜交過程
兩個不同性狀個體內獨立基因組的遺傳基因,通過一定途徑轉移到一起,經過遺傳分子間的重新組合,形成新的穩定基因組的過程,稱為基因重組或遺傳重組,簡稱重組。重組是遺傳物質在分子水平上的雜交,因此,與一般在細胞水平上進行的雜交有明顯區別,但是細胞水平上的雜交必然包含了分子水平上的重組。在真核微生物中,基因重組可通過有性雜交、準性雜交來實現;而在原核微生物中,基因重組必須在特殊條件下進行,即通過轉化、轉導、接合、原生質體融合和溶源轉變實現基因重組。因此,微生物的遺傳基因可以通過以下5種途徑重組:①兩個不同性細胞或體細胞結合,促使整套染色體交換的基因重組,如真菌的有性雜交或準性雜交。②細胞間不接觸,僅涉及個別或少數基因的重組。例如受體細胞接受供體細胞內抽提的DNA而進行的基因重組(轉化),以及供體細胞的基因通過噬菌體的攜帶轉移到受體細胞中進行的基因重組(轉導)。③細胞間暫時溝通,使供體菌的核基因組片段傳遞給受體菌(接合)。④由噬菌體提供遺傳物質,使寄主細胞獲得完整噬菌體的核酸的基因重組(溶源轉變)。⑤雙親細胞的原生質體融合,促使部分染色體基因重組,如細菌、酵母菌、霉菌的原生質體融合。
四、微生物與基因工程
自20世紀70年代以來,隨著分子生物學、分子遺傳學與核酸化學等基礎理論的發展,產生了基因工程這一遺傳育種新領域。DNA的特異切割、DNA的分子克隆和DNA的快速測序這三項關鍵技術的建立,為基因工程技術的發展奠定了堅實基礎。
(一)基因工程定義
基因工程又稱遺傳工程,也稱體外DNA重組技術,是20世紀70年代初發展起來的一個遺傳育種新領域。它是根據需要,用人工方法取得供體DNA上的基因,經過切割后在體外重組于載體DNA上,再導入受體細胞,使其復制和表達,從而獲得新表現型的一種分子水平的育種技術。這種使DNA分子進行重組,再在受體細胞內無性繁殖的技術又稱為分子克隆。利用這種分子水平的雜交技術可以完成超遠緣雜交,并且更具定向性。通過基因工程改造后獲得的具新性狀的菌株稱為工程菌。近年來,工程菌已應用于發酵生產中,利用基因工程菌可以大量發酵生產胰島素、干擾素、疫苗、抗體等貴重的藥用蛋白。本節僅對基因工程技術作基礎性介紹,具體內容可參考相關專著。
(二)基因工程的基本操作
基因工程的基本操作步驟包括:目的基因(即外源基因或供體基因)的分離,DNA分子的切割與連接,優良載體的選擇,目的基因與載體的體外重組,重組載體導入受體細胞,重組受體細胞的篩選和鑒定,外源基因在“工程菌”或“工程細胞”中的表達,“工程菌”或“工程細胞”的大規模培養、檢測以及一系列生產性能試驗等。
基因工程的操作方法將在第四章介紹。
(三)微生物與基因工程的關系
微生物本身和微生物學在基因工程中占據了十分重要的地位,甚至無法取代,可以說一切基因工程操作都離不開微生物,這可從以下5個方面得到充分證實:①載體:充當目的基因的載體主要由病毒、噬菌體和細菌、酵母菌中的質粒改造而成;②工具酶:基因工程中具有“解剖刀”和“縫衣針”作用的千余種特異工具酶,多數從微生物中分離純化獲得;③受體:作為基因工程中的受體細胞,主要使用容易培養和能高效表達目的基因各種性狀的微生物細胞和微生物化的高等動、植物單細胞株;④微生物工程:為了大規模表達各種基因產物,實現商品化生產,常將外源基因表達載體導入酵母菌中以構建“工程菌”或“工程細胞株”,而要進一步發揮其應有的巨大經濟效益,就必須讓它們大量生長繁殖和發揮生物化學轉化作用,這就必須通過微生物工程(或發酵工程)的協助才能實現;⑤目的基因的主要供體:盡管基因工程中外源基因的供體生物可以是任何生物對象,但由于微生物在代謝多樣性和遺傳多樣性等方面具有獨特優勢,尤其是嗜極菌(即生長于極端條件下的微生物)的重要基因(如可抗高溫、高鹽、高堿、低溫等的基因)的優勢,為基因工程提供了極其豐富而獨特的外源基因供體庫。
參考文獻
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