第2節　細菌外毒素血癥

在過去的二三十年中，由于抗菌藥物的普遍應用，革蘭陰性菌在膿毒癥中的地位更為突出，加之內毒素研究手段的突破性進展，越來越多的學者更關注嚴重燒（創）傷后革蘭陰性菌感染及內毒素的研究，而對革蘭陽性菌膿毒癥少有問津。然而流行病學調查資料顯示，近年來由革蘭陽性菌引起的膿毒癥和膿毒性休克明顯增多，目前已達膿毒癥發病率的50%以上，其中金黃色葡萄球菌感染的發病率位居首位，是燒傷創面感染、急性肝衰竭和血源性腎炎等疾病的主要病原菌。革蘭陽性菌致病的嚴重程度及致死率與革蘭陰性菌相當，且通常與革蘭陰性菌膿毒癥同時發生，協同作用，使膿毒癥的病理生理過程進一步惡化，嚴重威脅著患者的生命。

與革蘭陰性菌相比，以金葡菌為代表的革蘭陽性菌致病成分更為復雜，包括細菌細胞壁成分、胞外酶和外毒素等多種因子，其中金葡菌細胞壁成分［主要是肽聚糖（peptidoglycan，PGN）和磷壁酸（teichoic acid，LTA）］、外毒素［包括葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins， SE）和中毒性休克綜合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin-1， TSST-1）］在金葡菌膿毒癥和MODS的發生、發展中可能占有重要地位。體內外研究表明，肽聚糖和磷壁酸具有很強的抗原性及“內毒素樣”生物學活性，可通過脂多糖受體CD14介導的信號通路誘導單核-巨噬細胞活化以及TNF-α、IL-6和一氧化氮等炎癥介質合成、釋放，但其刺激能力明顯低于內毒素。金葡菌的腸毒素和TSST-1均屬“超抗原”（superantigen），具有強大的抗原刺激能力，T淋巴細胞為其主要的靶細胞。隨著分子生物學和現代免疫技術的發展與應用，人們對細菌外毒素尤其是金葡菌外毒素的認識正在不斷地深化。銅綠假單胞菌是燒（創）傷感染的另一重要致病菌，其內毒素所引致的病理生理效應已為人所熟知，但其外毒素A的作用往往被忽視。本節擬結合我們的研究工作，重點介紹細菌外毒素與燒（創）傷膿毒癥關系的研究內容。

一、外毒素的基本概念與結構特征

自發現白喉外毒素以來，有關細菌外毒素的研究已有近百年歷史，但直到20世紀50年代進入分子生物學時期后，其研究才得到迅速發展。

（一）概念

經典微生物學曾認為，外毒素先是由細菌合成蛋白毒素，具有酶的活性，在菌體內多以酶原形式存在，合成后釋放到菌體外，受蛋白酶作用被激活，而形成外毒素。革蘭陽性球菌是產生外毒素的主要細菌，但是現在發現，許多革蘭陰性菌也能產生大量的致死性外毒素，如霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、肺炎桿菌及大腸埃希菌等。以往認為外毒素僅分泌到菌體外，現知也有存在于細胞體內的，菌體破裂后才釋放于外環境中。

傳統觀念認為，僅有內毒素可造成機體血管舒縮功能紊亂，致使低血壓并可發生休克。這種觀念也已更新，Todd等首先報道了中毒性休克綜合征（toxic shock syndrome，TSS），以后有人證實TSS由熱原性外毒素C（pyrogenic exotoxin C，PEC）及葡萄球菌腸毒素F（staphylococcal enterotoxin F，SEF）引起。PEC及SEF均為外毒素，可見外毒素也可導致休克和MODS，甚至可以造成多器官衰竭。

多數學者認為，銅綠假單胞菌致病因素主要是內毒素，進入血循環后，形成內毒素血癥。Liu等首先發現銅綠假單胞菌外毒素A（pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA），并證實它是一種重要的潛在性致病的毒力因子。PEA被稱為致死毒素，對鼠、狗、猴等多種動物可造成低血壓及膿毒性休克，并有明顯的致死作用。

在復制膿毒性休克動物模型中，單純用內毒素攻擊，結果往往不穩定。在臨床中僅用內毒素抗血清治療燒傷患者，療效不顯著。Pierson曾對嚴重燒傷患者給予多價銅綠假單胞菌免疫血清治療，使菌血癥的發生率及病死率顯著降低。綜合這些報道，大致可以體會到細菌外毒素確實有致病作用。我們測試嚴重燒傷銅綠假單胞菌感染患者血清中PEA含量變化，發現感染后血液中PEA含量劇增，與感染嚴重程度明顯相關。

（二）細菌外毒素的作用特點

從分子水平的研究表明，細菌外毒素都有著相似的生物學特性以及相似的結構和功能。

1．結構

無論哪一種細菌外毒素都具有雙功能蛋白質。其一是結合部分，它可識別靶細胞膜上的特異性受體，并與之結合，決定毒素對機體細胞的選擇親和性。另一為毒素活性部分，在結合成分的協助下，可進入靶細胞，發揮其毒性活性作用，決定毒素的致病特點及作用方式。所有細菌外毒素在其C末端附近都有一個胱氨酸，并具有酶的活性；結合成分的N末端氨基酸排列順序極其相似。

2．作用機制

各種細菌外毒素在敏感細胞中的靶點各不相同，毒素進入細胞靶點的方式包括三方面：①毒素經由毒素-受體復合物形成的通道進入膜內；②毒素與受體特異性結合，啟動跨膜信號而激活細胞內信號系統；③通過細胞吞飲作用直接進入細胞。一般認為，細菌外毒素對靶細胞的毒素效應不盡相同，至少可分為腸毒素、細胞毒素、溶細胞毒素和神經毒素4類。不同類型外毒素的作用機制均有一定的特異性，如PEA屬于細胞毒素，它可催化輔酶Ⅰ（NAD＋）水解為二磷酸腺苷（ADP）核糖基和煙酰胺兩個部分，使延長因子-Ⅱ發生ADP核糖基片，抑制肽-tRNA及mRNA的移位，造成蛋白質合成障礙而導致細胞功能異常甚至破壞。

3．受體

細菌外毒素進入細胞絕大多數都是由細胞膜上的受體介導的，細菌外毒素與糖苷脂結合，通過吞飲作用（endocytosis）進入細胞。

二、銅綠假單胞菌外毒素A

銅綠假單胞菌含有與致病有關的物質達十余種，目前公認，銅綠假單胞菌外毒素A（PEA）是最重要的致死性物質。現已基本搞清PEA的結構及功能。

（一）理化性質

PEA為單鏈蛋白質，相對分子質量66 000左右，最大吸收波長280nm，等電點5.0。PEA由A、B兩個片段組成，A為活性片段，是ADP-核糖基轉移酶；B為結合片段，鏈內有4對二硫鍵，無游離巰基，對熱不穩定。經晶體衍射圖分析，PEA分子由613個氨基酸組成，分成3個功能結構區。第Ⅰ、Ⅱ區位于氨基端，屬結合片段，與易感細胞表面受體結合。第Ⅲ區有ADP-核糖基轉移酶活性，是活性部分。PEA毒性作用主要通過受體介導的內化實現，但它也可不依賴于受體的“液相吞飲”而進入細胞。

（二）毒性作用

PEA毒性很強，對多種哺乳動物及人細胞都有毒性。臨床分離的銅綠假單胞菌菌株90%以上產生這種外毒素，其致死活性遠遠高于細菌內毒素。動物實驗及臨床觀察證實多種外科感染與此毒素有關，它是銅綠假單胞菌感染中的重要致病因子。據報道，用提純的PEA給小鼠注射后，可出現局部組織壞死、肝細胞腫脹和脂肪變性、肺出血及腎壞死等，其改變與燒傷小鼠感染產PEA的銅綠假單胞菌后病理損害相似。許多實驗觀察表明，PEA作用后肝、脾、腎、肺等器官中延伸因子-Ⅱ活性均降低，以肝表現最為明顯。同樣，PEA可以抑制各器官的蛋白合成，其中肝抑制最重。示蹤研究發現PEA的靶器官主要是肝，其次是肺及腎。PEA還可引起未燒傷組織的壞疽性深膿瘡（ecthyma gangrenosa）。除直接組織損害作用外，PEA對機體的免疫系統亦有重要調節效應。一方面它可以抑制抗體的產生，對T、B淋巴細胞產生細胞毒效應；另一方面它又是淋巴細胞較弱的促分裂原，在一定程度上可以促進免疫反應。

銅綠假單胞菌作為一種條件致病菌，常可使免疫功能低下的患者發生嚴重的或致命性膿毒癥。雖然其發病與多種菌體成分和分泌產物有關，現已明確銅綠假單胞菌產生的PEA毒性最強，是最重要的致病因子之一。臨床資料提示，PEA可引起人體中性粒細胞減少，出現酸中毒、低血壓或膿毒性休克，并有明顯的致死作用。據報道，PEA對人體外周血中單核細胞可產生顯著的細胞毒效應。當分離的細胞與PEA共同作用一小時即可抑制細胞對同位素標記胸腺核苷的攝取，并破壞其吞噬能力，還可能出現細胞形態學異常改變，表明PEA對機體組織細胞具有廣泛的毒性作用及損傷效應，它可能在嚴重銅綠假單胞菌感染誘發膿毒癥、膿毒性休克過程中具有一定的意義。

（三）測定方法

PEA體外檢測方法較多，常用有以下幾種。

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）：楊理邦等建立BA-ELISA法，并引入BA系統，只需制備一種特異性PEA抗血清就可檢測。本法可用于臨床，具有一定推廣使用價值。

（2）ADP-核糖基轉移酶活性測定：用Collier法測定ADP-核糖基轉移酶的活力，是一種較準確的檢測法。

（3）血凝抑制試驗：血凝抑制試驗為PEA檢測的常用方法之一，其敏感性比ELISA低。

（4）細胞毒試驗：選用小鼠L₉₂₉細胞做細胞毒試驗，可測定少量外毒素，方法可靠。

（四）免疫防治

PEA的免疫方法較多，一般可以分成兩種方式。

（1）主動免疫：PEA可制成類毒素，用來免疫動物及人。用于小鼠，其保護率達50%～80%。每周注射一次類毒素，3周以后體內特異性抗體（主要為IgM及一部分IgG）水平升高，用其超免血漿可治療銅綠假單胞菌膿毒癥。此外，類毒素中含的溶血素及卵磷脂酶還可以提高其免疫效果。銅綠假單胞菌分成許多血清型，與致病有關的物質有多種，因此，制備一種含有幾種主要致病物質的混合疫苗進行防治很有必要。Cryz將PEA與菌體O-多糖制成復合物疫苗，在健康者中顯示良好的免疫效果。Homma使用多成分銅綠假單胞菌菌苗及PEA類毒素免疫接種，明顯降低燒傷患者銅綠假單胞菌膿毒癥的病死率。

（2）被動免疫：經研究證實，被動免疫可以對PEA攻擊動物起到保護作用。產生的抗體與PEA的B亞單位結合，使PEA失去與細胞受體結合的可能，從而起到免疫治療作用。Galloway研制出抗PEA的單克隆抗體，用于燒傷感染大鼠，可延長其存活時間。應用PEA抗毒素治療，雖能中和菌體外毒素但菌體仍存活，因此，聯合應用抗內、外毒素的抗體效果會更好，這樣既中和外毒素又起到調理作用，促進吞噬細胞功能，殺死菌體。

不同銅綠假單胞菌菌株產生的PEA存在著結構上的差異，因此，制備通用型的免疫制劑仍有一定困難，有待于今后解決。

三、葡萄球菌外毒素

臨床流行病學資料表明，革蘭陽性菌膿毒癥的發病率逐年上升，究其原因，可能與以下因素有關：①大量抗菌藥物治療主要是針對革蘭陰性菌，從而使得革蘭陽性致病菌感染機會增多；②長時間血管內導管的應用越來越多；③手術移植物的廣泛應用（如人造關節、瓣膜、血管等）；④革蘭陽性菌感染病原菌的變遷；⑤抗菌藥物耐藥性在革蘭陽性致病菌中的播散［如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌、耐萬古霉素糞腸球菌］。流行病學資料顯示，革蘭陽性菌感染中金葡菌發病率位居首位，是嚴重燒（創）傷創面感染等危重癥的重要病原菌。據保加利亞一燒傷中心的資料證實，無論是燒傷創面還是血標本中金葡菌檢出率均居首位（分別為31.4%和35.0%），且MRSA耐藥率逐年增高。上海瑞金醫院從159例燒傷患者創面分離獲得菌株601株，其中金葡菌最多見（271株，45.1%），MRSA耐藥率高達79.1%。上海長海醫院分析95例燒傷合并血源性感染時發現，金葡菌占29.2%，是導致全身性感染的重要病原菌。

金葡菌可以產生多種外毒素，主要包括中毒性休克綜合征毒素、腸毒素、溶血毒素和紅疹毒素等，它們作用于體內多種組織和臟器，誘發一系列病理生理異常改變。

（一）中毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）

中毒性休克綜合征（TSS）系由金葡菌感染后引起的嚴重多系統疾病，其臨床特征為急性高熱、皮疹、嘔吐、腹瀉、低血壓及多器官損害等。Todd等首先報道了TSS病例，并進行了有關臨床與生化方面的研究。TSS不僅在年輕月經期婦女中發生，而且非月經期的婦女、男性及兒童也可發病。自20世紀80年代以來的文獻報道中，在燒傷、皮膚移植、外科手術發生感染后也能并發TSS。現已明確，TSST-1與TSS發病密切相關，是引起TSS的最主要致病因子。

TSST-1是一種多肽蛋白質，大部分由金葡菌噬菌體Ⅰ群產生，相對分子質量約22 000，含有194個氨基酸殘基。氨基酸序列分析顯示，TSST-1氨基酸序列與相關毒素如金葡菌B、C型腸毒素及鏈球菌致熱性外毒素A幾乎沒有同源性序列。血清學分析證實，攜帶有產TSST-1葡萄球菌的人群中僅5%發病，多數人仍健康。TSST-1的抗體隨年齡而增加，30%的2歲兒童開始出現毒素抗體，20歲以上抗體滴度上升較快，97%的40歲以上成人抗體滴度大于1∶100，表明多數健康成人都接觸過產生TSST-1的菌群，并對其產生了免疫力。據報道，TSS菌株產生TSST-1顯著高于非TSS菌株，且產TSST-1葡萄球菌與TSS的發病之間存在顯著相關性。

燒傷TSS多出現在傷后l周內，多發生于燒傷4%～40%TBSA的患者，且在創面覆蓋包扎后發病。覆蓋包扎物的類型不定，有紗布、異種（豬）皮或同種異體皮等。包扎用的敷料及覆蓋物極像一個葡萄球菌的培養基。燒傷TSS患者大多數發生于10歲以下兒童。燒傷TSS患者TSST-1的檢出率占60%，剩余TSST-1陰性患者很可能體內有其他毒性物質。有資料證實，除TSST-1以外，其他細菌或金葡菌產物也可引起TSS。此后，有學者發現一例燒傷面積12%的兒童，因葡萄球菌腸毒素B引起TSS；另有報道，燒傷后β-溶血性A族鏈球菌亦可引起TSS。

TSST-1具有廣泛的生物學活性，主要包括致熱性、增加宿主對內毒素的敏感性、免疫抑制、降低網狀內皮系統清除功能、有絲分裂原性等。①致熱性： TSST-1可直接誘導發熱反應，發熱程度與毒素劑量呈正相關，并且因給藥途徑不同而有所差異。目前認為，TSST-1一方面可透過血腦屏障直接作用于下丘腦引起發熱；另一方面它還能夠刺激單核細胞產生IL-1等內源性致熱物質而間接起作用。②提高宿主對內毒素的敏感性：TSST-1可顯著提高宿主及細胞對內毒素攻擊的敏感性，與內毒素發生致死性協同效應，這是該毒素最重要的特性之一。健康家兔單獨接受TSST-1僅表現為發熱反應，即使劑量高達100μg/kg亦不能產生致死效應，提示該毒素本身致死性作用并不強。但如果同時給予較低劑量的內毒素與TSST-1，動物即可出現典型的TSS癥狀和體征，表現為呼吸、循環、肝、腎及消化道等多系統器官功能嚴重障礙，導致動物死亡。與之相似，對感染巴斯德菌的動物再進行TSST-1攻擊也可產生較強的內毒素增敏作用。體外試驗亦證明，TSST-1預處理大鼠腎小管細胞，能明顯提高細胞對內毒素的敏感性。③免疫抑制：有資料表明，培養物中含有低劑量TSST-1即可抑制鼠IgM抗體對綿羊細胞的補體結合應答反應，納克水平毒素則可顯著抑制免疫球蛋白的合成，且內毒素可加重這一反應。一般認為，上述作用系TSST-1特異性地結合到T淋巴細胞上，尤其是促進Ts細胞被激活所致。④降低網狀內皮系統清除能力：靜脈注射TSST-1和內毒素能明顯降低家兔網狀內皮系統清除膠質的能力，并可能抑制宿主對內源性內毒素等物質的吞噬、清除，進而造成內毒素的蓄積，增強機體對TSST-1的敏感性。⑤有絲分裂性：采用［3H］-胸腺嘧啶摻入DNA的方法證明TSST-1為一種非特異性促有絲分裂原，可以刺激T淋巴細胞增殖，但對B細胞作用甚微。其作用機制可能為毒素誘導單核-巨噬細胞產生IL-1，并進一步刺激T細胞合成IL-2，從而促使T淋巴細胞的分化增殖。⑥其他作用：TSST-1在體外能結合單核細胞、內皮細胞等，刺激它們產生多種內源性炎癥介質，如TNF-α、IL-1等。此外，該毒素還可以抑制白細胞的趨化性、介導延遲皮膚超敏反應等。

大量研究表明，TSST-1是TSS的重要細菌致病性產物，且流行病學、微生物和動物模型的研究有力地證明它在TSS發病中的重要地位。例如，給家兔和狒狒注射提純的TSST-1能引起與人類TSS相同的癥狀，生化指標改變及形態學損害亦與臨床患者TSS相似，主要表現為發熱、低血壓及全身多個器官（心、肝、肺、腎、胃腸道等）的廣泛損害。采用抗TSST-1抗體被動免疫的動物對產TSST-1金葡菌的致死性有較強的防護作用。臨床資料證實，從典型患者分離的金葡菌絕大多數可檢出TSST-1，且TSS常發生于血清中缺乏特異性抗毒素抗體的人群，進一步說明該毒素在TSS發病中的意義。但需要強調的是，TSST-1并非引起TSS的唯一毒素，TSS全部癥狀和體征可能系多種毒素共同作用的結果，其中許多重要方面由細菌內毒素所介導。此外，其他毒素如金葡菌腸毒素A、B等亦可誘發TSS樣膿毒癥和全身多臟器損害。有人發現，給動物連續皮下注射腸毒素A，能引起發熱、充血、MODS甚至死亡，且這一反應比注射TSST-1要強數倍。因此，TSS是一種多因子作用的并發癥，除TSST-1以外，其他細菌或金葡菌產物均可以引起該綜合征。

（二）金葡菌腸毒素

1.腸毒素的分布、產毒率與臨床意義

由于金葡菌致病因素復雜、耐藥性不斷增強，特別是中介型抗萬古霉素金葡菌的出現，金葡菌感染所致膿毒癥及MODS的防治已成為現代燒傷外科和危重病醫學面臨的棘手難題之一。我們調查了近8年間從創面分離病原菌的分布情況，其中金葡菌分離率從1995年的17.7%（居第3位）上升為1999年的29.3%（居第1位）、2003年的44.4%，并呈現進一步升高的趨勢。此外，278例次靜脈內置管的嚴重燒傷患者，7例次發生導管膿毒癥（5例死亡），其分離病原菌中金葡菌占50%以上。由此可見，金葡菌是燒傷感染中最常見的菌種之一，其中MRSA耐藥性強，易引起膿毒癥和MODS等致死性并發癥。

細菌學研究表明，可溶性外毒素的產生是革蘭陽性菌感染的重要標志之一，其中金葡菌腸毒素因其“超抗原”特性以及在中毒性休克綜合征、MODS發病中的特殊意義而備受關注。業已明確，金葡菌的腸毒素和TSST-1均屬“超抗原”毒素，具有強大的抗原刺激能力，T淋巴細胞為其主要的靶細胞。與普通抗原不同，腸毒素和TSST-1與主要組織相容性復合物Ⅱ類分子（MHC Ⅱ）結合的部位在抗原結合槽以外的區域，因此可不經加工直接與T淋巴細胞抗原受體的β鏈Ⅴ區（TCR Ⅴ β）結合。由于TCR Ⅴ β區核苷酸序列非常保守，同一個體內的許多T細胞可具有相同的Ⅴβ成分，因此單一的超抗原極低濃度（1～10ng/mL）即可激活大量T淋巴細胞（可達全部T細胞的5%～10%，甚至40%）（圖6-2）。而活化的T細胞可釋放TNF-α、IFN-γ等細胞因子，最終導致膿毒癥甚至膿毒性休克的發生。

流行病學調查顯示，從筆者醫院燒傷患者及醫務人員手和鼻腔中分離131株金葡菌中，獲產毒株120株，產毒率高達91.6%（表6-8），而且以同時產生多種類型毒素者居多［同時產腸毒素B、C（SEB、SEC）者最為常見］，其中90%以上為耐藥菌株（表6-9）。另檢測100株金葡菌腸毒素產生情況，結果表明總產毒率為68%。其中60株MRSA全部產一種或一種以上腸毒素，而40株非MRSA產毒率僅為20%。上述結果初步提示，產腸毒素金葡菌普遍存在于燒傷患者的創面、呼吸道，且MRSA較非MRSA有更強的毒力和致病性，對燒傷后并發金葡菌感染構成潛在的威脅。

2．腸毒素的變化規律及其與膿毒癥和組織損害的關系

迄今為止，關于金葡菌腸毒素在膿毒癥及MODS發病中的變化特點及其作用機制尚缺乏足夠的了解。導致這一領域進展緩慢的原因之一是缺乏敏感、快速的金葡菌感染檢測手段。目前臨床上常規的細菌培養與鑒定方法只能說明是否為金葡菌感染，而金葡菌產毒試驗也僅是觀察細菌在體外的產毒情況，并不能反映其在體內的生物活性及致病特點，且該方法耗時較長，致使金葡菌感染的早期診斷非常困難，誤診的情況時有發生。因此，建立敏感、快速的金葡菌腸毒素檢測方法用來直接監測外毒素在體內的變化特點，將有助于金葡菌感染所致膿毒癥及MODS的早期識別與診斷，并可望對金葡菌腸毒素發病機制和臨床意義的認識獲得新進展。

我們率先采用改良雙單抗夾心BA-ELISA方法檢測動物血漿及組織勻漿中SEB水平，利用單克隆抗體的特異性和生物素-親和素系統的放大原理，使該方法的檢測靈敏度顯著升高，可達0.078μg/L，檢測范圍為0.078～20.0μg/L，血漿中SEB的回收率為88.7%～106.2%。建立該方法為進一步研究SEB在體內的生物學效應奠定了技術基礎。為此，我們采用大鼠20%TBSA Ⅲ度燙傷合并金葡菌攻擊所致嚴重膿毒癥模型，探討了SEB在膿毒癥和多器官功能損害中的變化規律及致病機制。結果顯示，燒傷后金葡菌感染動物血漿SEB水平迅速升高，并于6h達峰值，其后迅速下降，但至24h仍明顯高于傷前值；而心、肝、肺、腎等組織中SEB含量持續上升，其中24h升高幅度最為明顯。與其他組織相比，金葡菌嚴重膿毒癥時肝、腎組織中SEB含量明顯高于其他臟器，表明肝、腎可能是SEB蓄積的主要場所。由于SEB可經腎小球自由濾過，并被近端小管細胞完全重吸收，因此腎在腸毒素清除中的作用可能尤為重要。給家兔靜脈注射標記的腸毒素后，循環中腸毒素迅速清除，并分布到肝、腎、肺、脾等組織，其中腎含量最高，進一步證實腎是腸毒素蓄積和排泄的最重要場所之一。值得說明的是，燙傷合并金葡菌感染可導致動物局部組織內毒素水平亦明顯升高，且動物心、肝、肺、腎組織中內毒素水平與血漿SEB含量呈明顯正相關，提示金葡菌攻擊組織內毒素的升高與SEB的毒性作用有關。而采用抗SEB單抗進行干預后不僅小腸黏膜的損傷程度有所減輕，組織中內毒素水平亦有不同程度的降低。由此可見，SEB的毒性作用可加劇小腸黏膜屏障功能受損、腸道通透性增加，進而腸源性內毒素移位并蓄積于局部組織。

研究表明，SEB作為“超抗原”具有很強的絲裂原性，極低濃度即可致T細胞大量活化、促炎細胞因子產生顯著增加，對金葡菌膿毒癥和MODS的病理生理過程可能具有重要的促進作用。我們的資料證實，SEB對家兔肝等多個器官的功能具有直接損害效應。為了探討SEB在燒傷膿毒癥所致MODS中的作用，我們選取心、肝、肺、腎、腸等重要器官，分析了SEB與器官功能改變的關系。結果顯示，單純燒傷打擊后24h，動物心、肝、肺、腎功能明顯異常，但反映小腸黏膜完整性的小腸組織二胺氧化酶活性無明顯改變。燒傷合并金葡菌攻擊后動物肝、腎和心功能損害進一步加劇，肺組織中性粒細胞聚集明顯增加；同時，小腸組織二胺氧化酶活性呈持續下降趨勢，提示小腸黏膜的完整性亦嚴重受損。病理形態學檢查證實，燒傷后金葡菌感染動物心、肝、肺、腎、腸等組織均可見不同程度的炎細胞浸潤和壞死性病變，其中肺改變尤為顯著。進一步分析發現，早期給予抗SEB單克隆抗體可有效降低血漿及組織中SEB水平，同時肝、腎、心功能指標不同程度降低，小腸組織二胺氧化酶活性基本恢復至傷前范圍。值得注意的是，抗SEB單克隆抗體干預組動物早期病死率明顯降低。上述結果表明，隨著組織中SEB含量的降低，動物相應器官功能和預后亦在一定程度上得以改善，從而證實了SEB在MODS中具有重要作用。由此可見，燒傷合并金葡菌攻擊造成動物多器官功能的損害進一步惡化，其改變與臟器組織中SEB含量持續升高密切相關。

3．腸毒素介導膿毒癥發病的分子機制

業已明確，T淋巴細胞的大量活化是腸毒素所致膿毒癥與MODS的重要特征之一。而IFN-γ是活化T淋巴細胞產生的一種強有力的免疫調節因子，在調節單核-巨噬細胞和內皮細胞功能方面作用顯著，故推測它在金葡菌膿毒癥及MODS的病理生理過程中可能具有重要意義。我們的實驗結果顯示，燒傷合并金葡菌攻擊后0.5h，肝、肺等組織中IFN-γ mRNA表達明顯增強，至24h仍處于較高水平。與之相似，傷后組織和血漿中IFN-γ含量亦迅速升高。相關分析表明，肺組織IFN-γ水平與肺SEB的含量呈顯著正相關，但內毒素的改變與之無相關性。同時，早期給予抗SEB單克隆抗體可顯著抑制血漿及肺組織中IFN-γ的產生，從而證實SEB可能參與了IFN-γ的誘生過程。上述結果表明，燒傷后金葡菌攻擊可導致不同組織中IFN-γ基因及蛋白質表達廣泛上調，其改變與組織SEB的直接刺激作用有關。進一步分析可見，燒傷后金葡菌感染動物肝、肺、腎組織中IFN-γ含量與相應臟器中TNF-α濃度呈高度正相關，同時肺IFN-γ含量與局部組織中NO水平亦呈正相關關系。表明IFN-γ可通過上調TNF-α和NO等介質的誘生在金葡菌感染所致MODS中具有促進作用，抗SEB單克隆抗體干預對動物臟器功能的保護效應與其在一定程度上抑制IFN-γ的產生有關。

以往研究提示，IFN-γ作為重要的免疫調節因子在細菌感染過程中對機體具有保護和損害的雙重作用。Zhao等利用IFN-γ受體缺陷小鼠實驗證實，在金葡菌感染所致膿毒癥早期，IFN-γ可通過激活巨噬細胞和中性粒細胞、增強其殺菌活性對機體產生保護效應。但在金葡菌感染的晚期，由于IFN-γ誘導了巨噬細胞內TNF-α、IL-6等炎癥介質的大量合成與釋放，其對機體的損害作用則更為突出。此外，IFN-γ還可上調巨噬細胞等抗原呈遞細胞表面的MHC Ⅱ分子表達，從而對金葡菌腸毒素和TSST-1誘導的T細胞依賴性休克具有重要的促進作用（圖6-3）。據報道，在SEB攻擊的小鼠體內IFN-γ水平明顯升高，并與NO的過度產生密切相關。利用抗IFN-γ特異性抗體進行早期拮抗可有效抑制NO的產生，同時動物病死率亦明顯降低，進一步證實了IFN-γ對機體的損傷效應。我們的實驗結果亦顯示，燙傷合并金葡菌攻擊后動物肝、肺、腎組織中IFN-γ水平與相應臟器中TNF-α的濃度呈高度正相關，同時肺IFN-γ水平與肺組織中生物蝶呤和NO水平亦呈顯著正相關，表明IFN-γ可能通過上調TNF-α和NO等炎癥介質的產生參與金葡菌膿毒癥的病理生理過程。

在上述工作的基礎上，我們進一步探討了燙傷后金葡菌膿毒癥時相關信號通路的活化機制及交會作用（cross-talk）。實驗采用大鼠20%TBSA Ⅲ度燙傷合并金葡菌攻擊所致膿毒癥模型，觀察Janus激酶／信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路在革蘭陽性菌膿毒癥病理過程中的活化情況，并著重探討抑制該通路對金葡菌膿毒癥發生、發展的影響，同時觀察抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子（NF）-κB信號通路對JAK2/STAT3信號通路活化的影響，用以了解膿毒癥時信號通路的交互作用。實驗結果證實：①燙傷合并金葡菌攻擊后，組織中多種細胞因子的基因與蛋白表達明顯升高，其改變與血清ALT、AST、Cr、BUN等器官功能指標相關。提示金葡菌膿毒癥時局部組織致炎／抗炎細胞因子的大量生成可能在一定程度上參與了動物多器官功能損害的病理過程。②燙傷后金葡菌攻擊早期動物肝、肺、腎等組織中STAT3迅速活化，其改變可能與金葡菌SEB的直接刺激作用密切相關。③早期注射JAK2激酶特異性抑制劑AG490和STAT3磷酸化抑制劑雷帕霉素（rapamycin, RPM），動物肝、肺、腎組織中STAT3的活化均不同程度地減輕，局部組織中細胞因子基因及其蛋白表達均有不同程度地降低，肝功能指標有所改善。說明直接抑制JAK2/STAT3的活化能減輕膿毒癥動物局部組織的炎癥反應，進而對機體多臟器功能具有一定的保護作用。④金葡菌膿毒癥時抑制NF-κB信號通路，能在一定程度上抑制JAK/STAT通路的活化，說明金葡菌膿毒癥時NF-κB與JAK/STAT通路間可能存在著交會作用，而核轉錄因子STAT可能是信號通路網絡中一個重要交會點。應用MAPK抑制劑AG126早期干預未能抑制STAT3的活化，提示在金葡菌膿毒癥時動物體內MAPK通路與STAT3交互作用可能較弱。

在JAK/STAT通路的激活機制較為明確后，其反饋調控機制進一步成為研究的熱點。目前已發現有多種機制參與了對JAK/STAT途徑的調控，特別引人注目的是近年來發現一族被稱為細胞信號轉導抑制因子（suppressors of cytokine signaling, SOCS）的蛋白質，它們作為JAK/STAT的特異性內源抑制物參與了對JAK/STAT信號傳遞的“負反饋”調節過程，在維持機體免疫自穩中可能發揮了重要作用。我們的實驗結果顯示，嚴重腹腔感染所致膿毒癥動物肝、腎、肺等重要生命器官SOCS1和SOCS3的基因表達均明顯上調，分別于術后6h達峰值，并且這一改變與細菌毒素及其介導的TNF-α等炎癥介質刺激作用密切相關。這些資料均提示，內毒素可能參與了體內SOCSs的誘生過程。另一組實驗中，我們采用大鼠燙傷合并金葡菌攻擊致膿毒癥模型，進一步探討膿毒癥大鼠體內SOCS基因表達的改變及其與細胞因子“消漲”之間的相互關系。結果顯示，燙傷合并金葡菌感染后，大鼠肝、肺組織IFN-γ生成均顯著增加，同時，動物肺組織SOCS1、SOCS2和SOCS3的基因表達明顯上調，其中SOCS2和SOCS3 mRNA表達改變較為迅速，傷后0.5h即明顯高于對照組；與之相比，肝組織SOCS1 mRNA表達的改變較為緩慢（傷后2h才明顯高于對照組），但24h仍維持于較高水平。金葡菌腸毒素B單克隆抗體早期干預后，隨著肺IFN-γ生成的減少，肺組織SOCS1、SOCS2和SOCS3的基因表達亦明顯降低。結果表明，燙傷后金葡菌感染可誘導體內SOCS表達上調，其改變與IFN-γ等細胞因子的“消漲”密切相關，提示它們可能參與了金葡菌膿毒癥時體內免疫炎癥反應平衡的調控過程。

由此可見，在金葡菌感染誘發膿毒癥和MODS病理過程中，腸毒素、內毒素及其介導的細胞因子在信號轉導水平相互調節、相互促進，可能是協同效應的發生機制之一。值得指出的是，SOCS不僅是JAK/STAT途徑的有效抑制因子，而且還可在一定程度上抑制MAPK、激活蛋白（AP）-1和活化T細胞核因子（NF-AT）等激酶及核因子的活化，說明由JAK/STAT誘導生成的SOCS還可能參與了對其他信號轉導途徑的調控過程。由此可見，SOCS不僅對JAK/STAT途徑具有“負反饋”抑制作用，還有可能是多條信號轉導通路的“負反饋交會點”（negative cross-talk）。因此，深入探討JAK/STAT途徑在體內的生物學效應及其與SOCS相互作用可能會為膿毒癥的防治提供新的線索。

總之，鑒于燒（創）傷后并發金葡菌膿毒癥的嚴重性和復雜性，很有必要加強其發病機制和防治新措施的研究，特別應當重視金葡菌外毒素的作用及其臨床意義的探討，進一步弄清金葡菌外毒素的變化規律、組織分布特點、協同效應及其與膿毒癥和多器官損害的關系，對其誘發失控炎癥反應和免疫功能異常的分子機制進行深入的研究，從而為燒（創）傷后金葡菌感染所致膿毒癥及MODS的防治奠定基礎。

（三）其他外毒素

1．金葡菌溶血毒素

溶血毒素（staphylolysin）是一種外毒素，不耐熱，經電泳分析分為α、β、γ及δ4種，其中以α-毒素為主。α-毒素對哺乳動物及人的紅細胞有溶血作用，可損傷血小板；也能使平滑肌痙攣，小血管收縮，造成局部缺血和壞死，為此損傷創面在α-毒素作用下，肉芽組織可發生壞死，因而使表淺創面逐漸加深。

2．金葡菌紅疹毒素

金葡菌紅疹毒素由噬菌體Ⅱ群的金葡菌產生，兒童易感染該毒素，引起正常皮膚出現猩紅熱樣皮疹。由于大部分金葡菌都含有該毒素，并且兒童體內又缺少相應的抗體，所以發病率較高。

3．鏈球菌致熱外毒素

燒（創）傷后造成感染的病原菌種類繁多，產生外毒素的細菌達十多種，除銅綠假單胞菌及金葡菌最多見外，也可有其他產生外毒素的細菌，例如破傷風桿菌及A族鏈球菌。燒傷后合并破傷風時有報道，目前因燒傷后常規預防注射破傷風抗毒素，故破傷風的發病率已經非常低了。

A族鏈球菌的許多菌株在體內、外均可產生鏈球菌致熱外毒素（streptococcal pyrogenic exotoxin，SPE），其產生與A族鏈球菌攜帶溫和噬菌體有關。SPE根據血清學檢驗可分為A、B、C 3個不同的型。研究表明，SPE-A與金葡菌腸毒素B、C等基因序列具有同源性，因而這些毒素分子可能有相似的活性位點結構。

目前認為化膿性鏈球菌和金葡菌毒素均屬于細菌性超抗原，其顯著的生物學特征是能非特異性地活化T細胞增殖，并促進其釋放TNF-α、IFN-γ、IL-2等細胞因子。超抗原除可激活T細胞外，還可誘導T細胞的耐受，從而導致人體免疫調節的紊亂，提高機體對感染的易感性。由于極微量的超抗原就可以非特異性激活大量T細胞，因而微小的病灶即可以引起過量的細胞因子產生，進一步造成機體明顯的多系統損害。

前面提及的TSS也是一種與超抗原密切相關的感染性疾病。近年來，又報道了一種鏈球菌感染引起的毒性休克樣綜合征（toxic shock-like syndrome， TSLS），其表現與TSS相似，主要特征為低血壓及多器官損傷。有關研究顯示，TSLS鏈球菌大多數能產生SPE-A、SPE-B，小部分能產生SPE-C，這樣有一種或多種鏈球菌超抗原與TSLS發病相關，而且SPE-B與鏈球菌蛋白酶致病作用有關，推測可能是造成機體廣泛組織損傷的重要原因之一。另據報道，25例A群鏈球菌感染者出現TSLS占44%。免疫印跡分析證實分離的菌株產生鏈球菌SPE-A、SPE-B、SPE-F等，且不同臨床征象的患者分離出的菌株產生的毒素數量無明顯差異。TSLS患者血清中TNF-α、IL-6水平分別比無咽-扁桃體炎對照組、菌血癥但未并發休克者顯著升高，說明鏈球菌感染后至少有3種超抗原參與TSLS的發病過程，其機制可能與超抗原激發過量細胞因子產生有關。

SPE誘發鏈球菌感染及膿毒癥的確切機制尚不甚清楚，許多人認為與其超抗原特性有關，即SPE可通過與T細胞的相互作用，導致過量細胞因子的釋放與宿主的損傷，在臨床上表現為膿毒癥、休克甚至MODS。此外，SPE廣泛的生物學活性及其致病作用在誘發膿毒并發癥中具有重要意義，包括致熱性、增強宿主對內毒素及鏈球菌溶血毒素O的敏感性、細胞毒性及多種組織損害、增加血腦屏障和血管通透性、抑制網狀內皮系統的吞噬和清除功能等。

（四）金葡菌外毒素免疫防治措施

1．腸毒素和TSST-1特異性抗體

TSST-1的某些單克隆抗體可保護動物免受TSST-1引起的肝、腎功能損害，大幅度降低動物病死率。目前，腸毒素和TSST-1的抗血清及多種針對TCR和MHCⅡ分子的單克隆抗體已相繼問世，可有效阻斷T細胞的活化，促進抗體介導的毒素快速清除（圖6-4）。

2．MHCⅡ分子的單克隆抗體

MHC Ⅱ分子為腸毒素和TSST-1誘導T細胞活化、增殖的重要輔助因子，因此阻斷腸毒素、TSST-1與MHC Ⅱ分子的結合有可能成為金葡菌膿毒癥免疫防治的有效手段之一。體外試驗表明，單一的MHC Ⅱ分子的單克隆抗體即可有效阻斷各種腸毒素誘導T淋巴細胞活化的生物學效應。

3．SR31747A

SR31747A為一種新型的免疫調節劑，與淋巴細胞和單核-巨噬細胞表面的σ受體具有高度親和力。該復合物與細胞表面的σ受體結合后可刺激淋巴細胞和單核-巨噬細胞合成與釋放抗炎細胞因子IL-10，從而有效抑制SEB誘導的淋巴細胞增殖反應。同時，其還能抑制IL-2、IL-4和TNF-α等炎癥介質的合成與釋放。

4．其他

機體的一些內源性細胞因子也能夠抑制金葡菌誘導的T細胞增殖反應，在一定程度上防止致死性休克的發生。有人利用膿毒性休克小鼠模型發現，SEB攻擊前18h給小鼠腹腔注射抗IL-6抗體，可使動物病死率由55%升至90%；而用IL-6或IL-11預處理則可使病死率顯著降低50%左右，且這種保護作用呈劑量依賴性。另據報道，IL-12對SEB誘導的致死性休克具有明顯的保護作用。此外，CD28基因缺陷小鼠可完全耐受TSST-1引起的致死性中毒性休克綜合征，該種小鼠經TSST-1刺激后不能產生TNF-α，而IFN-γ的產生亦下降90%左右。

（姚詠明　李紅云　盛志勇）