第一部分 實驗基本技能

第一章 吸收光譜法

吸收光譜法（Absorption Spectrometry）是根據(jù)物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。它既可對物質(zhì)進行定性分析也可定量測定物質(zhì)的含量，包括紫外、可見及紅外吸收光譜等。如果在測定時利用單色器（如棱鏡）獲得的單色光來測定物質(zhì)對光的吸收能力，則稱為分光光度法。

可見/紫外分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對于200～760nm光區(qū)電磁輻射的吸收特性而進行分析的方法，其特點是：

（1）靈敏度高，能測定生物試樣中的微量物質(zhì)，可達10-4～10-7g/mL。

（2）選擇性較強。由于組分的分子結構不同，他們的吸收光譜也不同，因此只要選擇適當?shù)姆蛛x步驟和測定條件，就可以進行生物試樣中的單組分和多組分的測定。

（3）精密度和準確度較高。定量測定的精密度一般為0.5%，若在性能較好并經(jīng)調(diào)試過的儀器上測定，精密度可提高至0.2%，相對誤差可減少至1%～2%。

（4）儀器設備簡單，操作易掌握。

（5）定性能力相對較弱，通常還需與紅外、色譜、質(zhì)譜等技術結合才能作出可靠的定性鑒定。

第一節(jié) 吸收光譜

一、光的基本性質(zhì)

光是一種電磁波，同時具有波動性和粒子性。波動性是指光以波動的形式傳播，如光的折射、衍射、偏振和干涉等均是光的波動性的表現(xiàn)。描述波動性的重要參數(shù)是波長λ（nm）、頻率ν（Hz），它們與速度的關系是：

c=λ·ν

一切電磁波在真空中的傳播速度都等于2.9979×1010cm/s，故λ與ν成反比。

光又具有粒子性，即可把光看作是帶有能量的微粒流，這種微粒稱為光子或光量子。光電效應、光的吸收和發(fā)射等均是光的粒子性的表現(xiàn)。單個光子的能量E決定于光的頻率：

式中E為光子的能量，h為普朗克常數(shù)（6.626×10-34J·S）。能量與頻率成正比，與波長成反比。

理論上，將具有單一波長的光稱為單色光，單色光由具有相同能量的光子組成。由不同波長的光組成的光稱為復合光。

電磁輻射按波長順序排列稱為電磁波譜（見表1-1-1）。當人為地按照波長將電磁波劃分為不同的區(qū)域時，人眼能產(chǎn)生顏色感覺的光區(qū)稱可見光區(qū)，其波長范圍為380～760nm。200～380nm波長的光稱為近紫外光。

二、物質(zhì)對光的選擇性吸收

太陽或白熾燈泡（鎢燈）發(fā)出的可見光，是一種許多不同波長的光所組成的寬廣光譜，若將它通過三棱鏡分光，則可看到紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色。白光是混合光，它是由多種不同波長范圍的單色光按一定的比例混合而成的。如果把兩種適當顏色的光按一定比例混合，也可得到白光，則這兩種光的顏色就互稱為互補色。

物質(zhì)對光具有選擇性吸收的能力。同一物質(zhì)對不同波長光的吸收能力不同，不同物質(zhì)對同一波長光的吸收能力也不相同。物質(zhì)所呈現(xiàn)的顏色，正是由于它對光的選擇性吸收而產(chǎn)生的。當一束光照射到某一物質(zhì)的溶液時，若該溶液對可見光譜各種顏色的光幾乎都不吸收，則溶液呈透明無色狀；若幾乎全部吸收，則溶液呈黑色；若對各種顏色的光都能均勻地吸收一部分，則溶液呈灰色。若溶液對其中某些波長的光吸收較多，透過較少，而對另一些波長的光吸收較少，透過較多，則溶液就呈現(xiàn)這種吸收較少而透過較多的光的顏色，即溶液的顏色是它所吸收色光的互補色。例如，KMnO4水溶液選擇性吸收可見光中的大部分黃綠色光，故呈紫色；硫酸銅溶液能選擇性地吸收黃光而呈藍色。物質(zhì)的顏色與吸收光顏色、波長的關系見表1-1-2。

三、吸收光譜

以上只是粗略地用物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色來說明物質(zhì)對各種色光的選擇性吸收。如果測量某種物質(zhì)對不同波長光的吸收程度，以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，則可以得到一條曲線，稱為光吸收曲線，也稱可見/紫外吸收光譜，它能更清楚地描述物質(zhì)對光的吸收情況。

由于有機化合物發(fā)色團和助色團的種類、數(shù)目及其在分子中所處的位置和環(huán)境不同，因此測到的吸收光譜不同。依據(jù)物質(zhì)吸收光譜的形狀和特性可作該物質(zhì)的鑒別、純度檢查和初步結構分析等。

四、吸收光譜的產(chǎn)生

物質(zhì)對不同的色光具有選擇性吸收能力，即一種物質(zhì)主要吸收一定波長的光（互補吸收），其原因就在于物質(zhì)本身的分子、原子都處在屬于一定能級的運動狀態(tài)，當物質(zhì)吸收某種波長的輻射能以后，會發(fā)生能級的躍遷，產(chǎn)生吸收光譜。物質(zhì)的分子內(nèi)部有三種能級運動狀態(tài)，分述如下。

1．價電子運動

即電子相對于原子核的運動。當電子吸收輻射能后可從原來的基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。由于電子躍遷所需的能量較大，所以電子只有吸收如紫外線等高輻射能量的光線以后才能發(fā)生躍遷。假設基態(tài)電子能量為E1，躍遷后達到激發(fā)態(tài)時的能量為E2，電子從基態(tài)到激發(fā)態(tài)之間的能量差ΔE一般為1～20eV，相應的波長為60～1250nm，可表示為：

ΔE=E2-E1=hν

電子躍遷所形成的光譜稱為紫外吸收光譜或電子光譜，適用于紫外線和可見光區(qū)的光譜分析，這是本章主要討論的光譜區(qū)。

2．分子內(nèi)原子在平衡位置附近的振動

振動能級躍遷所需能量較上述為小，波長為2～250μm，位于紅外區(qū)，所形成的光譜為紅外吸收光譜。

3．分子本身繞其重心的轉動

轉動能級躍遷所需的能量較小，約為分子振動所需能量的1%。從ΔE=hν可看出，能量ΔE與波長成反比，轉動能級躍遷因所需能量小，故適應的波長就長些，為50～1000μm，所形成的光譜位于遠紅外區(qū)，稱遠紅外吸收光譜，分析上一般較少應用。

以上說明了分子內(nèi)部三種運動狀態(tài)，即三種能級，分別簡稱為電子能級、振動能級和轉動能級。雖然分子吸收輻射能之后受到激發(fā)就要從基態(tài)能級E1（能量較低）躍遷到新的激發(fā)態(tài)能級E2，同時產(chǎn)生吸收光譜，但是分子只能吸收恰好是兩個能級E1、E2之差的能量△E，這種性質(zhì)叫做量子化特征。例如電子躍遷時所需能量ΔE必須恰與電磁波中某一光子的能量或其波長相一致，即必須是：

這就說明了由于物質(zhì)結構不同只能選擇性吸收一定波長光子的原因（互補原因）。正因為物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，所以當連續(xù)光譜中能量不同的光子（λ不同）被物質(zhì)吸收后就產(chǎn)生了吸收光譜。

第二節(jié) 光吸收的基本定律——Lamber-Beer定律

可見/紫外吸收光譜的最主要用途是定量分析，即通過吸收光譜選擇一個或幾個測定波長，測定試樣中一個或幾個組分的含量。可見/紫外吸收光譜定量分析的基礎是Lamber-Beer（朗伯-比耳）定律，它說明了吸光物質(zhì)對單色光吸收的程度與該物質(zhì)的濃度與厚度之間的關系，是吸收光譜法的基本定律。

一、吸光度與透光率

當一束平行單色光照射到任何均勻、透明的溶液時，光的一部分被吸收，一部分被容器的表面反射，一部分透過溶液。如果入射光的強度為Io，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，反射光的強度為Ir，則：

Io=Ia+It+Ir

在吸收光譜法分析中，測量時采用同樣質(zhì)料的比色皿，反射光強度基本不變，影響互相抵消，于是上式可筒化為：

Io=Ia+It

透過光的強度It與入射光的強度Io之比稱為透光度或透光率，用T表示：

溶液的透光率越大，說明對光的吸收越少；反之，透光率越小，說明對光的吸收越多。T的數(shù)值一般小于1，常用百分數(shù)表示。

實際工作中常用吸光度A表示物質(zhì)對光的吸收程度。吸光度與透光率的關系是：

由上式可見，溶液對光的吸收越多，T值越小，A值越大。

二、Lamber-Beer（朗伯-比耳）定律

朗伯（Lamber）經(jīng)過多次實驗提出了一個定律：在其他情況相同時，同一厚度的液層總是以相同的百分率吸收照射到它的入射光。有一厚度為b的液層，假設它是由許多相同厚度的薄層所組成。當強度為Io的入射光透過第一個薄層后，假設有25%的Io被吸收，剩余的75%進入第二個薄層后又有25%被吸收，剩余的56.25%（即75%～75%×25%）進入第三個薄層后有25%被吸收，……，依此進行，通過液層厚度為b后，最后透射光強度為P。可見，透射光強度的分數(shù)是隨液層厚度按指數(shù)規(guī)律遞變，因此，可以用指數(shù)形式表示：

式中K′是常數(shù)。將上式改為對數(shù)形式：

其后，比爾（Beer）發(fā)現(xiàn)了一個相似的定律：當單色光通過厚度一定、均勻的吸收溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液中物質(zhì)的濃度C成正比，即：

式中K″是常數(shù)。將上式改為對數(shù)形式：

將郎伯定律和比爾定律結合起來，則可寫成：

lgT=-KbC

或

-lgT=KbC

即

A=KbC

上式稱朗伯-比耳定律的數(shù)學表達式，式中b代表溶液厚度（cm）, C為吸光物質(zhì)的濃度，K稱為吸光系數(shù)，它與物質(zhì)的性質(zhì)、溫度及入射光的波長等有關。上式的物理意義為：當一束平行的單色光通過均勻透明溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液中物質(zhì)的濃度和光通過的液層厚度的乘積成正比。朗伯-比耳定律不僅適用于可見光區(qū)，也適用于紫外及紅外光區(qū)；不僅適用于溶液，也適用于其他均勻的、非散射的吸光物質(zhì)（包括氣體和液體），是各類吸光光度法的定量依據(jù)。

三、吸光系數(shù)

吸光系數(shù)K的物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。在給定條件（單色光波長、溶劑、溫度等）下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征性常數(shù)，它只與該物質(zhì)分子在基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的躍遷幾率有關。不同物質(zhì)對同一波長的單色光有不同的吸光系數(shù)，可作為定性的依據(jù)。在吸光度與濃度（厚度）之間的直線關系中，吸光系數(shù)是斜率，其值越大，則測定的靈敏度越高。

吸光系數(shù)常有兩種表達方式：

1．摩爾吸光系數(shù)

用ε或EM表示。其意義是1摩爾濃度的溶液在厚度為1cm時的吸光度。

2．比吸光系數(shù)或稱百分吸光系數(shù)

用E1%表示，是指濃度為1%（W/V）的溶液，在厚度為1cm時的吸光度。一般常在化合物成分不明、分子量無從知道的情況下采用。

兩種吸光系數(shù)表示方式之間的關系是：

式中M是吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。摩爾吸光系數(shù)一般不超過105數(shù)量級。通常將ε值達104的劃為強吸收，小于102的劃為弱吸收，介于二者之間的劃為中強吸收。

四、偏離Beer定律的因素

根據(jù)Beer定律，當波長和強度一定的入射光通過液層厚度一定的溶液時，吸光度和吸光物質(zhì)的濃度成正比。因此，在固定液層厚度及入射光強度和波長的條件下，測定一系列已知濃度標準溶液的吸光度時，以吸光度為縱坐標，以濃度為橫坐標，應得到一條通過原點的直線（稱標準曲線或工作曲線）。但在實際工作中，特別是溶液濃度較高時，標準曲線常呈現(xiàn)彎曲，這種現(xiàn)象稱為對Beer定律的偏離。對濃度不是太高的溶液，這并不是由于Beer定律不嚴格所引起，因此屬于表觀偏離。

引起這種偏離的因素很多，大致可分為兩類：一類是物理性因素，即儀器的因素；另一類是化學性因素。

1．物理性因素

由物理性因素引起的偏離包括入射光非真正的單色光，雜散光，單光器的內(nèi)反射，以及因光源的波動、檢測器靈敏度波動等引起的偏離，其中最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

Beer定律成立一個重要前提就是單色光，即只有一種波長的光。但在實際測定中，使用的入射光并不是嚴格單色的，常有不同波長的輻射同時存在。多色輻射可以使吸光度變化而偏離Beer定律，其主要原因是由于物質(zhì)對不同波長的光有不同的吸收系數(shù)。

單色光的純度可用譜帶寬度（bandwidth）來衡量。在實際工作中，單色光源是由單色器或濾光片從連續(xù)光譜的多色光中選擇的包括最大吸收波長在內(nèi)的一小段波長范圍的復合光。譜帶寬度的值越小，單色光越純，對Beer定律的偏離就越小。若用同一譜帶寬度作為光源，但譜帶處于吸光譜上的尖峰銳谷或陡度大的曲線部分，則由于相鄰波長處的吸收系數(shù)相差較大，測定值易受到影響。因此用寬而銳的吸收峰的λmax作測定波長，吸光度A與濃度C之間容易保持良好的線性關系。

2．化學性因素

Beer定律的討論范圍僅局限于物理學方面，并沒有考慮溶液必須在什么化學條件下才能保持吸光度與濃度間的正比關系。化學因素如濃度、pH值、溶劑和溫度等的影響，主要是對化學平衡所產(chǎn)生的影響。因被測物的離解、締合、與溶劑作用或形成的有色絡合物離解等原因，可導致溶解液的組成各組分間的比例發(fā)生變化。若各組分的吸收光譜或吸收系數(shù)的差別較大，則濃度與吸光度之間的關系偏離直線。濃度對Beer定律偏離的另一原因是，在被測物濃度較大（通常大于0.01mol/L）時，吸光微粒間的平均距離減小，使相鄰微粒的電荷分布互相影響，從而改變了它對光的吸收能力。因此，Beer定律一般適用于稀溶液的測定，并要求其吸光度在0.2～0.7（或透光度20%～65%）之間，使測定結果的相對誤差控制在一個合理范圍內(nèi)。

第三節(jié) 分光光度計簡介

前已敘及，如果利用單色器獲得的單色光來測定物質(zhì)對光的吸收能力，則稱為分光光度法，所使用的儀器則稱為分光光度計。分光光度計按儀器光譜覆蓋范圍的差異分為紫外分光光度計系列及紅外分光光度計系列兩大類，分界點處的波長為2.5μm，前者波長覆蓋的范圍為190nm～2.5μm，后者為2.5～50μm。紫外系列分光光度計的光譜范圍實際上包括近紫外（200～380nm）、可見（380～760nm）、近紅外（700nm～3μm）三個光譜帶。因而可見分光光度計（VIS）的工作波長范圍為340～850nm，紫外-可見分光光度計（UV-VIS）的工作波長范圍為190～850nm，紫外-可見-近紅外分光光度計（UV-VIS-NIR）的工作波長范圍為190nm～2.5μm，而純紫外的通用分光光度計目前極少見。習慣上稱的紫外分光光度計一般是指紫外-可見分光光度計。

一、紫外系列分光光度計的基本結構及技術參數(shù)

紫外-可見分光光度計種類很多，其基本結構都由五個部分組成，見圖1-1-1所示。

圖1-1-1中每一基本單元的基本結構、元件選擇以及方法原理的變化將直接導致整機技術規(guī)格、性能參數(shù)的變化，從而形成目前市場上紫外系列分光光度計的各種不同等級、不同規(guī)格的商品儀器，以滿足各領域使用者的不同要求。

1．光源

光源必須具有穩(wěn)定的、有足夠強度的連續(xù)光譜，并經(jīng)聚光鏡使之成為平行光。普通白熾光（即鎢燈）可用以提供可見光光源，可應用的光譜范圍為320～2500nm。為保證光源穩(wěn)定，通常裝配穩(wěn)壓電源。氫弧燈（又稱氫燈）的常用燈為低壓氫燈，具有石英窗，能提供紫外光，光譜為180～375nm，但實際上只用于360nm以下。氫燈燈絲需預熱，點燃后燈絲停止加熱，故需配有熱開關控制的專用穩(wěn)壓器。其他光源還有碘鎢燈、弧汞燈、氖燈、激光等。

2．單色器

它是分光光度計的心臟部分，是一種將來自光源的混合光分解為單色光，并能任意改變波長的裝置，包括分光系統(tǒng)、光路狹縫和波長調(diào)節(jié)器等部件。光源的光束經(jīng)入光狹縫進入單色器，經(jīng)準直鏡反射至棱鏡，經(jīng)過棱鏡色散分光并發(fā)射返回準直鏡，又再反射經(jīng)出光狹縫投射出來。

（1）分光系統(tǒng)：有棱鏡和光柵兩種，使光源色散產(chǎn)生寬廣光譜。

棱鏡：由玻璃或石英制成，形狀和用法在不同儀器中各有不同。

光柵：在石英或玻璃表面上刻上許多等距離的平行線（一般每毫米上千條），通過光的“干涉”而分成光譜。

（2）光縫：分入光狹縫和出光狹縫。一般兩者寬度一致。狹縫愈窄，光束波純度愈高。狹縫寬度常用實際寬度（以毫米為單位）表示。

（3）波長調(diào)動器：一般是調(diào)節(jié)準直鏡位置以選擇分光光譜的波長。

3．吸收池

（1）吸收池的種類：吸收池有各種不同的容量和光程規(guī)格，常用吸收池（又稱比色杯）的光程有1cm、2cm、10cm等，形狀有方形、長方形和圓柱形等。玻璃吸收池用于可見分光光度測定。因為玻璃能吸收紫外線λ＜350nm，故不能用于紫外分光光度測定。石英吸收池既可用于紫外分光光度測定，也可用于可見分光光度測定。

對于準確度要求較高的分析，需用配對吸收池（配對標準以讀數(shù)相對偏差＜2%為宜），一般可固定使用以消除誤差。吸收池架也應固定方向。使用時均應注意維護，保持其精度。

（2）吸收池的使用和清潔：吸收池四面僅有兩面光滑透明，具有光學性質(zhì)；另兩面則無，它們常以磨砂玻璃為材料，以示區(qū)別。吸收池光學表面不能有任何污損，否則會引起光吸收的增加。例如，吸收池上看不出的指紋或殘跡即能引起UV區(qū)高達1.0A的光吸收。故拿取吸收池時只能捏住磨砂玻璃的兩面。

每次使用完畢，應立即倒空吸收池，然后以溶劑（常用水）沖洗3～4次，最后可用甲醇沖洗；用蘸有洗滌劑的海綿清洗，效果也較好。如果這樣的清潔步驟仍無效時，可將吸收池在鉻酸或50%硝酸中短時間浸泡，再用水充分沖洗。

4．檢測器

檢測器的主要作用是接受透射光信號以轉換成電能，必要時加以放大。檢測器有下列三種類型：

（1）光電池：它由三層物質(zhì)組成，即導電性良好的金屬（如銀）層——作為光電池負極，半導體硒薄層和鐵層——作為光電池的正極。它們所組成的圓形或長方形的薄片裝在一個特別的匣子里面。當光電池受光照射以后，半導體硒的表面逸出電子。由于電子向正極方向移動，因此，在上、下兩金屬片間產(chǎn)生一個電位差，線路連通時，即產(chǎn)生電流。光電流的大小與光電池受到光照的強度成正比。光電池受光照時間持續(xù)太久或受強光照射時，將導致光電池產(chǎn)生“疲勞”現(xiàn)象而降低其靈敏度。

（2）光電管：它由封裝在真空透明套里的一個半圓柱形負極和一個絲正極組成。負極凹面上有一層光電發(fā)射材料，此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子。當在兩極間加有電壓時，發(fā)射出來的電子就流向絲正極而產(chǎn)生光電流。由于光電管具有很高的電阻，所以產(chǎn)生的電流容易放大，其靈敏度比光電池高。

（3）光電倍增管：它遠比普通的光電管優(yōu)越，它可將第一次發(fā)射的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬倍。與光電管相似，光電倍增管的負極表面在光照射下可發(fā)射電子。電子被帶有正電的兼性正極所吸引，并向著它加速運動。當電子打在兼性正極上時，能引起更多的電子自表面射出。這些射出的電子又被第二個兼性正極所吸引，同樣再產(chǎn)生更多的電子。這樣的過程重復9次后，每個光子可形成106～107個電子。這些電子最后被收集在正極上，所得的倍增電流可進一步加以放大和測量。光電倍增管的靈敏度比光電管高200多倍。

5．信號顯示系統(tǒng)

早期的分光光度計多采用檢流計，以微安表作顯示裝置，直接讀出吸光度或透光率。近代的分光光度計則多采用數(shù)字電壓表等顯示，用X-Y記錄儀直接繪出吸收（或透射）曲線，并配有計算機數(shù)據(jù)處理器。

分光光度計的型號很多，按其光學系統(tǒng)可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。其中單波長分光光度計又分為單光束和雙光束分光光度計兩種。目前國內(nèi)廣泛采用的單波長單光束分光光度計是721型分光光度計。

二、分析條件的選擇

1．入射光波長

通常都是選擇顯色溶液的λmax的入射光作測量波長。這不僅能獲得高的靈敏度，而且由于在λmax附近吸光度隨波長的變化較小，入射光波長的稍許偏移和非單色性引起的吸光度變化較小，從而對比耳定律的偏離較小。當然，若在λmax附近有其他峰譜（如顯色劑、共存組分吸收峰）干擾時，則只能選用其他的測量波長。有時在測定高濃度組分時，為使工作曲線有足夠的線形范圍，寧可選用其他靈敏度較低的吸收峰波長作為分析測量波長。

2．測量狹縫的選擇

測量狹縫越窄，雖然得到的單色光波長范圍越窄，單色光“越純”，分辨率越高，但同時入射光強度也越弱，勢必需要提高檢測器的增益，隨之而來的儀器噪聲增大，對測量不利。若狹縫過寬，則非吸收光的吸入將導致測量靈敏度的下降和工作曲線關系的變差。特別在分析組分較復雜的樣品時，可能引入干擾組分的吸收光譜，使選擇性變差。故測量時應選擇合適的狹縫寬度。

3．適當控制吸光度的測量范圍

吸收曲線的斜率隨濃度的增大而增大，濃度越高，不純的單色光引起的對比耳定律的偏離程度越大，而且，任何分光光度計都有一定的測量誤差，其中透光率的讀數(shù)誤差是主要因素。大多數(shù)分光光度計的透光率讀數(shù)的變動范圍為1%～0.2%。0.2%被認為是實際能達到的讀數(shù)準確度極限。對一給定的分光光度計，其透光度讀數(shù)ΔT是一常數(shù)。但由于透光度與濃度的關系并非直線，在不同的透光率的讀數(shù)范圍，同樣大小的ΔT所引起的濃度誤差ΔC是不同的。當T大時，ΔC小，但此時濃度很低，相對誤差較大；當T小時，ΔC大，此時雖然C較大，但仍較大。只有當透光率適中時，也就是測量濃度適中時，才較小。可以證明，當T=36.8%（A=0.434）時，測量的相對誤差最小。一個幾乎固定的最小誤差出現(xiàn)在T為20%～65%（A為0.7～0.2）的范圍內(nèi)。因此，為避免出現(xiàn)大的誤差，必須設計好樣品用量和它在測量過程中的稀釋度。

4．參比溶液的選擇

將朗伯-比耳定律關系應用于實際分析時，所研究的溶液必須在吸收池中。由于吸收池表面的反射和吸收，入射光的強度要受到一定的損失。此外，由于溶液的某種不均勻性引起的散射，光強也可能減弱。另外，因過量顯色劑或其他試劑（緩沖劑、掩蔽劑等）甚至溶劑本身所引起的吸收，也會影響對所測吸光物質(zhì)吸光度的測量。因此，必須對這些影響因素進行校正，以消除或盡可能減小這種影響。最常用的校正方法是扣除參比溶液（空白溶液）在相同儀器條件下，用相同的（或性能參數(shù)十分相近的）吸收池測得的吸光度。參比溶液濃度的選擇應視具體情況而定。

（1）當試液、顯色劑及所用其他試劑在測定波長處都無吸收時，可用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水）作參比溶液。

（2）當試液無吸收，而顯色劑或其他試劑在測定波長處有吸收時，可用試樣的“試劑空白”作參比溶液。

（3）若待測試液本身在測量波長處有吸收，而顯色劑無吸收，則可用不加顯色劑的“試劑空白”作參比溶液。

（4）若試液和顯色劑在測量波長處都有吸收，可將一份溶液加入適當掩蔽試劑，將待測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑反應，然后按相同步驟加入顯色劑和其他試劑，以此溶液作參比溶液。

在進行樣品測量前，先將參比溶液裝入吸收池中，在測定波長處利用分光光度計的T=100%旋鈕將透光率調(diào)至100%（A=0）處，然后進行樣品的吸光度測量。

第四節(jié) 吸收光譜法的應用

分光光度分析方法日趨完善，它是物質(zhì)定性和定量分析中不可缺少的重要手段。只要被測物質(zhì)在紫外-可見-近紅外波段中有吸收光譜，就可以用光譜光度分析方法來進行定性和定量分析。此外，還可追蹤酶與底物反應隨時間而發(fā)生的吸光度變化以此來研究酶的動力學，利用比濁法對培養(yǎng)的細胞、細菌或免疫復合物進行定量測定，使用雙波長測定法來排除由于樣品混濁而產(chǎn)生的背景吸收的影響，以及用導數(shù)光譜法來解決多組分混合物的重疊吸收帶和痕量成分的定性、定量分析等。

一、定性分析

利用可自動掃描記錄的可見/紫外分光光度計能快速而準確地獲得樣品的吸收光譜，對于手動式單光束分光光度計就應在研究的波段范圍內(nèi)每隔10nm或20nm逐點測定吸光度，在吸收峰附近應進一步精確測定，以便準確測定最大吸收峰的位置（誤差通常允許在1～2nm），繪出吸收光譜。根據(jù)光譜的λmax, λmin, λsh, ε, E1%以及曲線形狀，在相同條件下與已知物質(zhì)的吸收曲線進行對比，就可知道它們是否為同一物質(zhì)，從而進行定性分析。具體方法是：

1．比較光譜的一致性

同一物質(zhì)在同一條件下的吸收光譜應完全一致。在鑒定時，純化樣品和標準純品以相同濃度分別配制在相同溶液中，分別測繪它們的吸收光譜。若無標準純品，可利用現(xiàn)成的標準光譜圖（從文獻中可查到）。比較二者吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度和形狀。若二者完全一致，則可初步確定二者具有相同的生色基團，樣品和標準可能為同一化合物。

2．比較λmax及吸收系數(shù)ε或E1%的一致性

有些物質(zhì)具有相同的發(fā)色團，盡管分子結構不同，也會導致吸收光譜相同，但它們的吸收系數(shù)是有差別的，因此在整個光譜圖比較的同時，還要比較λmax及吸收系數(shù)ε或E1%的一致性。若整個吸收光譜相同，而且λmax、吸收系數(shù)ε或E1%也完全相同，則可認為它們是同一物質(zhì)。

3．與其他方法結合進行分析

因為大多數(shù)化合物的可見/紫外吸收光譜吸收峰的譜帶較寬，缺乏精細結構，也就是說其特征不明顯，因此僅僅依靠可見/紫外吸收光譜來定性鑒定化合物，其可信程度是極有限的，往往還需要同紅外光譜、色譜、質(zhì)譜或核磁共振波譜等結合起來，才能作出可靠的鑒定。不過比較樣品與標準品的吸收光譜，對于純度鑒定卻很有用處。若發(fā)現(xiàn)樣品的吸收光譜存在有異常吸收峰，則可以認為異常吸收峰是由于樣品中存在的雜質(zhì)所致。

二、定量分析

可見/紫外分光光度法最主要的應用是定量分析。按照朗伯-比耳定律，溶液中溶質(zhì)的吸光度正比于溶質(zhì)的濃度。在一特定波長單色光下測出溶液的吸光度，即可計算出溶液的濃度。使用可見/紫外分光光度法進行定量分析，一般采用下列方法。

1．標準曲線（工作曲線）法

配制與被測組分相同的一系列標準溶液，在與被測組分相同的最大吸收波長下，測定各標準溶液的A值。以A值為縱坐標，以濃度C為橫坐標，繪出濃度-吸光度關系曲線，即標準曲線。將樣品溶液在相同條件下測定A值，從橫坐標上找出與此A值相對應的濃度，即為樣品溶液的濃度。標準曲線的繪制應根據(jù)幾次實驗測得值的平均值進行繪制，這種方法對于大量樣品分析或例行測定是比較方便的。在固定儀器和方法的條件下，繪制好標準曲線后可使用多次，不必每次實驗都再進行繪制。但應注意，如果以后測定的條件有所改變，如儀器經(jīng)搬動后靈敏度有所改變，所有的試劑用盡又需重新配制，溫度有較大變化等，此時需對標準曲線進行校正后重新繪制。

在實際工作中，測定標準系列的吸光度A值后繪制A-C曲線時，會發(fā)現(xiàn)標準曲線只在一定濃度范圍內(nèi)呈直線關系。當濃度超過一定數(shù)值時，曲線頂端即發(fā)生向下彎曲的現(xiàn)象，說明該物質(zhì)濃度超過一定數(shù)值時，其吸光度反而減弱，不再遵守比爾定律。可利用此濃度作為上限，重新調(diào)整標準系列的濃度并繪制標準曲線。但只要被測溶液濃度在曲線的直線范圍內(nèi)，也可直接進行定量測定。

理想的標準曲線應該是：不同濃度標準溶液所測得的吸光度對濃度作圖時，是一條斜率接近于1且通過原點的直線；標準溶液濃度范圍應在被測物質(zhì)濃度的一半到兩倍之間；吸光度在0.05～1.0之間為宜；繪制標準曲線時至少應有五個點，每個點有兩個以上的重復值，重復值之間的平均誤差應低于5%；曲線不能任意延長，點與線的垂直距總和最小。

標準曲線不僅可用于樣品的直接定量，而且在一定程度上還可鑒定所用的實驗方法是否符合Lamber-Beer定律；對實驗技術人員來講，也可檢查其操作及實驗條件等的控制是否正確無誤。同時，通過標準曲線的繪制還可確定被測樣品的最大濃度范圍。

2．利用標準管計算測定物含量

將標準與樣品分別在相同條件下顯色，測定其吸光度，因是相同物質(zhì)在相同條件下測定，故可按下式計算樣品的濃度：

則：

此法適用于A-C線性關系良好且通過原點的情況。同時，為減少誤差，所用標準溶液的濃度應盡可能地與樣品液的濃度接近。

3．利用摩爾吸光系數(shù)ε求測定物的含量

前已敘及摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)濃度為1mol、厚度為1cm時所測得的該物質(zhì)在一定波長下的吸光度。所以，在已知ε的情況下，讀取測定厚度為1cm時相同波長的吸光度A，其濃度C為：

這時求得的濃度為摩爾濃度。此公式常用于紫外吸收法。例如蛋白質(zhì)的含量測定，根據(jù)蛋白質(zhì)在280nm時的ε值，再讀取待測液的A值，即可按上式算出待測液的濃度。此法無需顯色，操作簡便。

兩種或兩種以上待測物的混合液在未被分離的情況下，也可利用ε或E1%、λ的不同進行定量測定。

例如有a和b兩種物質(zhì)組成的混合液，需分別測定其含量。

設a和b在波長為λ1時，摩爾吸光系數(shù)為εal和εbl；在波長為λ2時，摩爾吸光系數(shù)為εa2和εb2；混合液在λ1時吸光度為A1，在λ2時吸光度為A2；各自濃度分別為Ca和Cb，則：

A1=εa1Ca+εb1Cb

A2=εa2Ca+εb2Cb

解上述聯(lián)立方程組，求得a、b兩種物質(zhì)的濃度Ca、Cb分別為：

用上述方法同樣可以求出三種甚至三種以上未分離組分的各自濃度。

4．雙波長光度分析法

在單波長中常遇到以下困難：共存的其他成分的吸收光譜與被測成分的吸收光譜重疊，干擾測定；在測定的波長范圍內(nèi)，輻射光受到溶劑、膠體、懸浮體等散射或吸收，產(chǎn)生背景干擾。解決以上問題的傳統(tǒng)方法是用化學的或物理化學的各種分離手段將干擾成分分離，但其效果有限。20世紀50年代興起的雙波長光度法，以后又研究的三波長光度法等，就是用于解決上述問題的。

在經(jīng)典的單波長光度法中，通常采用雙光束光路，用溶劑或空白溶液作參比調(diào)零點。在這樣的測定中，參比和試樣的液池位置、液池常數(shù)、溶液濁度及溶液組成等任何差異都會直接導致誤差。

采用雙波長光度法也只用一個樣品池，使兩束不同波長的單色光交替地通過樣品池，然后對通過該樣品的兩波長信號進行處理，以ΔA形式記錄，試樣溶液在兩個波長λ1和λ2處的ΔA差值與溶液中的待測物質(zhì)濃度呈正比關系，從而基本上消除了樣品背景的影響。

三、化學反應動力學研究

分光光度法的另一重要用途是測定化學反應的速率。假設某一化學反應如下所示：

A+B→C+D

如果A或是B在UV-VIS的某一波長范圍內(nèi)具有光吸收，則在該波長λ1處會形成吸收光譜。檢測反應過程中，通過A或B量的減少而導致A或B的吸光度值的降低程度即可測量該化學反應的反應速度。如果產(chǎn)物C或D在特定波長λ2下有光吸收，那么檢測λ2的吸光度值變化（吸光度值隨C或D量的增加而增加）也可測定該化學反應的反應速率。因此，檢測反應過程中底物或產(chǎn)物吸光度值變化的動態(tài)，就可以跟蹤監(jiān)測化學反應的動態(tài)過程。這一方法廣泛應用于酶促反應。