第二節　紫外-可見分光光度計

在紫外及可見光區內，用于測定溶液吸光度的分析儀器稱為紫外-可見分光光度計，簡稱分光光度計。分光光度計的工作原理是采用一個可以產生多個波長的裝置，通過系列分光裝置，得到一束平行的波長范圍很窄的單色光，透過一定厚度的試樣溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光電元件上，產生光電流，在儀器上讀取相應的吸光度或透光率，完成測定工作。

一、紫外-可見分光光度計的基本構造

目前，紫外-可見分光光度計的種類、型號很多，但基本構造都相似，都主要由以下部件組成，如圖2-3所示。

1.光源

光源的主要作用是提供符合要求的入射光。分光光度計對光源的要求是：在儀器操作所需的光譜區域內能夠發射連續輻射，有足夠的輻射強度和良好的穩定性，使用壽命長。實際常用的光源一般分為紫外光光源和可見光光源。

（1）紫外光光源　紫外光光源多為氣體放電光源，其中應用最多的是氫燈和氘燈，其使用波長范圍為185～375nm。為了保證發光強度穩定，可配穩壓器，以穩定電源供電。氘燈的光譜分布與氫燈相同，但光強比同功率的氫燈要大3～5倍，使用壽命比氫燈長。

近年來，具有高強度和高單色性的激光已被開發用作紫外光源。已商品化的激光光源有氬離子激光器和可調諧染料激光器。

（2）可見光光源　鎢絲燈是最常見的可見光光源，它可發射出波長為325～2500nm范圍的連續光譜，其中最適宜的使用范圍是320～1000nm，除用作可見光源外，還可用作近紅外光源。為了保證鎢絲燈發光強度穩定，需要采用穩定電源供電，也可用12V直流電源供電。

目前，不少分光光度計已采用鹵鎢燈代替鎢絲燈，如7230型、754型分光光度計等。所謂鹵鎢燈是在鎢絲中加入適量的鹵化物或鹵素，燈泡用石英制成，具有較長的壽命和較高的發光效率。

2.單色器

單色器是一種將來自光源的復合光分解為單色光并能分離出所需要波長的裝置，是分光光度計的心臟部分。它主要由入射狹縫、色散元件、準直鏡和出射狹縫等部分組成，其中色散元件是關鍵部件。

入射狹縫的作用是限制雜散光進入；色散元件的作用是將復合光分解成單色光，常用的色散元件有棱鏡和光柵。棱鏡和光柵的色散原理是依據不同波長的光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開；準直鏡的作用是將來自狹縫的光束轉化為平行光，并將來自色散元件的平行光束聚焦在出射狹縫上；出射狹縫的作用是將額定波長范圍的光射出單色器。

3.吸收池

吸收池又稱比色皿，是用于盛放被測溶液并決定液層厚度的無色透明器皿。一般有石英和玻璃材料兩種。石英吸收池適用于可見及紫外光區，玻璃吸收池只能用于可見光區。

吸收池的規格有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等，其中以1.0cm吸收池最為常見，使用時根據具體需要進行選擇。

4.檢測系統

檢測系統的作用是檢測透過吸收池的透射光信號，并將光信號轉變為電信號。目前用得較多的檢測器是光電管和光電倍增管。其中光電倍增管是檢測微弱光時最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍。

5.信號顯示系統

信號顯示系統的主要作用是放大信號并以適當的方式指示或記錄下來。常用的信號指示裝置由直流檢流計、電位調節指零裝置以及數字顯示或自動記錄裝置等。新型紫外-可見分光光度計顯示系統大多采用微型計算機，它既可用于儀器自動控制，實現自動分析，又可進行數據處理，記錄樣品的吸收曲線，大大提高了儀器的靈敏度和穩定性。

二、紫外-可見分光光度計的類型

紫外-可見分光光度計的類型很多。按其光學系統可分為單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計三種類型。

1.單光束分光光度計

單光束是指從光源發出的光，經單色器分光后得到一束平行單色光，從進入吸收池到最后照在檢測器上，始終為一束光，如圖2-4所示。常見的721、722、723、724、752、754、T6等型號分光光度計都屬于單光束分光光度計。

單光束分光光度計的特點：

（1）儀器簡單、價格較低廉；

（2）操作麻煩，任一波長的光均要用參比調T=100％后，再測樣品；

（3）不能進行吸收光譜的自動掃描；

（4）光源不穩定性影響測量準確度。

2.雙光束分光光度計

從光源中發出的光經單色器分光后被旋轉扇面鏡（切光器）分成兩束強度相等的單色光，一束通過參比溶液，一束通過被測溶液。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為被測液的透射比，經對數交換將它轉換為吸光度并作為波長的函數記錄下來，如圖2-5所示。國產710、730、760MC、760CRT以及日本島津UV-210型號分光光度計都屬于雙光束分光光度計。

雙光束分光光度計儀器的特點：

（1）測量方便，不需要更換吸收池；

（2）補償了光源不穩定性的影響；

（3）實現了快速自動吸收光譜掃描；

（4）不能消除試液的背景干擾。

3.雙波長分光光度計

由同一光源發出的光被分出兩束，分別經過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光。利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射到同一吸收池，然后經過光電倍增管和電子控制系統，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值（圖2-6）。國產WFZ800S、日本島津UV-300、UV-365型等分光光度計都屬于雙波長分光光度計。

雙波長分光光度計的特點：

（1）不需要參比溶液；

（2）可以消除背景吸收干擾，包括待測溶液與參比溶液組成的不同及吸收液厚度差異的影響，提高了測量的準確度；

（3）適合多組分混合物、渾濁試樣的定量分析，可進行導數光譜分析等；

（4）價格昂貴。

三、紫外-可見分光光度計的基本操作

目前紫外-可見分光光度計型號繁多，雖然不同型號的儀器其操作方法略有不同（在使用前應仔細閱讀儀器說明書），但儀器上主要旋鈕和按鍵的功能基本類似。下面介紹兩種較為常見的分光光度計：SP722E型可見分光光度計、T6型紫外-可見分光光度計。

1.SP722E型可見分光光度計

（1）儀器面板按鈕介紹　SP722E型可見分光光度計儀器面板按鈕名稱如圖2-7所示。

（2）控制面板按鍵介紹　控制面板按鍵說明見表2-2。

（3）儀器基本操作

①接通電源開關，打開樣品室暗箱蓋，預熱20min后，再選擇需用的入射單色光波長，按動“切換鍵”，切換到透射比（T）測定模式，將擋光體放入樣品架，并拉動吸收池架拉桿使其進入光路，然后按下儀器的“0％T”按鈕，完成儀器調零。取出擋光體，蓋好樣品室暗箱蓋，按下儀器的“100％T”按鈕。

②打開樣品室蓋，將盛有參比溶液和被測溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。

③將參比溶液推入光路中，按下儀器的“100％T”按鈕。并按動“切換鍵”，切換到吸光度（A）測定模式。

④將被測溶液推入光路中，顯示器上所顯示的是被測樣品的吸光度值。

⑤測量完畢，取出比色皿，洗凈后倒置于濾紙上晾干，關閉電源，拔下電源插頭，蓋上儀器防塵罩，填寫儀器使用記錄。

注意：在測量過程中，每改變一次波長，都要對儀器進行校正。

2.T6型紫外-可見分光光度計基本操作

T6型紫外-可見分光光度計可選擇的波長有紫外光和可見光。儀器外觀如圖2-8所示。

這里主要介紹T6型紫外-可見分光光度計的基本操作。

（1）開機自檢　打開儀器主機電源，儀器開始初始化，約3min后儀器初始化完成。初始化完成后，儀器進入主菜單。

（2）進入光度測量狀態　按ENTER鍵進入光度測量界面。

（3）進入樣品測量界面　按START/STOP鍵進入樣品測量界面。

（4）設置樣品測量波長　按GOTO鍵，輸入測量波長，按ENTER鍵確認，儀器將自動調整波長。

（5）進入參數設定界面　按SET鍵進入參數設定界面，按▼鍵使光標移動到“試樣設定”，按ENTER鍵確認，進入到設定界面。

（6）設定使用樣品池個數　按▼鍵使光標移動到“使用樣池數”，按ENTER鍵循環選擇需要使用的樣品池數。

（7）樣品測量　按ENTER鍵返回到參數設定界面，再按RETURN鍵返回到光度測量界面。在1號樣品池內放入空白溶液，2號樣品池內放入待測樣品。關閉好樣品池蓋后按ZERO鍵進行空白校正，再按START/STOP鍵進行樣品測量。

如需測量下一個樣品，取出比色皿，更換為下一個測量的樣品，按START/STOP鍵即可讀數；如果需要更換波長，直接按GOTO鍵，調整波長；如果每次使用的比色皿個數固定，下一次使用時可跳過第（5）、（6）步驟直接進入樣品測量。

注意：更換波長后必須重新按ZERO鍵進行空白校正。

（8）測量結束　測量完成后記錄數據，退出程序或關閉儀器后測量數據將消失。確保已從樣品池中取出所有比色皿，清洗干凈后以便下一次使用。按RETURN鍵直接返回到儀器主菜單界面后再關閉儀器電源。

四、紫外-可見分光光度計的維護與保養

紫外-可見分光光度計是精密光學儀器。正確安裝、使用和保養對保持儀器良好的性能和保證測試的準確度有重要作用。

（1）儀器工作電源一般允許220V±10％的電壓波動。為保持光源燈和檢測系統的穩定性，在電源電壓波動較大的實驗室，最好配備穩壓器（有過電壓保護）。

（2）為了延長光源使用壽命，在不使用時不要開光源燈。如果光源燈亮度明顯減弱或不穩定，應及時更換新燈。更換后要調節好燈絲位置，不要用手直接接觸窗口或燈泡，避免油污黏附，若不小心接觸過，要用無水乙醇擦拭。

（3）單色器是儀器的核心部分，裝在密封盒內，不能拆開，為防止色散元件受潮生霉，必須經常更換單色器盒中的干燥劑。

（4）必須正確使用吸收池，保護吸收池光學面。

（5）光電轉換元件不能長時間曝光，應避免強光照射或受潮積塵。

思考與練習2.2

一、單選題

1.雙波長分光光度計與單波長分光光度計的主要區別在于（　）。

A.光源的種類及個數

B.單色器的個數

C.吸收池的個數

D.檢測器的個數

2.常用作光度計中獲得單色光的組件是（　）。

A.光柵（或棱鏡）+反射鏡

B.光柵（或棱鏡）+狹縫

C.光柵（或棱鏡）+穩壓器

D.光柵（或棱鏡）+變壓器

3.在紫外-可見分光光度法中，電源發出的光屬于（　）。

A.復合光

B.單色光

C.雜光

D.可見光

4.在分光光度計中，能將復合光轉化為單色光的裝置是（　）。

A.光源

B.單色器

C.吸收池

D.檢測器

5.下列關于吸收池說法錯誤的是（　）。

A.吸收池也稱為比色皿，主要作用是盛裝被測溶液

B.吸收池可分為石英比色皿和玻璃比色皿

C.在紫外光區，常用玻璃比色皿

D.吸收池在使用前要進行配套性實驗

6.關于吸收池的操作，錯誤的是（　）。

A.拿取吸收池時，只能用手指接觸兩側的毛玻璃，不可接觸光學面

B.吸收池裝被測溶液，盡量裝滿

C.洗滌時一般用自來水、蒸餾水洗滌干凈

D.吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向

二、簡答題

1.簡述紫外-可見分光光度計的主要結構及各部件作用。

2.如何正確使用吸收池？

3.紫外-可見分光光度法的測定依據是什么？

學習心得

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