第三節　趨化因子在神經系統中的生物學作用

雖然神經元活動在神經系統發揮功能的過程中占據主導地位，但是越來越多的證據表明，膠質細胞在神經系統中也具有較重要的作用，神經元與膠質細胞之間的相互作用不僅是維系神經系統內環境穩態的重要因素，也是抵御外界應激、維護神經系統功能的核心機制。

一、趨化因子在神經元信息傳遞中的生物學作用

化學傳遞與電傳遞是神經元發揮信息傳遞功能的基本形式。其中化學傳遞的介質為神經遞質或調質。雖然趨化因子不具備神經遞質的典型特征，但早在2007年就有學者提出，趨化因子是一類新型的神經調質，參與神經系統功能的調控。趨化因子作為神經調質的特征表現如下。

1.趨化因子可在神經元內合成

如前所述，CCL2、CX3CL1、CCL3等趨化因子廣泛存在于神經系統內。經免疫學方法檢測發現CCL 2基因及蛋白均在神經元內被檢測到，其分布包括運動皮質，海馬齒狀回區、紋狀體、藍斑核、小腦等腦區，其受體CCR2分布于嗅球、下丘腦和小腦等腦區［18］。

2.趨化因子可與神經遞質共同存在于囊泡中

經原位雜交與透射電鏡觀察，發現在大鼠神經垂體的血管升壓素神經末梢的致密核神經囊泡中有CXCL12的分布。CCL2也存在神經元末梢的囊泡之中，表明趨化因子可能以與遞質相似的方式被釋放至細胞間隙。

3.趨化因子與神經遞質和神經調質可共存

在基底節膽堿能神經元和中腦黑質多巴胺神經元中，均發現有CCL2蛋白的存在。在下丘腦側葉包含黑色素凝集素神經元以及下丘腦室旁核的含血管升壓素的神經元中，也都發現了CCL2的表達。除此之外，在多巴胺神經元和膽堿能神經元中發現CXCL12的存在，表明趨化因子可與神經遞質共存。

4.趨化因子可從神經元釋放

越來越多的體內外試驗表明，趨化因子可從神經元釋放至細胞間隙，例如過表達CCL21的小鼠皮質神經元可快速激活小膠質細胞，其機制分析為過表達于神經元內的CCL21經釋放后，與小膠質細胞表面的CXCR3結合，誘導小膠質細胞激活。我們前期采用純化的海馬神經元經氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）造模后，在細胞培養基中檢測到了CKLF1的信號。上述研究結果均提示，趨化因子可從神經元中釋放出來，但其釋放機制仍須深入探討。

5.趨化因子的電生理學特性

已有研究表明，CCL2、CCL5、CXCL12可通過與CXCR2相結合，誘導神經細胞產生電生理學活動。在谷氨酸能神經元中，CXCL12可導致自發突觸活動后的緩慢的內向電流，這一作用與離子型谷氨酸受體的持續激活有關。在多巴胺能神經元中，CXCL12可促進突觸前膜γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸的釋放，這一現象依賴于分布在多巴胺神經元上的CXCR4。CCL2可通過與CCR2結合，調控N-電壓門控鈣通道對多巴胺釋放。采用全細胞膜片鉗技術發現，CCL2可誘導急性分離小鼠腦片海馬CA1區神經元（谷氨酸能神經元）的細胞膜去極化現象，提升興奮性突觸后電流，這一現象是依賴于CCL2對突觸前膜功能的調控而產生的。由此可見，趨化因子具有調控神經元電生理活動潛能。CCL3可顯著抑制海馬CA3-CA1區Schaffer谷氨酸能神經通路的基礎突觸傳遞效能，破壞長時程增強（long-term potentiation，LTP）現象，但對長時程抑制（long-term depression，LTD）并無顯著影響。經腦內注射CCL3可導致小鼠學習記憶能力的明顯損傷，從而在電生理與行為學兩個層面證明CCL3可對海馬神經元的突觸可塑性產生破壞作用。

6.趨化因子可通過自分泌形式發揮作用

趨化因子受體在突觸前膜與后膜均有分布。例如CXCL12與它的受體CXCR4在大鼠胚胎腦內高水平表達，成年后，在表達CXCL12的神經元表面仍有CXCR4的分布，特別是在皮質、黑質和下丘腦中。在黑質致密部的多巴胺能神經元中，CXCL12不僅可以調控多巴胺能神經元的放電頻率，也可以對多巴胺能神經元投射到的紋狀體區的多巴胺釋放進行調控。鑒于趨化因子與它的受體共同表達于相同的神經元，因此有學者提出趨化因子是通過自分泌作用于突觸前膜受體而發揮神經調控作用，這一作用模式與多巴胺十分相似。因為多巴胺的受體D1和D2也可以分布于突觸前和突觸后兩個不同部位，發揮不同的調控作用。血管升壓素可以通過自身分泌來調控α受體的表達，而α受體也是表達于血管升壓素的神經元表面，有研究也表明，CXCL13可以抑制血管升壓素的釋放，這一機制可能與它抑制突觸前cCScI4突觸活動相關。

7.趨化因子可通過旁分泌形式發揮作用

趨化因子受體可在膠質細胞表達。雖然部分趨化因子受體可表達于突觸前神經元，但更多的研究表明，CX3CL1和它的受體CX3CR1在小膠質細胞和神經元中表達。具有相似表達規律的還有CXCL10和它的受體CXCR3 在膽堿能神經元中的表達，CCL2可通過與分布在投射末端的CXCR1、CXCR2相互作用，發揮神經調控作用。上述研究均提示，趨化因子受體不僅可在神經元分布，而且可在膠質細胞表面分布，提示趨化因子對神經元-膠質細胞調控的重要作用。

二、趨化因子對神經元-膠質細胞相互作用的調控作用

膠質細胞在神經系統可分為小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞，如前所述，三種膠質細胞分工明確，共同與神經元組成神經網絡，完成信息的傳遞與整合。此過程中，眾多趨化因子參與其中，如CX3CL1、CXCL1、CCL17、CCL2等，其中CX3CL1/CX3CR1被認為是神經元-膠質細胞調控的核心趨化因子，參與神經系統穩態維持和多種神經系統疾病的病理過程。

1.趨化因子在神經元-星形膠質細胞相互作用中的生物學作用

星形膠質細胞對于神經系統可以發揮四方面的作用：①星形膠質細胞是構成血腦屏障的重要組成部分。眾所周知，血腦屏障是分割大腦與外界循環系統的重要屏障，星形膠質細胞通過與血管內皮細胞、周細胞的直接相互作用，構成維系腦內免疫豁免權的重要物理屏障。②星形膠質細胞可對腦血流量、腦脊液離子平衡以及神經遞質的穩態都具有重要的調控作用。③星形膠質細胞的突觸作為興奮性突觸結構的重要組成部分，可調控突觸傳遞效能，調控谷氨酸-谷氨酰胺循環，抑制興奮性氨基酸毒性的發生。④星形膠質細胞是調控神經元能量代謝的重要途徑，分布于星形膠質細胞內的谷氨酰胺轉移酶可為神經元合成谷氨酸提供重要的原料，維持神經元的正常功能［19］。

與免疫細胞相似，星形膠質細胞也可依據其功能狀態分為靜息態和激活態。當大腦受到急性攻擊或者慢性刺激時，星形膠質細胞可以由靜息態變為激活態，在形態學和功能上均發生顯著的變化，按照其功能又可分化為A1和A2型星形膠質細胞，A1型星形膠質細胞失去了它促進突觸形成的能力，吞噬功能受阻，并且可適當釋放細胞因子，導致神經元和少突膠質細胞的凋亡，對系統是有害的。A2型星形膠質細胞對神經系統的修復是有益的，該細胞可以釋放神經營養因子以及血小板反應蛋白，來促進突觸的修復。

前期研究表明，體外神經元-星形膠質細胞共培養拮抗谷氨酸毒性的能力顯著高于單獨培養神經元，這可能與星形膠質細胞表面分布的谷氨酸轉運體對谷氨酸的清除作用有關。然而，研究發現，將神經元-星形膠質細胞共培養的條件培養基也可拮抗谷氨酸的神經毒性，提示除了清除細胞外谷氨酸外，星形膠質細胞還可以通過其他形式發揮抗興奮性毒性的功效。經檢測，神經元-星形膠質細胞共培養誘導星形膠質細胞中CCL6表達可能是發揮這一作用的關鍵因子。在單獨培養的神經元與星形膠質細胞內，均未發現CCL6的表達。但是，在共培養體系的星形膠質細胞中和培養基中均發現CCL6的存在，但在神經元中無CCL6的表達。采用CCR1拮抗劑可阻斷神經元-星形膠質細胞共培養條件培養基的保護作用。在神經元培養基中共同加入CCL6和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑可阻斷CCL6的神經保護作用，提示CCL6可通過CCR1/PI3K信號通路拮抗谷氨酸神經毒性［20］。

腦卒中后神經元CCR5表達升高被認為是促進神經元修復、治療腦卒中的新型靶點，但其誘導表達機制尚未闡明。前期研究表明，神經元-星形膠質細胞相互作用可能是誘導CCR5表達的機制之一。研究人員發現，大鼠的星形膠質細胞-小膠質細胞共培養條件培養基可顯著促進體外培養神經元的成熟與分化。經分析發現，此條件培養基中富含CCL5、CCL2等趨化因子，進一步分析發現，這些趨化因子均源于星形膠質細胞分泌而得。研究表明趨化因子可顯著增加神經元CCR5和分化神經標志性蛋白含量。與野生型小鼠神經元相比，此條件培養基誘導CCR5基因敲除小鼠神經元的分化能力顯著降低，提示神經元分化過程中CCR5蛋白表達升高可能源于星形膠質細胞分泌的趨化因子，這對于解析腦卒中后CCR5表達誘導機制具有重要的提示作用［21］。

SMN1基因突變是導致運動神經元死亡的重要原因，也是導致脊髓性肌萎縮發病的遺傳背景。已有研究表明，特異性回復星形膠質細胞中SMN1基因可顯著改善小鼠脊髓性肌萎縮病情進展。機制研究發現SMN1突變的小鼠星形膠質細胞內CCL2的表達和分泌量都明顯降低，不能支持運動神經元軸突的正常生長。補充CCL2可顯著改善運動神經元的軸突生長情況，提示星形膠質細胞分泌的CCL2對于運動神經元的發育與修復具有重要的作用［22］。

趨化因子在疼痛的研究中越來越受到重視。已有研究表明CXCL1/CXCR2信號通路參與了癌性疼痛的調控過程。在骨癌疼痛模型中，研究人員發現骨癌疼痛可導致腹側中腦導水管周圍灰質NF-κB磷酸化、CXCL1和CXCR2三者水平升高，經與不同細胞標記物進行熒光共染后發現，升高的這些蛋白均位于膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性細胞內，即骨癌疼痛模型可導致星形膠質細胞中趨化因子水平升高。通過腦定位注射BAY11-7082（NF-κB抑制劑）可顯著緩解疼痛程度，降低CXCL1的含量。采用CXCL1的中和抗體腦定位注射后的第6～9日，大鼠的疼痛現象也顯著緩解。為深入觀察CXCL1在該模型中的作用，研究者將CXCL1直接注射至正常大鼠腹側中腦導水管灰質內，發現CXCL1的升高可導致痛覺超敏現象。受體研究發現，CXCL1的受體CXCR2僅在神經元中表達升高，阻斷CXCR2活性可完全阻斷CXCL1導致的痛覺超敏現象，緩解骨癌疼痛癥狀［23］。除此之外，來源于脊髓星形膠質細胞的CXCL12可通過神經元表面的CXCR4加重癌性疼痛，采用CXCL12或c-Jun 氨基端蛋白激酶（N-terminal kinase，JNK）選擇性抑制劑SP600125可改善疼痛表現，延緩疼痛發生時間［24］。

除星形膠質細胞-神經元的調控外，趨化因子也參與了神經元對星形膠質細胞病變的調控過程。在疼痛導致星形膠質細胞增殖的過程中，神經元分泌的CCL7發揮了重要作用。在脊髓損傷導致的疼痛模型中，脊髓神經元中的CCL7顯著增加。敲除CCL7可顯著緩解疼痛癥狀。體外研究發現，來源于神經元的CCL7可促進星形膠質細胞的激活和增殖［25］。上述研究提示，趨化因子信號通路在星形膠質細胞-神經細胞相互作用介導的痛覺調控中具有重要作用。

2.神經元-小膠質細胞相互作用

小膠質細胞占整個腦細胞數量的5%～12%，作為腦內固有的免疫細胞，小膠質細胞負責監控腦內環境的微妙變化，包括神經元活動、外界應激、病毒感染等。小膠質細胞表達大量的不同的神經遞質受體，它們的激活可影響小膠質細胞的功能，比如增殖、激活、細胞因子的合成與釋放以及吞噬功能等。另一方面，神經元也分布有許多可感知小膠質細胞釋放分子的受體，增強小膠質細胞對神經傳遞的保護作用。在神經發育期，小膠質細胞通過補體系統促進細胞的死亡，并負責清除凋亡的神經元以及膠質細胞，從而使神經結構達到一個完美的分化結構［26］。在成年腦中小膠質細胞可以促進神經發生，通過促進神經干細胞的增殖神經、營養因子的釋放以及神經球的遷移。已有研究證明靜息態的小膠質細胞可參與神經元的功能調控，例如突觸的修飾和成熟。當大腦受到攻擊時，小膠質細胞通過分化為促進炎癥反應的M1型或者抑制炎癥反應的M2型，對神經炎癥進行調控。參與神經元-小膠質細胞相互作用的趨化因子成員眾多，CX3CL1/CX3CR1信號通路是神經元-小膠質細胞相互作用的研究熱點，也是研究最充分的趨化因子信號通路。

CX3CL1是神經元特異性分泌的趨化因子，包含373個氨基酸殘基，以兩種形式存在于神經系統內，一種為分布于細胞膜上的CX3CL1，一種為可溶性的CX3CL1，兩者為CX3CL1在細胞膜表面被切割所導致。細胞膜上的CX3CL1主要發揮黏附因子樣作用，而可溶性CX3CL1可與其受體CX3CR1結合，調控神經元-小膠質細胞的相互作用［27］。

眾多研究表明，在神經炎癥反應中，CX3CL1/CX3CR1信號通路因環境不同而表現不同的神經生物學調節作用。例如神經細胞分泌的CX3CL1可通過作用于小膠質細胞表面的CX3CR1調控小膠質細胞極化狀態，抑制神經炎癥反應。而外源性給予CX3CL1卻不能改善神經炎癥反應。通過基因調控的方法發現，CX3CL1和CX3CR1敲除可緩解脊髓側索硬化綜合征模型、帕金森病模型和多發性硬化模型的神經炎癥反應，但是卻可加重阿爾茨海默病和腦卒中模型的神經炎癥反應，說明CX3CL1/CX3CR1信號通路在調控神經炎癥反應中具有雙面性，對該信號通路加強時間和空間的調控尤為重要。

在阿爾茨海默病模型中，已有研究表明，Aβ寡聚體與細胞內τ蛋白聚集均可引起神經元合成與釋放CX3CL1，可溶性的CX3CL1一方面可通過與小膠質細胞表面的CX3CR1結合，提升小膠質細胞的吞噬功能，清除Aβ聚集體和細胞碎片，另一方面也可激活小膠質細胞內的Nrf2信號通路，抑制小膠質細胞的過度激活，提示探索CX3CR1介導的下游信號通路產生偏倚的內在機制至關重要。已知NF-κB是小膠質細胞內炎癥因子表達的核心轉錄因子，而Nrf2是抑制小膠質細胞過度激活的關鍵機制。自由基氧化損傷是激活Nrf2的直接原因，而CX3CL1可促進Nrf2信號通路活性，CX3CR1基因敲除小鼠小膠質細胞Nrf2信號通路活性受到明顯抑制，表明小膠質細胞內自由基水平的變化可能是CX3CL1/CX3CR1信號通路介導的重要細胞內變化。自由基水平升高不僅可激活Nrf2信號通路，也可促進NF-κB信號通路的激活，促進炎癥因子的合成。而Nrf2信號通路激活所產生的抗氧化物質可通過3條途徑抑制NF-κB活性：①Nrf2下游基因NQO-1可直接拮抗自由基氧化損傷，降低自由基含量；②HO-1可催化一氧化碳的生成，在轉錄水平抑制NF-κB活性；③GCLC與GCLM可催化谷氨酸、半胱氨酸與甘氨酸聯合生成谷胱甘肽，阻斷氧化應激，抑制NF-κB激活。因此，筆者認為，監測CX3CL1/CX3CR1信號調控小膠質細胞內自由基水平的變化，可能是解析其雙重作用的關鍵機制。雖然有研究表明，在CX3CR1基因敲除小鼠中，給予Nrf2激動劑卻并不能抑制τ蛋白301L突變導致的小膠質細胞增生，可能為CX3CR1缺失可導致小膠質細胞發育障礙而引起的，而非Nrf2信號通路與NF-κB信號通路失衡所致。

3.趨化因子對神經元-少突膠質細胞相互作用的影響

少突膠質細胞是中樞神經系統髓鞘神經膠質細胞，它們包裹神經元軸突形成的髓鞘，是保證神經信息跳躍式快速傳導的生物學基礎。眾所周知，神經系統的發育成熟與各類神經細胞遷移密切相關。少突膠質細胞，無論在胚胎發育期，還是成熟神經系統內，均為遷移能力最強的細胞類型，并且在少突膠質細胞表面分布有CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4等CXCR系列受體。采用小鼠少突膠質前體細胞作為觀察對象，在體外發現生長調節癌基因-α（GRO-α）、白細胞介素-8（IL-8）、基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）和CCL5可劑量依賴性地促進少突膠質前體細胞的增殖，而CXCL2無此功效。進一步研究表明，CXC趨化因子GRO-α、IL-8和 SDF-1α可促進髓鞘相關蛋白的合成，而CC類的趨化因子卻無此作用。受體研究發現，CXCR4可表達于血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）陽性的少突膠質前體細胞，SDF-1引發的少突膠質前體細胞增殖依賴于CXCR4的介導。提示CXC類趨化因子可能在髓鞘形成的過程中發揮了重要作用。

神經活動可促進少突膠質前體細胞的增殖和分泌，導致神經元軸突髓鞘的增加。有趣的是，阻斷神經元囊泡釋放可降低軸突髓鞘的形成，提示神經元活動導致的髓鞘形成與神經元囊泡釋放有關。如前所述，已有數種趨化因子在神經元囊泡中被發現，比如CCL2和 CXCL12，并且它們的釋放與神經元去極化相關。已有研究表明，少突膠質細胞，尤其是少突膠質前體細胞與神經細胞存在緊密的相互作用，趨化因子中CX3CL1/CX3CR1、CXCL12/CXCR4在其中發揮重要作用，現分述如下。

201 7年，Neuron發表文章顯示，來源于內側基底節的中間神經元可促進膠質傾向的神經前體細胞轉化為少突膠質細胞。干擾內側基底節中間神經元可導致皮質少突膠質細胞新生減少［28］。采用轉錄組學模擬中間神經元-少突膠質細胞相互作用顯示，趨化因子CX3CL1有促進少突膠質細胞新生的功效，這種在體內通過旁分泌的相互作用是十分重要的。通過特異性敲除神經前體細胞的CX3CR1或者組成型敲除CX3CR1，發現出生后皮質中少突膠質前體細胞和少突膠質細胞的數量顯著減少，提示中間神經元分泌的CX3CL1對于少突膠質細胞的發育具有重要的調控作用。

少突膠質細胞在神經信息傳遞過程中具有重要的作用。已有研究表明，條件性敲除少突膠質細胞上的腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）受體TrkB可導致小鼠認知功能障礙。一種可促進髓鞘再生的抗組胺藥物氯馬斯汀，可逆轉威廉姆斯綜合征（Williams syndrome）中的神經和行為學損傷。

2018年，PNAS發表文獻顯示，CXCL1在雌激素改善軸突髓鞘再生功能中具有重要作用［29］。軸突數量和髓鞘新生減少是多發性硬化與自發性免疫性腦脊髓炎的典型的病理改變。已有研究表明，激活雌激素受體β（ERβ）可顯著提升神經元軸突的髓鞘再生，但是對浸潤至中樞神經系統的免疫細胞無顯著影響。機制研究發現，ERβ激活可顯著提升趨化因子CXCL1的表達量。在中樞神經系統，星形膠質細胞是CXCL1的主要來源，采用免疫組織化學的方法發現，經ERβ激動劑治療后，CXCL1陽性的星形膠質細胞顯著增加，釋放的CXCL1通過與分布于少突膠質細胞表面的CXCR2結合，促進髓鞘再生。同時該研究發現CXCL1與IL-1β呈現明顯共定位，提示IL-1β與CXCL1可能存在相互依存的關系。在體外采用IL-1β刺激星形膠質細胞發現，IL-1β可顯著提升星形膠質細胞內的CXCL1的表達，且該培養基也可以顯著促進少突膠質細胞中髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）的表達。采用CXCR2的拮抗劑SB225002可顯著抑制少突膠質細胞的分化，增加凋亡現象。

除神經元外，少突膠質細胞與內皮細胞的相互作用介導了少突膠質細胞的發育。眾所周知，少突膠質細胞為神經系統內遷移能力最強的細胞類型，在大腦和脊髓的發育過程中，少突膠質細胞需要借助識別并且依托已經發育成熟的物理性依托，例如神經網絡或血管結構，進行遷移。2016年，Science發表文獻顯示，少突膠質細胞可與血管內皮細胞相互作用。遷移中的少突膠質細胞可沿血管或者以血管為依托，跨越血管進行遷移。在血管結構破壞的小鼠腦內發現，少突膠質細胞的遷移受限。深入研究顯示，Wnt-CXCR4信號通路在調控少突膠質細胞與內皮細胞相互作用的過程中發揮了重要作用［30］。

少突膠質細胞沿血管遷移的終止是由于少突膠質前體細胞的分化，導致少突膠質細胞與內皮細胞解離，提示抑制少突膠質細胞分化的信號分子可能參與了少突膠質細胞與內皮細胞的相互作用。已有研究表明，Wnt信號通路是少突膠質前體細胞分化的抑制因子。無論是通過基因調控，還是藥理學激動Wnt，都可顯著減少少突膠質細胞與內皮細胞的解離。采用條件性表達活性β聯蛋白（β-catenin）來激活少突膠質前體細胞中的Wnt信號通路，經轉錄組學分析發現，趨化因子受體CXCR4是上調最明顯的mRNA。CXCR4在胚胎發育期的少突膠質前體細胞中表達，但是，隨著前體細胞分化為成熟的少突膠質細胞，Wnt信號通路活性降低，CXCR4的表達也隨之降低。藥理學研究表明，阻斷CXCR4功能可導致神經發育過程中少突膠質前體細胞遷移功能受阻。上述研究結果表明，Wnt通路通過上調少突膠質前體細胞中的趨化因子受體CXCR4促進了其與內皮細胞的相互作用，進而促進了少突膠質前體細胞沿血管系統遷移的功能。

隨后，有研究表明，CXCL12過表達內皮細胞的培養基可顯著促進少突膠質前體細胞的增殖、遷移和分化，研究結果顯示過表達CXCL12內皮細胞培養基可促進少突膠質前體細胞的增殖，上調細胞內PDGFRα、bFGF、CXCR4和CXCR7的表達。阻斷CXCR4可抵消CXCL12對少突膠質前體細胞增殖與遷移的促進作用，敲除CXCR7可抑制少突膠質前體細胞的分化。上述研究結果表明，內皮細胞中CXCL12可促進少突膠質前體細胞增殖與遷移，內皮細胞與少突膠質細胞之間相互作用對白質損傷的修復具有積極的作用。