第二章 藥物分析的基本方法

第一節 物理常數測定法

一、熔點測定法

依照待測物質的性質不同，測定法分為下列3種。各品種項下未注明時，均系指第一法。

（一）第一法

第一法測定易粉碎的固體藥品。

取供試品適量，研成細粉，除另有規定外，應按照各品種項下干燥失重的條件進行干燥。若該品種為不檢查干燥失重、熔點范圍低限在135℃以上、受熱不分解的供試品，可采用105℃干燥；熔點在135℃以下或受熱分解的供試品，可在五氧化二磷干燥器中干燥過夜或用其他適宜的干燥方法干燥，如恒溫減壓干燥。

分取供試品適量，置熔點測定用毛細管（簡稱毛細管，由中性硬質玻璃管制成，長9cm以上，內徑0.9～1.1mm，壁厚0.10～0.15mm，一端熔封；當所用溫度計浸入傳溫液在6cm以上時，管長應適當增加，使露出液面3cm以上）中，輕擊管壁或借助長短適宜的潔凈玻璃管，垂直放在表面皿或其他適宜的硬質物體上，將毛細管自上口放入使自由落下，反復數次，使粉末緊密集結在毛細管的熔封端。裝入供試品的高度為3mm。另將溫度計（分浸型，具有0.5℃刻度，經熔點測定用對照品校正）放入盛裝傳溫液（熔點在80℃以下，用水；熔點在80℃以上，用硅油或液狀石蠟）的容器中，使溫度計汞球部的底端與容器的底部距離2.5cm以上（用內加熱的容器，溫度計汞球與加熱器上表面距離2.5cm以上）；加入傳溫液以使傳溫液受熱后的液面適在溫度計的分浸線處。將傳溫液加熱，待溫度上升至較規定的熔點低限約低10℃時，將裝有供試品的毛細管浸入傳溫液，貼附在溫度計上（可用橡皮圈或毛細管夾固定），位置須使毛細管的內容物適在溫度計汞球中部；繼續加熱，調節升溫速率為每分鐘上升1.0～1.5℃，加熱時須不斷攪拌使傳溫液溫度保持均勻，記錄供試品在初熔至全熔時的溫度，重復測定3次，取其平均值，即得

“初熔”系指供試品在毛細管內開始局部液化出現明顯液滴時的溫度。

“全熔”系指供試品全部液化時的溫度。

測定熔融同時分解的供試品時，方法如上述，但調節升溫速率使每分鐘上升2.5～3.0℃；供試品開始局部液化時（或開始產生氣泡時）的溫度作為初熔溫度；供試品固相消失全部液化時的溫度作為全熔溫度。遇有固相消失不明顯時，應以供試品分解物開始膨脹上升時的溫度作為全熔溫度。某些藥品無法分辨其初熔、全熔時，可以其發生突變時的溫度作為熔點。

（二）第二法

第二法測定不易粉碎的固體藥品（如脂肪，脂肪酸、石蠟、羊毛脂等）。

取供試品，注意用盡可能低的溫度熔融后，吸入兩端開口的毛細管（同第一法，但管端不熔封）中，使供試品高約10mm。在10℃或10℃以下的冷處靜置24h，或置冰上放冷不少于2h，凝固后用橡皮圈將毛細管緊縛在溫度計（同第一法）上，使毛細管的內容物適在溫度計汞球中部。照第一法將毛細管連同溫度計浸入傳溫液中，供試品的上端應適在傳溫液液面下約10mm處；小心加熱，待溫度上升至較規定的熔點低限尚低約5℃時，調節升溫速率使每分鐘上升不超過0.5℃，至供試品在毛細管中開始上升時，檢讀溫度計上顯示的溫度，即得。

（三）第三法

第三法測定凡士林或其他類似物質。

取供試品適量，緩緩攪拌并加熱至溫度達90～92℃時，放入一平底耐熱容器中，使供試品厚度達到12mm士1mm，放冷至較規定的熔點上限高8～10℃；取刻度為0.2℃、汞球長18～28mm、直徑5～6mm的溫度計（其上部預先套上軟木塞，在塞子邊緣開一小槽），使冷至5℃后，擦干并小心地將溫度計汞球部垂直插入上述熔融的供試品中，直至碰到容器的底部（浸沒12mm），隨即取出，直立懸置，待黏附在溫度計汞球部的供試品表面渾濁，將溫度計浸入16℃以下的水中5min，取出，再將溫度計插入一外徑約25mm、長150mm的試管中，塞緊，使溫度計懸于其中，并使溫度計汞球部底端距試管底部約為15mm，將試管浸入約16℃的水浴中，通過軟木塞在試管口處調節試管的高度使溫度計的分浸線同水面相平；加熱使水浴溫度以每分鐘2℃的速率升至38℃，再以每分鐘1℃的速率升溫至供試品的第一滴脫離溫度計為止；檢讀溫度計上顯示的溫度，即可作為供試品的近似熔點。再取供試品，照前法反復測定數次；如前后3次測得的熔點相差不超過1℃，可取3次的平均值作為供試品的熔點；如3次測得的熔點相差超過1℃時，可再測定2次，并取5次的平均值作為供試品的熔點。

二、旋光度測定法

平面偏振光通過含有某些光學活性化合物的液體或溶液時，能引起旋光現象，便偏振光的平面向左或向右旋轉。旋轉的度數，稱為旋光度。偏振光透過長1dm且每1mL中含有旋光性物質1g的溶液，在一定波長與溫度下測得的旋光度稱為比旋度。測定比旋度（或旋光度）可以區別或檢查某些藥品的純雜程度，亦可用以測定含量。

（一）測定方法

除另有規定外，本法系采用鈉光譜的D線（589.3nm）測定旋光度，測定管長度為1dm（如使用其他管長，應進行換算），測定1溫度為20℃。用讀數至0.01°并經過檢定的旋光計。

測定旋光度時，將測定管用供試液體或溶液（取固體供試品，按各品種項下的方法制成）沖洗數次，緩緩注入供試液體或溶液適量（注意勿使發生氣泡），置于旋光計內檢測讀數，即得供試液的旋光度。使偏振光向右旋轉者（順時針方向）為右旋，以“+”符號表示；使偏振光向左旋轉者（反時針方向）為左旋，以“-”符號表示。用同法讀取旋光度3次，取3次的平均數，照下列公式計算，即得供試品的比旋度。

對液體供試品

對固體供試品

式中：[α]——比旋度；

D——鈉光譜的D線；

t——測定時的溫度，℃；

l——測定管長度，dm；

α——測得的旋光度；

d——液體的相對密度；

c——每100mL溶液中含有被測物質的重量（按干燥品或無水物計算）, g。

旋光計的檢定，可用標準石英旋光管進行，讀數誤差應符合規定。

（二）注意事項

1．每次測定前應以溶劑作空白校正，測定后，再校正1次，以確定在測定時零點有無變動；如第2次校正時發現零點有變動，則應重新測定旋光度。

2．配制溶液及測定時，均應調節溫度至（20±0.5）℃（或各品種項下規定的溫度）。

3．供試的液體或固體物質的溶液應充分溶解，供試液應澄清。

4．物質的比旋度與測定光源、測定波長、溶劑、濃度和溫度等因素有關。因此，表示物質的比旋度時應注明測定條件。

三、折光率測定法

光線自一種透明介質進入另一透明介質時，由于光線在兩種介質中的傳播速度不同，使光線在兩種介質的平滑界面上發生折射。常用的折光率系指光線在空氣中進行的速度與在供試品中進行速度的比值。根據折射定律，折光率是光線入射角的正弦與折射角的正弦的比值，即

式中：n——折光率；

sini——光線的入射角的正弦；

sinr——光線的折射角的正弦。

物質的折光率因溫度或入射光波長的不同而改變，透光物質的溫度升高，折光率變小；入射光的波長越短，折光率越大。

折光率以表示，D為鈉光譜的D線，t為測定時的溫度。測定折光率可以區別不同的油類或檢查某些藥品的純雜程度。

本法系采用鈉光譜的D線（589.3nm）測定供試品相對于空氣的折光率（如用阿貝折光計，可用白光光源），除另有規定外，供試品溫度為20℃。

測定用的折光計須能讀數至0.0001，測量范圍1.3～1.7，如用阿貝折光計或與其相當的儀器，測定時應調節溫度至（20±0.5）℃（或各品種項下規定的溫度），測量后再重復讀數2次，3次讀數的平均值即為供試品的折光率。

測定前，折光計讀數應使用校正用棱鏡或水進行校正，水的折光率20℃時為1.3330, 25℃時為1.3325,40℃時為1.3305。

四、pH值測定法

pH值是水溶液中氫離子活度的方便表示方法。pH值定義為水溶液中氫離子活度的負對數，即pH=-lgα+。但氫離子活度卻難以由實驗準確測定。為實用方便，溶液的pH值規定為由下式測定：

式中：E——含有待側溶液（pH）的原電池電動勢，V；

ES——含有標準緩沖液（pH S）的原電池電動勢，V；

k——與溫度（t, ℃）有關的常數。

k=0.05916+0.000198（t-25）

由于待測物的電離常數、介質的介電常數和液接界電位等諸多因素均可影響pH值的準確測量，所以實驗測得的數值只是溶液的表觀pH值，它不能作為溶液氫離子活度的嚴格表征。盡管如此，只要待測溶液與標準緩沖液的組成足夠接近，由上式測得的pH值與溶液的真實pH值還是頗為接近的。

溶液的pH值使用酸度計測定。水溶液的pH值通常以玻璃電極為指示電極、飽和甘汞電極為參比電極進行測定。酸度計應定期進行計量檢定，并符合國家有關規定。測定前，應采用下列標準緩沖誰校正儀器，也可用國家標準物質管理部門發放的標示pH值準確至0.01pH單位的各種標準緩沖液校正儀器。

（一）儀器校正用的標準緩沖液

1．草酸鹽標準緩沖液

精密稱取在（54±3）℃干燥4～5h的草酸三氫鉀12.71g，加水使溶解并稀釋至1000mL。

2．苯二甲酸鹽標準緩沖液

精密稱取在（115±5）℃干燥2～3h的鄰苯二甲酸氫鉀10.21g，加水使溶解并稀釋至1000mL。

3．磷酸鹽標準緩沖液

精密稱取在（115±5）℃干燥2～3小時的無水磷酸氫二鈉3.55g與磷酸二氫鉀173.40g，加水使溶解并稀釋至1000mL。

4．硼砂標準緩沖液

精密稱取硼砂3.81g（注意避免風化），加水使溶解并稀釋至1000mL，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空氣中二氧化碳進入。

5．氫氧化鈣標準緩沖液

于25℃，用無二氧化碳的水和過量氫氧化鈣經充分振搖制成飽和溶液，取上清液使用。因本緩沖液是25℃時的氫氧化鈣飽和溶液，所以臨用前需核對溶液的溫度是否在25℃，否則需調溫至25℃再經溶解平衡后，方可取上清液使用．存放時應防止空氣中二氧化碳進入。一旦出現渾濁，應棄去重配。

上述標準緩沖溶液必須用pH值基準試劑配制。不同溫度時各種標準緩沖液的pH值如下表（表2-1）。

（二）注意事項

測定pH值時，應嚴格按儀器的使用說明書操作，并注意下列事項。

（1）測定前，按各品種項下的規定，選擇兩種pH值約相差3個pH單位的標準緩沖液，并使供試品溶液的pH值處于兩者之間。

（2）取與供試品溶液pH值較接近的第一種標準緩沖液對儀器進行校正（定位），使儀器示值與表列數值一致。

（3）儀器定位后，再用第二種標準緩沖液核對儀器示值，誤差應不大于±0.02pH單位。若大于此偏差，則應小心調節斜率，使示值與第二種標準緩沖液的表列數值相符。重復上述定位與斜率調節操作，至儀器示值與標準緩沖液的規定數值相差不大于0.02pH單位。否則，需檢查儀器或更換電極后，再行校正至符合要求。

（4）每次更換標準緩沖液或供試品溶液前，應用純化水充分洗滌電極，然后將水吸盡，也可用所換的標準緩沖液或供試品溶液洗滌。

（5）在測定高pH值豹供試品和標準緩沖液時，應注意堿誤差的問題，必要時選用適當的玻璃電極測定。

（6）對弱緩沖液或無緩沖作用溶液的pH值測定，除另有規定外，先用苯二甲酸鹽標準緩沖掖校正儀器后測定供試品溶液，并重取供試品溶液再測，直至pH值的讀數在1分鐘內改變不超過±0.05止；然后再用硼砂標準緩沖液校正儀器，再如上法測定；兩次pH值的讀數相差應不超過0.1，取兩次讀數的平均值為其pH值。

（7）配制標準緩沖液與溶解供試品的水，應是新沸并放冷的純化水，其pH值應為5.5～7.0。

（8）標準緩沖液一般可保存2～3個月，但發現有渾濁、發霉或沉淀等現象時，不能繼續使用。

第二節 分光光度法

一、紫外-可見分光光度法

（一）儀器的校正和檢定

1．波長

由于環境因素對機械部分的影響，儀器的波長經常會略有變動、因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm,253.65nm,275.28nm,296.73nm,313.16nm,334.15nm,365.02nm, 404.66nm,435.83nm,546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nrn與656.10nm譜線進行校正；鈥玻璃在波長279.4nm,287.5nm,333.7nm,360.9nm, 418.5nm,460.0nm,484.5nm,536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化，使用時應注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho2O3）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm、278.10nm、287.18nm、333.44nm、345.47nm、361.31nm、416.28nm、451.30nm、485.29nm、536.64nm和640.52nm。

儀器波長的允許誤差為：紫外光區±1nm,500±2nm。

2．吸光度的準確度

可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mo1/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000mL，在規定的波長處測定并計算其吸收系數，并與規定的吸收系數比較，應符合表中的規定（表2-2）。

3．雜散光的檢查

可按下表所列的試劑盒濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規定的波長處測定透光率，應符合表中的規定（表2-3）。

（二）對溶劑的要求

含有雜原子的有機溶劑時，通常均均有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當溶劑不純時，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內不得超過0.40，在241～250nm范圍內不得超過0.20，在251～300nm范圍內不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。

（三）測定法

測定時，除另有規定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，或由儀器在規定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。除另有規定外，吸收峰波長應在該品種項下規定的波長±2nm以內，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸光度讀數，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的十分之一，否則測得的吸光度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增大為準。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數，或由儀器自動扣除空白讀數后再計算含量。

當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。

1．鑒別和檢查

分別按各品種項下規定的方法進行。

2．含量測定

一般有以下幾種方法。

（1）對照品比較法：按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品20溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的（100±10）%，所用溶劑也應完全一致，在規定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：

CX=（AX/AR）CR

式中：CX——供試品溶液的濃度；

AX——供試品溶液的吸光度；

CR——對照品溶液的濃度；

AR——對照品溶液的吸光度。

（2）吸收系數法：按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。

（3）計算分光光度法：計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

（4）比色法：供試品本身在紫外-可見光區沒有強吸收，或在紫外光區里有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當的顯色劑，使反應產物的最大吸收移至可見光區，這種測定方法稱為比色法。

用比色法測定時，由于顯色時影響顯色深淺的因素較多，應取供試品與對照品或標準品同時操作。除另有規定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理。在規定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度后，按上述（1）法計算供試品濃度。

當吸光度和濃度關系不呈良好線性時，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后測定各份溶液的吸光度，然后以吸光度與相應的濃度繪制標準曲線，再根據供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。

二、紅外分光光度法

（一）儀器及其校正

可使用傅里葉變換紅外光譜儀或色散型紅外分光光度計。用聚苯乙烯薄膜（厚度約為0.04mm）校正儀器，繪制其光譜圖，用3027cm-1,2851cm-1,1601cm-1,1028cm-1, 907cm-1處的吸收峰對儀器的波數進行校正。傅里葉變換紅外光譜儀在3000cm-1附近的波數誤差應不大于±5cm-1，在1000cm-1附近的波數誤差應不大于±1cm-1。

用聚苯乙烯薄膜校正時，儀器的分辨率要求在3110～2850cm-1范圍內應能清晰地分辨出7個峰，峰2851cm-1與谷2870cm-1之間的分辨深度不小于18%透光率，峰1583cm-1與谷1589cm-1之間的分辨深度不小于12%透光率。儀器的標稱分辨率，除另有規定外，應不低于2cm-1。

（二）供試品的制備及測定

1．原料藥鑒別

除另有規定外，應按照國家藥典委員會編訂的《藥品紅外光譜集》各卷收載的各光譜圖所規定的方法制備樣品。具體操作技術參見《藥品紅外光譜集》的說明。

采用固體制樣技術時，最常碰到的問題是多晶現象，固體樣品的晶型不同，其紅外光譜往往也會產生差異。當供試品的實測光譜與《藥品紅外光譜集》所收載的標準光譜不一致時，在排除各種可能影響光譜的外在或人為因素后，應按該藥品光譜圖中備注的方法或各品種項下規定的方法進行預處理，再繪制光譜，比對。如未規定該品種供藥用的晶型或預處理方法，則可使用對照品，并采用適當的溶劑對供試品與對照品在相同的條件下同時進行重結晶，然后依法繪制光譜，比對。如已規定特定的藥用晶型，則應采用相應晶型的對照品依法比對。

當采用固體制樣技術不能滿足鑒別需要時，可改用溶液法繪制光譜后比對。

2．制劑鑒別

品種鑒別項下應明確規定制劑的前處理方法，通常采用溶劑提取法。提取時應選擇適宜的溶劑，以盡可能減少輔料的干擾，并力求避免導致可能的晶型轉變。提取的樣品再經適當干燥后依法進行紅外光譜鑒別。

3．多組分原料藥鑒別

不能采用全光譜比對，可借鑒注意事項下“2（3）”的方法，選擇主要成分的若干個特征譜帶，用于組成相對穩定的多組分原料藥的鑒別。

4．晶型、異構體限度檢查或含量測定

供試品制備和具體測定方法均按各品種項下有關規定操作。

（三）注意事項

1．光譜集的規定

各品種項下規定“應與對照的圖譜（光譜集XX圖）一致”，系指《藥品紅外光譜集》各卷所載的圖譜。同一化合物的圖譜若在不同卷上均有收載時，則以后卷所載的圖譜為準。

2．比對光譜

藥物制劑經提取處理并依法繪制光譜，比對時應注意以下4種情況。

（1）輔料無干擾，待測成分的晶型不變化，此時可直接與原料藥的標準光譜進行比對。

（2）輔料無干擾，但待測成分的晶型有變化，此種情況可用對照品經同法處理后的光譜比對。

（3）待測成分的晶型不變化，而輔料存在不同程度的干擾，此時可參照原料藥的標準光譜，在指紋區內選擇3～5個不受輔料干擾的待測成分的特征譜帶作為鑒別的依據。鑒別時，實測譜帶的波數誤差應小于規定值的0.5%。

（4）待測成分的晶型有變化，輔料也存在干擾，此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。

3．影響因素

由于各種型號的儀器性能不同，供試品制備時研磨程度的差異或吸水程度不同等原因，均會影響光譜的形狀。因此，進行光譜比對時，應考慮各種因素可能造成的影響。

三、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法的測量對象是呈原子狀態的金屬元素和部分非金屬元素，系由待測元素燈發出的特征譜線通過供試品經原子化產生的原子蒸氣時，被蒸氣中待測元素的基態原子所吸收，通過測定輻射光強度減弱的程度，求出供試品中待測元素的含量。原子吸收分光光度法遵循分光光度法的吸收定律，一般通過比較對照品溶液和供試品溶液的吸光度，求得供試品中待測元素的含量。

（一）對儀器的一般要求

所用儀器為原子吸收分光光度計，由光源、原子化器、單色器和檢測系統等組成，另有背景校正系統、自動進樣系統等。

1．光源

常用待測元素作為陰極的空心陰極燈。

2．原子化器

主要有四種類型：火焰原子化器、石墨爐原子化器、氫化物發生原子化器及冷蒸氣發生原子化器。

（1）火焰原子化器：由霧化器及燃燒燈頭等主要部件組成。其功能是將供試品溶液霧化成氣溶膠后，再與燃氣混合，進入燃燒燈頭產生的火焰中，以干燥、蒸發、離解供試晶，使待測元素形成基態原子。燃燒火焰由不同種類的氣體混合物產生，常用乙炔-空氣火焰。改變燃氣和助燃氣的種類及比例可以控制火焰的溫度，以獲得較好的火焰穩定性和測定靈敏度。

（2）石墨爐原子化器：由電熱石墨爐及電源等部件組成。其功能是將供試品溶液干燥、灰化，再經高溫原子化使待測元素形成基態原子。一般以石墨作為發熱體，爐中通入保護氣，以防氧化并能輸送試樣蒸氣。

（3）氫化物發生原子化器：由氫化物發生器和原子吸收池組成，可用于砷、鍺、鉛、錫、硒、錫、銻等元素的測定。其功能是將待測元素在酸性介質中還原成低沸點、易受熱分解的氫化物，再由載氣導入由石英管、加熱器等組成的原子吸收池，在吸收池中氫化物被加熱分解，并形成基態原子。

（4）冷蒸氣發生原子化器：由汞蒸氣發生器和原子吸收池組成，專門用于汞的測定。其功能是將供試品溶液中的汞離子還原成游離汞，再由載氣將汞蒸氣導入石英原子吸收池，進行測定。

3．單色器

其功能是從光源發射的電磁輻射中分離出所需要的電磁輻射，儀器光路應能保證有良好的光譜分辨率和在相當窄的光譜帶（0.2nm）下正常工作的能力，波長范圍一般為190.0～900.0nm。

4．檢測系統

由檢測器、信號處理器和指示記錄器組成，應具有較高的靈敏度和較好的穩定性，并能及時跟蹤吸收信號的急速變化。

5．背景校正系統

背景干擾是原子吸收測定中的常見現象。背景吸收通常來源于樣品中的共存組分及其在原子化過程中形成的次生分子或原子的熱發射、光吸收和光散射等。這些干擾在儀器設計時應設法予以克服。常用的背景校正法有連續光源（在紫外光區通常用氘燈）、塞曼效應、自吸效應等。

在原子吸收分光光度分析中，必須注意背景以及其他原因引起的對測定的干擾。儀器某些工作條件（如波長、狹縫、原子化條件等）的變化可影響靈敏度、穩定程度和干擾情況。在火焰法原子吸收測定中可采用選擇適宜的測定譜線和狹縫、改變火焰溫度、加入絡合劑或釋放劑、采用標準加入法等方法消除干擾；在石墨爐原子吸收測定中可采用選擇適宜的背景校正系統、加入適宜的基體改進劑等方法消除干擾。具體方法應按各品種項下的規定選用。

（二）測定法

（1）第一法（標準曲線法）：在儀器推薦的濃度范圍內，制備含待測元素的對照品溶液至少3份，濃度依次遞增，并分別加入各品種項下制備供試品溶液的相應試劑，同時以相應試劑制備空白對照溶液。將儀器按規定啟動后，依次測定空白對照溶液和各濃度對照品溶液的吸光度，記錄讀數。以每一濃度3次吸光度讀數的平均值為縱坐標、相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線。按各品種項下的規定制備供試品溶液，使待測元素的估計濃度在標準曲線濃度范圍內，測定吸光度，取3次讀數的平均值，從標準曲線上查得相應的濃度，計算元素的含量。

（2）第二法（標準加入法）：取同體積按各品種項下規定制備的供試品溶液4份，分別置4個同體積的量瓶中，除（1）號量瓶外，其他量瓶分別精密加入不同濃度的待測元素對照品溶液，分別用去離子水稀釋至刻度，制成從零開始遞增的一系列溶液。按上述標準曲線法自“將儀器按規定啟動后”操作，測定吸光度，記錄讀數；將吸光度讀數與相應的待測元素加入量作圖，延長此直線至與含量軸的延長線相交，此交點與原點間的距離即相當于供試品溶液取用量中待測元素的含量。再以此計算供試品中待測元素的含量。此法僅適用于第一法標準曲線呈線性并通過原點的情況。

當用于雜質限度檢查時，取供試品，按各品種項下的規定，制備供試品溶液；另取等量的供試品，加入限度量的待測元素溶液，制成對照品溶液。照上述標準曲線法操作，設對照品溶液的讀數為a，供試品溶液的讀數為b, b值應小于（a-b）。

第三節 色譜法

一、紙色譜法

紙色譜法系以紙為載體，以紙上所含水分或其他物質為固定相，用展開劑進行展開的分配色譜。供試品經展開后，可用比移值（Rf）表示其各組成成分的位置（比移值=原點中心至斑點中心的距離/原點中心至展開劑前沿的距離）。由于影響比移值的因素較多，因而一般采用在相同實驗條件下與對照物質對比以確定其異同。用作藥品鑒別時，供試品在色譜圖中所顯主斑點的位置與顏色（或熒光），應與對照品在色譜圖中所顯主斑點相同。用作藥品純度檢查時，可取一定量的供試品，經展開后，按各品種項下的規定，檢視其所顯雜質斑點的個數或呈色深度（或熒光強度），進行藥品含量測定時，將色譜主斑點剪下經洗脫后，再用適宜的方法測定。

（一）儀器與材料

（1）展開容器：通常為屬形或長方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃蓋，應能密閉，用于下行法時，蓋上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展開劑。在近頂端有一用支架架起的玻璃槽作為展開劑的容器，槽內有一玻棒，用以壓住色譜濾紙；槽的兩側各支一玻棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂。用于上行法時，在蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點樣后的色譜濾紙掛在鉤上；并除去溶劑槽和支架。

（2）點樣器：常用具支架的微量注射器或定量毛細管，應能使點樣位置正確、集中。

（3）色譜濾紙：應質地均勻平整，具有一定機械強度，不含影響展開效果的雜質；也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，必要時可進行處理后再用。用于下行法時，取色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜濾紙上端能足夠浸入溶劑槽內的展開劑中，并使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數厘米處）用鉛筆劃一點樣基線，必要時，可在色譜濾紙下端切成鋸齒形便于展開劑滴下。用于上行法時，色譜磅紙長約25cm，寬度則按需要而定，必要時可將色譜濾紙卷成筒形；點樣基線距底邊約2.5cm。

（二）操作方法

（1）下行法：將供試品溶解于適宜的溶劑中制成一定濃度的溶液。用定量毛細管或微量注射器吸取濃液，點于點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加后，待其自然干燥、低溫烘干或經溫熱氣流吹干，樣點直徑為2～4mm，點間距離為1.5～2.0cm，樣點通常應為圓形。

將點樣后的色譜濾紙的點樣端放在溶劑槽內并用玻棒壓住，使色譜濾紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數厘米處。展開前，展開缸內用各品種項下規定的溶劑的蒸氣使之飽和，一般可在展開缸底部放一裝有規定溶劑的平皿或將被規定溶劑潤濕的濾紙條附著在展開缸內壁上，放置一定時間，俊溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然后小心添加展開劑至溶劑槽內，使色譜濾紙的上端浸沒在槽內的展開劑中。展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙移動進行展開，展開至規定的距離后，取出色譜濾紙，標明展開劑前沿位置，待展開劑揮散后按規定方法檢測色譜斑點。

（2）上行法：點樣方法同下行法。展開缸內加入展開劑適量，放置待展開劑蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入展開劑約0.5cm，展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規定外，一般展開至約15cm后，取出晾干，按規定方法檢視。

展開可以單向展開，即向一個方向進行；也可進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，待展開劑完全揮發后，將濾紙轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開、連續展開或徑向展開等。

二、薄層色譜法

薄層色譜法系將供試品溶液點樣于薄層板上，經展開、檢視后所得的色譜圖，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用于藥品的鑒別或雜質檢查的方法。

（一）儀器與材料

1．薄層板

（1）自制薄層板：除另有規定外，玻璃板要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H和硅膠HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小，一般要求粒徑為5～40μm。

薄層涂布，一般可分為無黏合劑和含黏合劑兩種。前者系將固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加人一定量的黏合劑，一般常用10%～15%煅石膏（CaSO4· 2H2O在140℃加熱4h），混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.2%～0.5%）調成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。使用涂布器涂布應能使固定相在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。

（2）市售薄層板：市售薄層板分普通薄層板和高效薄層板，如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜和鋁基片薄層板等。高效薄層板的粒徑一般為5～7μm。

2．點樣器

同紙色譜法項下。

3．展開容器

應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴密的蓋子，底部應平整光滑，或有雙槽。

4．顯色劑

見各品種項下的規定。可采用噴霧顯色、浸漬顯色或置適宜試劑的蒸氣中熏蒸顯色，用以檢出斑點。

5．顯色裝置

噴霧顯色要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器皿或用適宜的玻璃缸代替；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽玻璃缸或適宜大小的干燥器代替。

6．檢視裝置

為裝有可見光、短波紫外光（254nm）、長波紫外光（365nm）光源及相應濾片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝色譜用，暗箱內光源應有足夠的光照度。

（二）操作方法

（1）薄層板制備：自制薄層板除另有規定外，將1份固定相和3份水在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平穩地移動涂布器進行涂布（厚度為0.2～0.3mm），取下涂好薄層的玻璃板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃活化30min，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。

市售薄層板臨用前一般應在110℃活化30min。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁，但須注意剪裁后的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在貯放期間被空氣中雜質污染，使用前可用適宜的溶劑在展開容器中上行展開預洗，110℃活化后，置干燥器中備用。

（2）點樣：除另有規定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑為2～4mm薄層板為1～2mm）間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜，一般為1.0～2.0cm（高效薄層板可不小于5mm）。點樣時必須注意勿損傷薄層板表面。

（3）展開：展開缸如需預先用展開劑飽和，可在缸中加入足夠量的展開劑，必要時在壁上貼兩條與缸一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封頂蓋，使系統平衡或按各品種項下的規定操作。

將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封頂蓋，待展開至適宜的展距（如：20cm的薄層板，展距一般為10～15cm;10cm層板，展距一般為5cm取出薄層板，晾干，按各品種項下的規定檢測。

展開可以單向展開，即向一個方向進行；也可以進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，待展開劑完全揮發后，將薄層板轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開。

（4）顯色與檢視：熒光薄層板可用熒光猝滅法；普通薄層板，有色物質可直接檢視，無色物質可用物理或化學方法檢視。物理方法是檢出斑點的熒光顏色及強度；化學方法一般用化學試劑顯色后，立即覆蓋同樣大小的玻璃板，檢視。

（三）系統適用性試驗

按各品種項下要求對檢測方法進行系統適用性試驗，使斑點的檢測靈敏度、比移值和分離效能符合規定。

（1）檢測靈敏度：系指雜質檢查時，供試品溶液中被測物質能被檢出的最低量。一般采用對照溶液稀釋若干倍的溶液與供試品溶液和對照溶液在規定的色譜條件下，在同一塊薄層板上點樣、展開、檢視，前者應顯示清晰的斑點。

（2）比移值（Rf）：系指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。鑒別時，可用供試品溶液主斑點與對照品溶液主斑點的比移值進行比較，或用比移值來說明主斑點或雜質斑點的位置。

除另有規定外，比移值（Rf）應在0.2～0.8之間。

（3）分離效能：鑒別時，在對照品與結構相似藥物的對照品制成混合對照溶液的色譜圖中，應顯示兩個清晰分離的斑點。雜質檢查的方法選擇時，可將雜質對照品用供試品自身稀釋對照溶液溶解制成混合對照溶液，也可將雜質對照品用待測組分的對照品溶液溶解制成混合對照溶液，還可采用供試品以適當的降解方法獲得的溶液，上述溶液點樣展開后的色譜圖中，應顯示兩個清晰分離的斑點。

（四）測定法

（1）鑒別：可采用與同濃度的對照品溶液，在同一塊薄層板上點樣、展開與檢視，供試27品溶液所顯主斑點的顏色（或熒光）與位置（Rf）應與對照品溶液的主斑點一致，而且主斑點的大小與顏色的深淺也應大致相同。或采用供試品溶液與對照品溶液等體積混合，應顯示單一、緊密的斑點；或選用與供試品化學結構相似的藥物對照品與供試品溶液的主斑點比較，兩者Rf應不同，或將上述兩種溶液等體積混合，應顯示兩個清晰分離的斑點。

（2）雜質檢查：可采用雜質對照品法、供試品溶液的自身稀釋對照法，或兩法并用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點應與相應的雜質對照品溶液或系列濃度雜質對照品溶液的相應主斑點比較，或與供試品溶液的自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應主斑點比較，不得更深。

通常應規定雜質的斑點數和單一雜質量，當采用系列自身稀釋對照溶液時，也可規定估計的雜質總量。

三、柱色譜法

（一）吸附柱色譜

色譜柱為內徑均勻、下端（帶或不帶活塞）縮口的硬質玻璃管，端口或活塞上部鋪墊適量棉花或玻璃纖維，管內裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應盡可能大小均勻，以保證良好的分離效果．除另有規定外，通常采用直徑為0.07～0.15mm的顆粒。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均按各品種項下的規定。

1．吸附劑的填裝

（1）干法：將吸附劑一次加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入洗脫劑；若色譜柱本身不帶活塞，可在色譜柱下端出口處連接活塞，加入適量的洗脫劑，旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內形成松緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。

（2）濕法：將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然后加入洗脫劑將附著在管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。

等填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，至液面和柱表面相平時，即加供試品溶液。

2．供試品的加入

除另有規定外，將供試品溶于開始洗脫時使用的洗脫劑中，再沿管壁緩緩加入，注意勿使吸附劑翻起。或將供試品溶于適當的溶劑中，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發去盡使呈松散狀，加在已制備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶，可將供試品與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。

3．洗脫

除另有規定外，通常按洗脫劑洗脫能力大小遞增變換洗脫劑的品種和比例，分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變洗脫劑的品種和比例。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。

（二）分配柱色譜

方法和吸附柱色譜基本一致。裝柱前，先將固定液溶于適當溶劑中，加入適宜載體，混合均勻，待溶劑完全揮干后分次移入色譜柱中并用帶有平面的玻棒壓緊；供試品可溶于固定液，混以少量載體，加在預制好的色譜柱上端。

洗脫劑需先加固定液混合使之飽和，以避免洗脫過程中固定液的流失。

四、高效液相色譜法

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

（一）對儀器的一般要求和色譜條件

所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規定。

1．色譜柱

反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。

除另有規定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。

使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果為準。

以硅膠為載體的鍵合固定相的便用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。

流動相的pH值應控制在2～8之間。當pH值大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑等。

（2）檢測器：最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。

紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。

紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。

不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外-可見分光光度法項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。

（3）流動相：反相色譜系統的流動相首選甲醇-水系統（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。

各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并達到系統適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對于自身的改變量不超過±30%且相對于總量的改變量不超過±10%為限，如30%相對改變量的數值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%為限。

對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。

（二）系統適用性試驗

色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等4個參數。其中，分離度和重復性尤為重要。

按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。

（1）色譜柱的理論板數（n）用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數。

在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計）和峰寬（W）或半高峰寬（W h/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數。

（2）分離度（R）：用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度、也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當前方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度舉對色譜系統進行評價與控制。

無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：

式中：——相鄰兩峰中后一峰的保留時間；

——相鄰兩峰中前一峰的保留時間；

W1、W2及W1, h/2、W2, h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬，及半高峰寬。

當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。

（3）重復性：用于評價連續進樣中，色譜系統響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%；采用內標法時，通常配制相當于80%,100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大于2.0%。

（4）拖尾因子（T）：用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式為：

式中：W0.05h——5%峰高處的峰寬；

d1——峰頂點至峰前沿之間的距離。

除另有規空外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。

峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。

（三）測定法

（1）內標法：按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子側定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：

式中：AS——內標物質的峰面積或峰高；

AR——對照品的峰面積或峰高；

cS——內標物質的濃度；

cR——對照品的濃度。

再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：

式中：AX——供試品的峰面積或峰高；

cX——供試品的濃度；

——內標物質的峰面積或峰高；

——內標物質的濃度；

f——校正因子。

采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

（2）外標法：按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：

式中各符號意義同前。

由于微量注射器不易精確控制進樣量，當來用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。

（3）加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述內標法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。

測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%～25%或其峰面積能準確積分〔通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%；含量在0.5%～2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%〕。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。

（4）不加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述加校正因子的主成分自身對照法配制對照溶液并調節檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。

若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜32圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。

（5）面積歸一化法：按各品種項下的規定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。

用于雜質檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。

五、氣相色譜法

氣相色譜法系采用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法，物質或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，用數據處理系統記錄色譜信號。

（一）對儀器的一般要求

所用的儀器為氣相色譜儀，由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應根據分析要求適當設定。

（1）載氣源：氣相色譜法的流動相為氣體，稱為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以一定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，除另有規定外，常用載氣為氮氣。

（2）進樣部分：進樣方式一般可采用溶液直接進樣、自動進樣或頂空進樣。

溶液直接進樣采用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；采用溶液直接進樣或自動進樣時，進樣口溫度應高于柱溫30～50℃；進樣量一般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少，采用毛細管柱時，一般應分流以免過載。

頂空進樣適用于固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品制成供試液后，置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡后，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。

（3）色譜柱：色譜柱為填充柱或毛細管柱。填充柱的材質為不銹鋼或玻璃，內徑為2～4mm，柱長為2～4m，內裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體，粒徑為0.18～0.25mm,0.15～0.18mm或0.125～0.15mm。常用載體為經酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質為玻璃或石英，內壁或載體經涂潰或交聯固定液，內徑一般為0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱長5～60m，固定液膜厚0.1～5.0μm，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理，以除去殘留溶劑及易流失的物質，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。

（4）柱溫箱：由于柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在±1℃，且溫度波動小于每小時0.1℃。溫度控制系統分為恒溫和程序升溫兩種。

（5）檢測器：適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）、熱導檢測器（TCD）、氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）、電子捕獲檢測器（ECD）、質譜檢測器（MS）等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的藥物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適于含鹵素的化合物；質譜檢測器還能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用于結構確證。除另有規定外，一般用火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃氣，空氣作為助燃氣。在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高于柱溫，并不得低于150℃，以免水汽凝結，通常為250～350℃。

（6）數據處理系統：可分為記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。

各品種項下規定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體牌號、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種并符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約于30min內記錄完畢。

（二）系統適用性試驗

除另有規定外，應照高效液相色譜法項下的規定。

（三）測定法

（1）內標法。

（2）外標法。

（3）面積歸一化法：上述3種方法的具體內容均同高效液相色譜法項下相應的規定。

（4）標準溶液加入法：精密稱（量）取某個雜質或待測成分對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中某個雜質和主成分含量。

也可按下述公式進行計算，加入對照品溶液前后校正因子應相同，即：

則待測組分的濃度cX可通過如下公式進行計算：

式中：cX——供試品中組分X的濃度；

AX——供試品中組分X的色譜峰面積；

ΔcX——所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度；

Ais——加入對照品后組分X的色譜峰面積。

由于氣相色譜法的進樣量一般僅數微升，為減小進樣誤差，尤其當采用手工進樣時，由于留針時間和室溫等對進樣量也有影響，故以采用內標法定量為宜；當采用自動進樣器時，由于進樣重復性的提高，在保證分析誤差的前提下，也可采用外標法定量。當采用頂空進樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質中，故可采用標準溶液加入法以消除基質效應的影響，當標準溶液加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標準加入法結果為準。

思考題

1．什么是比旋度？

2．折光率測定前，折光計讀數應用什么進行校正？水的折光率20℃時為多少？

3．請簡述吸收系數的物理意義。

4．請簡述紫外-可見分光光度法在藥物分析中的應用。

5．請簡述高效液相色譜法測定藥物含量時的方法。