2.7 免疫血清的制備

免疫血清的制備是免疫學基礎技術之一，高效價、高特異性的免疫血清廣泛應用于免疫學診斷、特異性免疫治療以及生命科學研究的諸方面。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。其特異性主要取決于免疫用的抗原的純度。因此欲獲得高特異性的免疫血清首先必須純化抗原，免疫方案（包括抗原劑量、免疫途徑、免疫次數以及注射抗原的間隔時間等）也是影響免疫血清效價的重要因素。

2.7.1 原理

機體受抗原刺激后，在巨噬細胞和輔助T細胞的作用下，相應的前B細胞被激活，增殖分化，形成漿細胞（抗體形成細胞），分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同抗原決定簇被不同特異性的B細胞所識別，因此由某一抗原刺激后產生的抗體，實際上是針對抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體混合物即多克隆抗體，同時由于記憶性B細胞和記憶性T細胞參與再次應答反應，致使在初級免疫的基礎上，多次重復注射免疫性抗原，不僅可獲得高效價抗體，同時抗體的親和力也明顯提高（圖2.26）。

為獲得高質量的免疫血清通常使用免疫佐劑，它可增強抗原的免疫原性，延長其在體內的存留時間，使初次反應與二次反應融合在一起，使機體的抗體水平持續上升達到理想的效果。

2.7.2 抗原的制備

免疫抗原種類很多，根據物理性狀可分為顆粒和可溶膠體兩類。顆粒性免疫抗原包括細胞和各種微生物，如細菌、病毒等。膠體可溶性免疫抗原是指蛋白質抗原。這兩類抗原注射到動物體內均能刺激機體產生特異性抗體。通常，顆粒性抗原的免疫原性大于膠體可溶性抗原的免疫原性。

抗原的相對分子質量一般在40000以上，相對分子質量在6000以下的物質為半抗原，它必須與大分子物質偶聯后才具免疫原性。相對分子質量介于二者之間的物質，免疫原性很弱，必須延長免疫時間或與大分子物質偶聯才能產生高效價的免疫血清。

蛋白質的免疫原性與所含氨基酸種類及其分子結構有關。通常，用一種氨基酸合成的多肽，不論相對分子質量大小，其免疫原性都很弱。用2～3種不同氨基酸合成的多肽，其免疫原性可增強。分子中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸）的肽類物質，其免疫性更強。

1．抗原純化

制備多克隆抗體對免疫原純度要求十分嚴格。通常，免疫原越純，獲得抗體的特異性越高，因此要求至少達到電泳純或層析純。

免疫原的純化方法常用的有電泳法、層析法等。利用高效液相色譜純化的免疫原，免疫后獲得的抗體的特異性更高。

2．半抗原與載體的偶聯

半抗原（多糖、多肽、激素、脂肪胺、類脂質、核苷以及化學物品等）并不是免疫原，只有把這些半抗原和載體結合后，才具有免疫原性，刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞。常用的載體有蛋白質類、多肽聚合物、大分子聚合物和某些顆粒等，蛋白質是一種良好的載體，通常有牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）和血藍蛋白（hemocyanin）等，此外，細菌的鞭毛蛋白（feagellin）和破傷風類毒素等也是良好的載體蛋白。

帶有游離氨基或游離羧基及兩種基團都有的半抗原，可直接與載體連接；其他不帶有游離氨基或游離羧基的半抗原，須加以適當改造，使其轉變為帶有游離氨基或羧基的衍生物，才能與載體連接，其連接方法一般用物理和化學方法進行，物理吸附的載體有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡萄糖硫酸鈉等，它們借電荷和微孔吸附半抗原，化學方法則是利用半抗原的某些功能基團連接到載體上。

（1）偶聯劑的選擇

偶聯劑種類很多，按半抗原與載體蛋白之間偶聯的化學鍵性質，可將偶聯劑分為四類（表2.5）。

偶聯反應的機制為：

1）能激活半抗原上的羧基，以便使它們與載體（通常為蛋白質上的）上的氨基反應，形成CO—NH鍵的激活劑，如碳化二亞胺、烷基氯甲酸酯和異唑鹽等。

2）在氨基之間形成連接橋（NH—R—NH）的激活劑，如二鹵硝基苯、戊二醛等。

3）在酪氨酰、組氨酰、賴氨酰殘基之間搭橋，形成偶氮鍵（—N═N—）的化合物（為雙功能的偶氮鹽）。

4）對沒有羧基或氨基的半抗原，需插入連接基（spacer），才能使半抗原與蛋白質偶聯，如琥珀酸酐、甲醛等。

（2）半抗原與載體偶聯方法舉例

1）碳化二亞胺（carbodiimide）法：碳化二亞胺是一種化學性質非常活潑的縮合劑，常用的有兩種，即水溶性的EDC[1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳化二亞胺]和脂溶性的DCC（N, N′-二環己基碳二亞胺），它們可與半抗原上的羧基又可與氨基連接。此法操作簡便，只需將半抗原與載體蛋白質按一定分子比在適當的溶液中混合，然后加入碳化二亞胺，攪拌1～2 h，置室溫反應24 h，最后，透析除去未反應的半抗原等，即可獲得人工免疫原。例如取血管緊張素1.25mg, BSA 25mg溶解于25mL蒸餾水中，再加EDC 375mg，充分混勻后置室溫24 h，然后反應液在0.15mol/L NaCl中透析24 h，其間換透析液4次以除去多余的EDC，透析后根據需要調節反應液濃度即可直接乳化免疫動物。

2）戊二醛（glutaraldehyde, GA）法：戊二醛是常用的帶有兩個活性基團的雙功能偶聯劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接，反應式為：

半抗原-NH2+R—NH2+OHC—（CH2）3—CHO—→半抗原-N═CH—（CH2）3—CH═N—R

例如取BSA 20mg與催產素2mg混合溶解于0.1mol/L pH7.5 PBS 2mL中，在緩慢的攪拌下逐滴加入0.02mol/L GA 1mL，再經Sephadex G-25純化，即得催產素-BSA偶聯物。

3）琥珀酸酐（succinic anhydride）法：將帶有羥基而缺少羧基的半抗原化合物（如甾體激素）和琥珀酸酐在無水的吡啶中反應即得到帶有羧基的半抗原-琥珀酸衍生物，再經氯甲酸異丁酯或碳化二亞胺法制備載體半抗原偶聯物。

例如：皮質醇與BSA的偶聯。稱取皮質醇、琥珀酸酐各0.5 g放入吡啶中，置室溫中反應24 h后，傾入由45mL水和6mL濃鹽酸組成的混合液中，抽濾析出沉淀，并以蒸餾水洗至pH5，干燥后以丙酮重結晶，即為皮質醇-21-半琥珀酸。取此產物69mg溶于1.5mL二氧六環中，加入0.035mL三正丁胺，降溫至10℃，并加入0.019mL氯甲酸異丁酯，置4℃,40min。此即為反應溶液。另取BSA 250mg溶于蒸餾水與二氧六環等體積配成的溶液中，加1mmol/L NaOH 0.25mL,4℃冷卻反應液，將反應液加至攪拌下的BSA與二氧六環等體積組成的混合液中，在4℃繼續反應2 h，蒸餾水透析過夜。用稀HCl調至pH4.5，此時有沉淀產生，4℃放置20 h，離心分離沉淀，再溶于pH5.5的水中，蒸餾水透析過夜，即獲皮質醇-BSA偶聯物。

4）氯甲酸異丁酯（isobutyl chloroformate）法：利用半抗原上的羧基和載體蛋白質上的氨基以肽鍵相連接。此法操作簡便，多用于類固醇抗原的制備，其反應式如下：

半抗原-COOH+Cl—COO—CH2CH（CH3）2—→

半抗原-COO—COO—CH2CH（CH3）2

半抗原-COO—COO—CH2CH（CH3）2+R—NH2—→

半抗原-NH—R+HO—CH2CH（CH3）2

5）O-羧甲基羥胺[O-（carboxymethyl）hydroxylamine]法：帶有羰基的半抗原與O-羧甲基羥胺反應，轉變為帶有羧基的半抗原衍生物，再經碳化二亞胺法制備載體-半抗原偶聯物，反應式如下：

某些半抗原雖然分子中含有游離基團，但因為這些基團對于維持其生物活性十分重要，因此不能直接用來與載體蛋白質偶聯，必須在半抗原分子上遠離基團的部位尋找偶聯位點進行連接。

（3）偶聯率的測定

由于半抗原與載體結合的數目（偶聯率）與免疫原性密切相關，一般認為：全抗原的偶聯率在10～40之間可以有效地刺激抗體的產生，如果小分子連接數目太少（＜10），則不能充分體現半抗原結構的特異性，若偶聯率太高（＞40），往往因為過多的小分子影響蛋白整體的溶解性及其他性質，所以偶聯率是評價全抗原性質乃至影響最終所得抗體效果的重要指標。

測定偶聯率的方法很多，一般都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。常用的方法有紫外分光光度法、考馬斯亮藍法、相對分子質量測定法和同位素示蹤法等。

1）紫外分光光度法：紫外吸收法的原理在于載體蛋白與小分子（不包括肽類分子）往往具有各自不同的最大紫外吸收峰，當兩種分子偶聯后，這些峰值處的吸收會出現疊加現象，即這時的吸收值是兩種分子共同貢獻的結果。

根據Lambert-Beer定律，載體蛋白（p）與小分子（h）在各自以及彼此的最大吸收波長（設蛋白的最大波長為m，小分子為n）處的吸光值與濃度（C）符合下列關系：

式中b為吸收池的光程，ε為摩爾吸光系數。

按照吸光值疊加原則，偶聯物（p-h）在m和n波長下的吸光值分別為

式中Ap-h, m, Ap-h, n分別是偶聯物在m和n波長下的吸光值；εp, m, εp, n是載體蛋白在m和n波長下的摩爾吸光系數；εh, m, εh, n則是小分子在m和n波長下的摩爾吸光系數；Cp, Ch分別是偶聯物中載體蛋白和小分子的摩爾濃度（mol/L）。

（5）÷（6），并經過變換則得到

式中Ch/Cp即偶聯率，在具體測量中，只要準確稱取載體蛋白、小分子的量，并用相同的緩沖液稀釋后分別測量m和n波長處的吸光值，然后根據（1）～（4）式得到εp, m, εp, n, εh, n, εh, m；再測量偶聯物在兩種波長下的吸光值即可通過上式計算獲得全抗原的偶聯率。

例如，楊利國等在制備GnRH-BSA偶聯物時，以該法測量了產物的偶聯率。先用PBS（0.04mol/L, pH7.2）稀釋GnRH（相對分子質量1141）和BSA（相對分子質量70000）純品，配制相應的溶液，以紫外分光光度計掃描，測得GnRH和BSA的最大吸收波長分別為266nm和274nm，再依據兩種物質在這兩個波長處的吸光值求得εGnRH,266nm, εGnRH,274nm, εBSA,266nm, εBSA,274nm分別為3.52×106,3.39×106, 3.97×107,4.31×107L/mol；而偶聯物GnRH-BSA在266nm和274nm處的吸光值分別為0.85和0.87，將上述值代入公式得

即1個BSA分子與12個GnRH相連。

另外，計算偶聯率時也可以根據載體蛋白相對分子質量常常大于小分子半抗原的特點，假設偶聯物的相對分子質量近似等于載體蛋白的，則偶聯物的濃度（mol/L）與偶聯物中載體蛋白的濃度相等，此時偶聯物中載體蛋白的濃度（mol/L）可表示為

式中mp-h為偶聯物的質量，Mp為載體蛋白的相對分子質量，V為偶聯物溶液的體積。同樣按照疊加原理，偶聯物在小分子的特征波長處的吸光值符合（6）式。

變換（6）式可得

式中Cp可按（7）式計算，而εp, n·b和εh, n·b可以通過測量載體蛋白和小分子的標準溶液吸光值，根據（2）,（3）式計算可得。

例如，在罌粟堿（相對分子質量399）和BSA（相對分子質量67000）偶聯過程中，由于BSA的相對分子質量遠大于罌粟堿的相對分子質量，所以在分別測得罌粟堿和BSA的最大特征波長309nm,280nm處的吸光值后，根據偶聯產物在280nm處吸光值疊加的原則，由如下公式

計算，可得偶聯率為17。

2）考馬斯亮藍法：考馬斯亮藍G-250可以和蛋白質結合并產生顏色轉變（由紅色變藍色），而且研究表明染料G-250主要與蛋白質中的精氨酸和賴氨酸殘基的氨基部分反應，所以對于利用載體蛋白中游離氨基（主要是賴氨酸的ε-氨基）與小分子進行偶聯的全抗原而言，測量載體蛋白偶聯前后的ε-氨基數目的變化，可以估算小分子的相應偶聯情況。

由于賴氨酸只有ε-氨基，則有

式中C, C′為賴氨酸（或氨基）的摩爾濃度（mol/L）與質量濃度（g/L）; N為一個蛋白分子中的賴氨酸數目；Mp為載體蛋白的相對分子質量。

將（8）式代入Lambert-Beer定律，則有

A=εbNC′/Mp

令

式中Kp為不同濃度的蛋白與考馬斯亮藍反應后測量595nm處吸光值，并以吸光值A為縱坐標，相應濃度為橫坐標所得曲線的斜率；ε為結合了考馬斯亮藍的賴氨酸的摩爾吸光系數。

則對偶聯物（p-h）而言，同樣有

式中x為載體蛋白所連接的小分子數（即偶聯率）; Mp, Mh分別是載體蛋白和小分子的相對分子質量。

（9）÷（10）式則得到

即通過分別測量不同濃度載體蛋白和偶聯物分別與考馬斯亮藍G-250反應后的吸光值，然后通過吸光值-濃度曲線的斜率、載體蛋白的賴氨酸數目以及載體蛋白與小分子的相對分子質量就可以算出偶聯率（x）。具體操作方法見第5章相關部分。

常見的載體蛋白所含賴氨酸數目如下表所示：

例如生物小分子雌酮（E1，相對分子質量為270.36）與載體蛋白BSA偶聯為完全抗原，對偶聯產物用透析法除去未反應的小分子物質，并用葡聚糖凝膠G-25柱進一步純化脫鹽，并收集蛋白質峰。利用考馬斯亮藍法可以測定蛋白質的濃度，也可以測定蛋白質中游離氨基的數目。測定完全抗原中的游離氨基的數目，并同載體蛋白自身的游離氨基的數目進行比較，可測定完全抗原中E1的偶聯率。分別取0.1mg/mL BSA溶液0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1mL，用PBS溶液將其均稀釋為0.1mL，加入5.0mL蛋白試劑。以試劑空白為參比，測定595nm處的吸光值，從而可計算出E1與BSA的偶聯率。

3）相對分子質量測定法：由于載體蛋白在偶聯前后相對分子質量的變化可以體現連接小分子的數目，所以對于比較純的偶聯物，可以采用相對分子質量測定法來估算偶聯率。常用的相對分子質量測量方法有SDS-PAGE凝膠電泳和基體輔助激光解析-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）。這一方法對于小分子和短肽類半抗原都適用。

如睪酮與BSA連接制備全抗原時，已知BSA和睪酮-17-半琥珀酸酯的相對分子質量分別為70000和315，利用凝膠電泳測得偶聯產物的相對分子質量為80000，則偶聯率為32[=（80000-70000）/315]。

4）同位素示蹤法：同位素示蹤法的原理在于小分子（蛋白亦可）用放射性同位素標記后仍能與載體蛋白偶聯，并且其偶聯率在標記前后保持不變。實際操作中常利用同位素標記的半抗原與載體蛋白反應前后游離的標記半抗原數目的差別進行計算。這一方法對于所有偶聯物的偶聯率測定都適用，但操作繁雜，且涉及放射性同位素，必須在有輻射防護設備和射線檢測儀的條件下才能應用。

例如，在脫落酸與BSA載體蛋白的偶聯反應中，用放射性強度為77000 cpm的放射性同位素標記脫落酸，將19.15mg該脫落酸與100mg BSA反應；偶聯結束后透析除去未與蛋白質結合的半抗原，然后測定得透析袋中的偶聯物的放射性強度為5500 cpm，則脫落酸的偶聯比率為7.1%（=5500/77000），而脫落酸與BSA的反應摩爾比為50.7，所以偶聯物中脫落酸與BSA的比例為3.6∶1。

5）其他方法：在偶聯率測定時，也有學者利用偶聯的兩種分子和偶聯物分子中氨基氮以及總氮含量的變化或者計算二硝基苯化（DNP化）的氨基酸吸光值的變化推算全抗原的偶聯率。

（4）偶聯物的純化和保存

在大分子載體與小分子半抗原偶聯反應物中，也含有游離的載體蛋白質、半抗原、偶聯劑、偶聯副產物、緩沖液成分。這些復雜成分嚴重影響抗原抗體結合反應，有些試劑毒性很強，注射到動物體內可干擾免疫反應，嚴重者引起動物死亡，因此，必須對偶聯反應的產物進行純化，常用的方法有：離心、鹽析、透析、凝膠層析等。保存偶聯物常用的方法有：低溫液態保存、凍干保存和低溫冷凍保存。

2.7.3 佐劑的應用

使用適當的佐劑可以提高動物機體對免疫原刺激的應答能力。佐劑常與抗原共同注入動物體內，以產生預期的高效價免疫血清。常用的佐劑有：氫氧化鋁[Al（OH）3]、明礬[K2SO4·Al2（SO4）3·24H2O]、石蠟油、羊毛脂等。硝酸纖維素膜和聚丙烯酰胺對于量少的抗原特別有用，從聚丙烯酰胺凝膠上切下含有抗原的凝膠條或經電泳轉移于硝酸纖維素膜后的抗原膜可直接用于免疫動物。目前應用最廣泛的是福氏佐劑，它是一種含有穩定劑（包括乳劑）的礦物油，能與抗原形成穩定的油包水乳劑，福氏佐劑分為不完全和完全兩種。福氏不完全佐劑由羊毛脂和石蠟油按一定的比例（1∶2～1∶9）混合后乳化而成。在福氏不完全佐劑中加入一定量（濃度為75mg/mL）加熱滅活的卡介苗，即為福氏完全佐劑。福氏佐劑中羊毛脂與石蠟油的配比可根據需要而定，一般冬季由于羊毛脂呈固態，所以用量較少（便于注射）；在夏季，羊毛脂融化呈糊狀，可以多用一些。一般常用的配比為1∶4。

在免疫動物時，將福氏佐劑與抗原（蛋白質濃度為1～100mg/L）按體積比1∶1混合后免疫動物。佐劑與抗原乳化可按以下方法操作：

1）研磨法：將佐劑加熱，取1.73mL放入無菌的研缽內待冷卻后緩緩滴加1.5mL抗原，邊滴邊向同一方向研磨，待抗原全部加入后，即形成乳白色粘稠的油54包水乳劑，滴在水面上并不擴散。

2）注射器乳化法：用研磨法進行乳化，不僅對抗原損失嚴重，而且容易引起細菌污染，采用注射器乳化法容易得到優質抗原乳化劑。其操作方法如下：將等量的福氏佐劑和抗原混合液分別放入兩個5mL注射器內，兩注射器之間以一細膠管相連，注意接口不能太松，交替推動針管，直至形成粘稠的乳劑為止。將乳劑滴入冷水中保持完整不散，成滴狀浮于水面，即為合格的油包水劑。

3）快速乳化法：利用超聲波粉碎器快速乳化抗原和佐劑混合物，此法操作簡便、快速。將抗原和佐劑按所需量加入離心管中，置超聲波粉碎器上，超聲頭浸液面下0.5 cm，防止打碎離心管，以水浴降溫，每次乳化10～15 s，反復乳化3～4次，即完成乳化。

4）復合乳劑：按上述方法制成的抗原乳化劑，再加入2倍體積的2%Tween-20生理鹽水，用機械方法或超聲處理，制成分散的乳劑小滴的復合乳劑。此復合乳劑粘度低，便于使用，且能更快引起更強的免疫應答。

2.7.4 動物免疫

免疫方案包括：動物種系、抗原劑量、免疫途徑、加強免疫時間、免疫次數和佐劑的選擇等。

1．用于免疫的動物

能作免疫用的動物主要是哺乳類和禽類。常用的有家兔、綿羊、豚鼠和雞等。有時根據需要也采用山羊、馬、猴、鼠和鴿子等。選擇合適的動物進行免疫極為重要，應注意以下幾點：

1）抗原與動物種屬的關系：抗原的來源與免疫動物的親緣關系越遠越好，太近不易產生高效價的抗體。

2）動物的生理狀況：同一抗原免疫同一種系不同個體的動物，由于個體差異，產生的抗體的效價常有較大差異。這與動物的年齡和營養狀況密切相關。免疫動物最好選擇雄性個體，年齡不宜太大或太小。年齡太小的個體，容易產生免疫耐受性；年齡太大或營養不良，則免疫功能低下，不易產生高效價抗體。采用家兔作免疫時，一般選擇3～9月齡、體重1.5～2 kg左右、健康的個體為宜。

3）抗血清的需要量：根據實驗中抗血清的需要量，選用最經濟的動物和免疫只數，制備大量血清時應選用馬、羊等大動物。若需要量不多則可選用家兔、豚鼠和雞等小動物。

動物免疫后要作好動物的編號、管理和記錄，適當增加營養，注意動物的健康狀況。

制備免疫血清用的動物選定后，根據抗原的性質確定免疫劑量、免疫途徑、免疫間隔時間和次數，這些都是實驗成功與否的關鍵。

2．免疫劑量

主要依據抗原的免疫原性強弱、相對分子質量大小、抗原來源難易確定抗原劑量。如要獲得高效價的抗體，免疫劑量可適當增加，時間間隔可延長，但抗原量過量易產生免疫耐受。通常蛋白質抗原免疫家兔，以每次0.5～1mg/kg為宜，加強免疫時，適當減少抗原量，約為初次劑量的1/2～1/3。

3．免疫途徑

免疫途徑對免疫成功與否有明顯影響。常用的途徑有靜脈、脾臟、淋巴結、腹腔、肌肉、皮內、皮下和足掌等。對抗原的吸收速度為：靜脈=脾臟=淋巴結＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內。一般情況下為延長抗原刺激時間，基礎免疫應選擇緩慢吸收的途徑為宜。

4．加強免疫

第一次免疫后，間隔2～3周進行第二次免疫，以后每1～2周加強免疫一次。免疫的次數，主要決定于抗原的性質和動物對免疫抗原的反應能力。免疫原性強的抗原（如蛋白質）加強免疫次數便少，相反，半抗原的免疫原則需增加至10次左右，其抗體效價才能達到最高值。抗體的親和力往往隨著加強免疫的間隔時間、次數的增多而升高。

5．免疫方案

免疫動物的方案要根據抗原的性質不同而異。以家兔為例，一般有以下幾種方法：

1）微量免疫法：先于家兔兩后足掌皮下注射滅活的卡介苗，每只約50mg, 1～2周后于腋窩淋巴結注射福氏佐劑抗原0.1mL（約含0.5mg抗原）。背部每隔2周皮下多點注射1mg抗原，不加佐劑，注射2～3次，一周后試血，鑒定抗體效價，合格者采血備用。

2）全量免疫法：首次于家兔足掌皮下注射福氏完全佐劑抗原1～10mg,1～2周后在皮下注射福氏不完全佐劑抗原1～10mg,2～3周后于背部皮下多點注射1～10mg,5周后試血，合格者采血備用。

3）混合免疫法：此法綜合足掌皮下、淋巴結、皮下多點和靜脈等途徑進行免疫，具有抗原量小、產生抗體效價高的優點。此法是于家兔兩后足掌皮下注射福氏完全佐劑抗原混合物各0.5mL（5mg/mL）,1～2周后于雙側后肢腫大的腋窩淋巴結各注射0.2mL福氏不完全佐劑抗原。1～2周后于背部皮下多點注射1mg同樣的抗原乳劑。3周后經耳靜脈采血測試效價，若效價不夠高，可用不加佐劑的抗原（5mg/mL）耳靜脈注射加強免疫，1周內注射3次，分別為0.1,0.3,0.5mL，一周后采血測試效價，合格后準備放血，分離血清，低溫保存備用。

免疫動物放血前，常用ELISA法或免疫雙擴散測試抗體效價。若經免疫雙擴散測定其效價在1∶16以上即達到要求，應及時采血，防止拖延時間引起效價下降。

6．動物采血

免疫動物經測試合格后，即可采血。采血前動物應禁食24 h，以防血脂過高，禁食期間必須保證飲水充足。常用采血方法如下：

1）心臟采血法：將動物固定于仰臥位或垂直位，剪去左胸側體毛，消毒皮膚。以食指及中指觸摸其胸壁探明心臟搏動最明顯處，用連接16號針頭的50～100mL注射器在該部位與胸壁成45°角刺入，當針頭刺中心臟時有明顯的落空和搏動感，待血液進入針筒后固定位置開始采血。本法常用于家兔、豚鼠、大鼠、鴿子等小動物，但若操作不當容易引起動物死亡。

2）頸動脈放血法：是一次性放血較為常用的方法，家兔、山羊、綿羊等動物放血常采用此方法，其放血量較多，所獲得的抗體不存在親和力、特異性和效價等方面的差異。具體操作方法是將動物仰面固定于動物固定架上，暴露頸部。在頸部用2%普魯卡因局部麻醉，15min后縱行切開頸中部皮膚，暴露氣管前的胸鎖乳突肌。分離肌肉，在肌束下面靠近氣管兩側，即見淡紅色搏動的頸動脈，仔細分離一側的頸動脈，在頸動脈套入兩根絲線，一根在遠心端，另一根在近心端。先將一側頸動脈遠心端扎緊，然后用止血鉗夾住頸動脈近心端，用眼科剪朝近心端將頸動脈剪一“V”形小口，將塑料管插入動脈中，并用近心端絲線結扎固定，防止放血塑料細管滑出。在塑料細管出口處接上滅菌的三角燒杯或離心管，輕輕松開止血鉗，血液很快流出。2.5 kg家兔可放血約80～100mL，開始時血流速度很快，以后逐漸減慢，此時可將動物的后部墊高。動物臨死前常發生掙扎，所以務必綁定好，以防掙脫插管。

3）靜脈采血：家兔可用耳靜脈放血，山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血。這種采血法可隔日1次，可以采集大量血液。家兔耳靜脈切開法可采集數毫升血液。綿羊采用靜脈采血一次能放300mL血液，放血后立即回輸100 g/L葡萄糖生理鹽水，3天后可再采血。小鼠通常用斷尾或摘除眼球法采血，每只小鼠可獲得1～1.5mL的血液。馬和驢一次可放500mL或更多的血液，但必須間隔1～2月后才可繼續采血。

7．血清分離與保存

血液收集后，室溫靜置2～3h,4℃冰箱過夜（注意容器必須干凈并且干燥，以免發生溶血），以3000r/min離心30min，取上清，加入防腐劑（終濃度0.02%硫柳汞或0.02%疊氮鈉）分裝后置-20℃或-70℃保存備用。

8．結果鑒定

以雙相瓊脂擴散試驗或間接ELISA法檢測血清的抗體效價。