第三節　人乳頭狀瘤病毒與口咽癌

一、流行病學

人乳頭狀瘤病毒（HPV）是乳頭狀瘤病毒屬、小型環狀閉合雙鏈DNA病毒。由DNA核酸和衣殼蛋白組成，基因組長度約7 900bp，由72個殼粒組成正二十面體衣殼，無包膜，直徑45～55nm。HPV-DNA基因組根據功能分為3個區域：早期區（E）、晚期區（L）以及上游調控區域（upstream regulatory region，URR）。早期序列包括E1、E2、E4～E7亞區，部分類型包括E3和E8，與病毒的復制及致癌作用相關。晚期序列包括L1/L2，主要編碼L1及L2病毒衣殼蛋白，參與病毒基因組的包裝和病毒釋放。非編碼區即上游調控區，URR長度約400～1 000bp，位于E區與L區之間，該序列包含p97核心啟動子及其他通過控制開放閱讀區轉錄，進而調控病毒DNA復制的增強子及沉默子，是病毒基因組中變異度最高的部分，對病毒和宿主細胞基因轉錄起重要作用。圖2-3-1以HPV-16型為例，概述了每個序列的主要功能。

HPV主要通過接觸感染部位或污染的物品進行傳播，如口交等性行為、生活中密切接觸或母嬰傳播等途徑。HPV具有高度的嗜組織性，可特異性侵犯人類皮膚和黏膜組織中的基底角質形成細胞。1983年，Syrj?nen等首次描述了HPV感染與頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）之間的相關性。后來，德國科學家哈拉爾德·楚爾·豪森（Harald zur Hausen）因明確了HPV感染引發宮頸癌而于2008年獲諾貝爾醫學獎。在過去的幾十年里，從流行病學、臨床病理及生物分子研究中積累的證據已表明，發生于口腔、口咽、下咽及喉部等多種部位的HNSCC中存在HPV感染，HPV是影響HNSCC發生發展的重要危險因素之一。大多數HPV相關性HNSCC發生于口咽部，尤其好發于舌根及扁桃體，特別是那些發源于扁桃體隱窩上皮的口咽癌，顯示具有最高的HPV可歸因部分。HPV相關性口咽癌占所有口咽癌病例總數的25%～30%，然而只有小部分口腔癌是由HPV所引發（3%）。

至今已鑒定出100多種HPV亞型，根據其驅動惡性轉化的能力，將其分為高危型與低危型。目前，在口咽癌中發現的亞型主要有 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59等高危型以及 HPV6、HPV11、HPV32、HPV44、HPV53、HPV57、HPV81等低危型的存在。HPV16、HPV18是引發口咽癌最常見的HPV亞型，其中HPV陽性口咽癌中HPV16高危基因型占絕大多數（90%～95%），HPV18次之（約3%）。高危基因型HPV DNA的流行率因地理區域而異。對于口咽癌，北美地區高危型HPV流行率最高（約60%），亞洲、大洋洲和歐洲地區流行率中等（約36%～45%），南美洲和中美洲流行率較低（約15%）。不同的是，對于口腔癌，高危型HPV DNA流行率在亞洲地區最高（HPV16型約占25%）。

近年來，由吸煙、飲酒導致的口咽癌比例逐年下降，而HPV相關性口咽癌比例急劇上升，其上升趨勢在西方國家尤為顯著。全球每年約有38 000例新發口咽癌病例，其中HPV相關性口咽癌約29 000例，且在北美、歐洲、澳大利亞、新西蘭和日本等發達國家和地區發病率較高。在世界范圍內，口咽癌中HPV可歸因比例從1990—1994年的7.2%上升至2010—2012年的32.7%。在美國，20世紀80年代初期，HPV感染約占口咽癌病例的16%，而最近的研究表明其占據比例已大于60%。與北美地區相比，歐洲地區HPV陽性口咽癌比例急劇上升，速度也更快。2000年以前兩者間患病率存在的顯著差距已消失，且歐洲地區口咽癌HPV可歸因比例略大于北美地區（分別為73.1%、69.7%）。瑞典斯德哥爾摩的一項回顧性隊列研究指出，使用相同的檢測手段所確定的口咽癌中HPV陽性病例占據比例在1970—2007年由23.3%上升至93%。我國的學者也對中國各地區口咽癌患者HPV可歸因比例進行了探究，各地區口咽癌HPV檢出率在5%～50%不等。Guo等人基于中國人群HPV16感染率與HNSCC相關性的Meta分析研究顯示，我國HNSCC病例中HPV16感染病例占比約為24.7%，其中口咽癌病例HPV16可歸因比例約為31.6%。

HPV陽性口咽癌發病率逐年上升趨勢被認為可能與人們性習慣的改變相關。Gillison等人及Dahlstrom等人發現HPV陽性口咽癌與早期性行為，以及終身性伴侶或口交性伴侶數量的增加密切相關。不同地區HPV陽性口咽癌患病率的差異可能與各地區性習慣和性開放程度不同有關。此外，HPV陽性口咽癌患者的臨床病理特征與HPV陰性口咽癌有所不同，這兩種類型均好發于男性，但是HPV陽性腫瘤的患病率在較為年輕（中年，如54～58歲）以及社會經濟地位較高的白人中較高，且HPV陽性口咽癌常伴頸部淋巴結轉移。在白人中，每10萬人中約有1.8名女性和9.4名男性被診斷出患有與HPV相關的口咽癌。此外，與HPV陰性口咽癌相比，HPV陽性病例更好發于吸食大麻的個體，而過量吸煙及酗酒個體患病率較低。然而，最近的各項研究表明，47%～71%的HPV陽性口咽癌患者具有吸煙史。此外，61%～75%的HPV陽性口咽癌患者具有飲酒史。因此，需要更多的研究來明確口咽癌風險因素HPV、煙草和酒精之間的相互作用。

目前，尚不完全清楚為什么HPV相關性HNSCC好發于口咽部。實際上，在HPV相關性口咽癌最常發生位點的扁桃體非惡性組織樣本相關研究中，部分研究未能檢測到HPV的存在，部分研究則僅發現相當低的HPV感染率。傳統上，研究人員認為HPV感染是由于微創傷后基底上皮細胞暴露于病毒而造成的。口咽部的組織結構類似于子宮頸和肛門部位，表現為鱗狀柱狀上皮移行帶。因此，移行區內化生基底/儲備細胞（metaplastic basal/ reserve cells）的可達性可以解釋這些部位對致癌性HPV的易感性。另一種觀點則認為口咽癌特異傾向發生于舌根及扁桃體部位可能與以下情況有關：①扁桃體隱窩的深入凹陷性結構可能作為HPV和其他病原體的天然儲藏區；②這些部位組織學表現為網狀的上皮細胞層（reticulated epithelium）及不連續的基底膜使其屏障作用減弱，HPV更易侵入；③此淋巴組織深層陷窩結構代表免疫豁免部位（immune-privileged sites），即有利于HPV持續性感染并允許腫瘤逃避免疫監視。

二、致病機制

HPV病毒不能編碼DNA聚合酶，故HPV基因組以游離狀態存在。機體受高危型HPV持續感染，免疫系統無法完全清除HPV病毒，以致HPV病毒將自身DNA整合到宿主細胞基因組中，遺傳或表觀遺傳改變的積累和HPV的整合是癌變轉化和腫瘤進展中的重要事件。HNSCC的全基因組序列研究顯示，HPV整合通過促進致癌基因的表達、破壞腫瘤抑制基因以及驅動染色體間/內重排影響宿主基因組。此外，HPV整合及未整合到宿主細胞基因組時，腫瘤組織的相應基因表達譜和DNA甲基化模式具有差異。HPV整合可能在宿主細胞基因組不穩定性中發揮作用，從而影響HPV相關性口咽癌的預后。Vojtechova等人及Lim等人的研究報道，HPV相關性口咽癌中HPV基因組DNA主要表現為整合型或者游離型和整合型共存，這兩類患者間的生存率無顯著差異。因此，在綜合技術評價研究取得進展的基礎上，尚需進一步研究以明確HPV基因組整合對口咽癌患者預后的影響。

支持HPV驅動口咽癌發生的分子生物學證據如下：①90%的HPV陽性口咽癌病例為高危型、致瘤性HPV16型感染；②原位雜交實驗表明HPV16定位于腫瘤細胞核；③HPV陽性腫瘤細胞核中HPV16 DNA具有高拷貝數；④HPV16基因組DNA經常被整合到HPV陽性腫瘤細胞中，且其主要病毒致癌性mRNA E6和E7具有轉錄活性。此外，分子遺傳譜的差異支持HPV相關性口咽癌與煙草和酒精相關性口咽癌在分子生物學特征上的不同。HPV陰性口咽癌發生的早期階段，可檢測到染色體9p、3p和17p存在基因缺失，特別是分別位于17p13和9p21區域的腫瘤抑制基因腫瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）（編碼p53蛋白）和細胞周期依賴性激酶抑制劑2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）（編碼p16蛋白）的缺失。因此，頻繁的p53和p16突變導致細胞周期調節異常和基因組失穩。相比之下，HPV相關性口咽癌往往缺乏這類染色體基因的缺失，而表現為野生型p53表達減少以及p16上調。

盡管HPV病毒致癌的分子機制并未最終明確，但現有研究支持病毒E6和E7蛋白在致癌過程中發揮重要作用。HPV有3個基因功能區：早期區、晚期區和上游調控區，其中早期區編碼早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，參與調節病毒的生命周期、調控DNA復制、轉錄和病毒蛋白的翻譯等。HPV病毒致癌蛋白E6和E7分別約有160及100個氨基酸，可以通過其特異的結構與其他抑癌因子競爭性結合使其抑癌作用失活，因此E6和E7的持續表達是促進及維持口咽癌發生發展所必需的。E6蛋白可以通過其鋅指結構與泛素連接酶形成復合物泛素蛋白酶E6-AP，促進p53泛素化和蛋白酶體降解，致其失活，但是p53的mRNA水平并無明顯改變。E6蛋白可結合p53蛋白的C端，阻止p53進入細胞核，使其無法發揮抑癌基因的作用，從而引起宿主細胞增殖過程中基因組失穩和DNA突變累積，最終抑制p53依賴性細胞周期阻滯，促使細胞從細胞周期G1期向S期轉化，促進細胞異常分裂增殖，抑制細胞凋亡，使細胞永生化。此外，E6還可激活細胞端粒酶活性，使細胞端粒長度不隨細胞分裂增殖而縮短，使細胞實現無限增殖而發生惡性轉化。E7蛋白可結合低磷酸化狀態的視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb），致其功能喪失導致E2F釋放，促進細胞S期DNA合成，從而促進細胞周期進展和惡性轉化，并支持病毒的復制。pRb功能失活導致p16^INK4a蛋白表達代償性增加，使上皮細胞逃脫致癌基因誘導的衰老，并激活其生存信號通路。在HPV相關腫瘤中，p16^INK4a過表達對細胞存活至關重要。而在HPV非相關腫瘤中，它經常失活，這使得p16^INK4a過表達成為口咽癌發生中HPV具有轉錄活性的間接標記物。對于低危型HPV，其E6蛋白并不影響宿主細胞p53蛋白的穩定性，且其E7蛋白與pRb的結合效率較低。E5蛋白不一定表達，但當它表達時則可對表皮生長因子受體（EGFR）、免疫識別和凋亡調節等多種信號通路產生影響。其他早期區蛋白（E1、E2和E4）對完成病毒復制周期至關重要，但它們的活性在促進癌變中并不重要。圖2-3-2總結了高危型HPV主要的致癌分子機制。

三、人乳頭狀瘤病毒疫苗

由于HPV相關性口咽癌好發于扁桃體組織深部隱窩上皮，病灶隱蔽，難以通過早期篩查進行干預，因此為人群接種HPV疫苗預防感染進而防止腫瘤的發生顯得尤為重要。目前市場上有三種HPV疫苗用于預防感染，主要針對未感染人群，對已感染者無治療效果。2006年，第一種針對高危亞型HPV16、HPV18及低危亞型HPV6、HPV11的四價疫苗（Gardasil）獲得了FDA的批準，第二種針對HPV16、HPV18的二價疫苗（Cervarix）于2007年得到驗證。2014年，九價HPV疫苗（Gardasil 9）（抗HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6和HPV11）在美國獲批上市，并在2018年4月28日獲中國國家藥品監督管理局批準于我國上市。2009年，世界衛生組織建議對9～13歲女性進行常規HPV疫苗接種，2011年，建議接種年齡范圍擴展至26歲。2018年，FDA批準Gardasil九價HPV疫苗接種年齡范圍擴大至45歲以下的男性及女性。目前，對女孩接種HPV疫苗正在進行中，有82個國家實施了針對女孩的國家性HPV免疫計劃，但是全球年輕女性的HPV疫苗接種率仍然很低，截至2017年全球9～45歲女性的HPV疫苗接種率僅為2%，且大多數國家尚未開始為男孩接種HPV疫苗，僅有約13個國家實施了對男孩的HPV疫苗接種計劃。HPV疫苗預防宮頸癌及其他相關的肛門-生殖器癌方面的有效性已被廣泛研究及證明，然而其用于預防口腔及口咽部HPV感染的有效性尚未被充分評估。Pinto等人的研究顯示，男性接種Gardasil四價疫苗可在口腔唾液樣本中檢測到HPV16及HPV18型IgG，且抗體表達水平與循環血液中的表達水平相關。Hirth等人的研究表明，年輕人（18～30歲）接種HPV疫苗（HPV6、HPV11、HPV16、HPV18型）后，與未接種的年輕人相比，其口腔具有較低的疫苗特異型HPV感染率，HPV疫苗接種似乎為一般人群中的男性和女性提供了特異型HPV感染的防護。預防性HPV疫苗接種可將口腔HPV感染的患病率降低88%～93%。考慮到HPV感染發病潛伏期長以及疫苗接種率低，預計接種HPV疫苗有望在2060年降低口咽癌的發病率，而當前HPV相關性口咽癌的發病率并不會立即改變。

（陶小安　程斌）