1.3 轉(zhuǎn)基因育種、雜種

1.3.1 概況

玉米是重要的糧食作物，也是可以用基因工程方法進(jìn)行品種改良的作物。隨著世界首例轉(zhuǎn)基因煙草于1983年被成功培育，全球范圍內(nèi)也加速開展了轉(zhuǎn)基因玉米的研究。當(dāng)前，玉米轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域已經(jīng)建立了一套比較完整的理論和技術(shù)體系，其技術(shù)主要包括：以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的載體轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用基因槍、PEG等的DNA直接導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過(guò)花粉管通道、子房注射的轉(zhuǎn)化技術(shù)。在玉米育種過(guò)程中，有些性狀的基因轉(zhuǎn)化取得了突破性進(jìn)展，如抗蟲、抗除草劑基因工程已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用階段。我國(guó)在耐除草劑玉米的研發(fā)上也儲(chǔ)備了一批有重大應(yīng)用價(jià)值的品種：瑞豐125、DBN9936、DBN9501，均具有抗蟲和耐除草劑的復(fù)合性狀，能有效抵抗玉米螟、黏蟲等靶標(biāo)害蟲；同時(shí)配合目標(biāo)除草劑的使用，能有效防治田間野草，有利于農(nóng)業(yè)機(jī)械化管理，提高生產(chǎn)效率。此外，將中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的高表達(dá)植酸酶轉(zhuǎn)基因玉米BVLA430101用作飼料，可將植酸磷分解成無(wú)機(jī)磷，有效提高動(dòng)物對(duì)玉米飼料中磷的轉(zhuǎn)化利用率，減輕牲畜糞便中磷排放造成的環(huán)境污染。2006年，全球轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積增長(zhǎng)到2500萬(wàn)公頃，僅次于大豆，位居第二位。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)種屬間基因的流動(dòng)彌補(bǔ)了玉米遺傳資源的不足，與常規(guī)育種方式結(jié)合必將帶來(lái)玉米育種上的重大突破。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展情況

我國(guó)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究從20世紀(jì)80年代開始布局，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用對(duì)于提升我國(guó)大豆和玉米等作物的產(chǎn)量、減少農(nóng)藥的使用、保障我國(guó)糧食和生態(tài)安全起到了重要作用。近年來(lái)，政府部門加快出臺(tái)相關(guān)政策，以適應(yīng)轉(zhuǎn)基因管理的新形勢(shì)，并逐步向轉(zhuǎn)基因育種商業(yè)化邁進(jìn)，為提高種業(yè)戰(zhàn)略地位、鼓勵(lì)實(shí)質(zhì)創(chuàng)新、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的加快落地提供了良好的制度環(huán)境和市場(chǎng)環(huán)境。2022年6月8日，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《國(guó)家級(jí)轉(zhuǎn)基因玉米品種審定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》，標(biāo)志著我國(guó)生物育種的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用邁出了重要一步。

1.3.3 育種程序及技術(shù)措施

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以及分子育種理論的快速發(fā)展，基因工程也受到更多遺傳育種者的重視?；蚬こ讨饕芯拷倪z傳特征，以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，通過(guò)現(xiàn)代高效的計(jì)算機(jī)技術(shù)，對(duì)基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而達(dá)到發(fā)揮良性基因優(yōu)勢(shì)、改善劣質(zhì)基因的目的。基因工程通過(guò)將設(shè)計(jì)好的DNA分子導(dǎo)入活細(xì)胞中，使得生物體自身的遺傳特征獲得改變，變成性能更優(yōu)的新品種，這也是基因工程的重要意義所在。

（1）育種程序

①根據(jù)玉米的遺傳背景，選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法。

②在進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)基因育種之前，首先要對(duì)玉米的目的基因進(jìn)行定位，然后根據(jù)目的基因的功能選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法。

③在對(duì)玉米進(jìn)行基因編輯時(shí)，首先要對(duì)目的基因進(jìn)行DNA提取，然后用基因編輯技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行改造，改造之后要對(duì)玉米進(jìn)行檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果滿足要求就可以將該目的基因?qū)胗衩字?；如果檢測(cè)結(jié)果不滿足要求，則需要重新選擇適合的基因編輯方法。

④在對(duì)玉米進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種時(shí)，要選擇合適的轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化受體，首先要將目的基因?qū)胗衩字?，然后在合適的受體上種植該轉(zhuǎn)基因玉米。

（2）技術(shù)措施

在研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因方法也越來(lái)越多。相關(guān)人員需結(jié)合實(shí)際需要，合理選擇轉(zhuǎn)基因方法，以達(dá)到預(yù)期目的。

①農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法

農(nóng)桿菌是自然界存在的，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法是最常用、最有效的玉米轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在試驗(yàn)操作層面是將待轉(zhuǎn)化的外源目的基因整合到經(jīng)過(guò)改造的遺傳轉(zhuǎn)化的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌侵染植物的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因與植物基因組的轉(zhuǎn)移與融合，再利用植物組織培養(yǎng)再生體系，培育出轉(zhuǎn)化再生的植物植株，再進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)確定以及后代轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性分子和植物生理學(xué)鑒定，得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，是研究最深入、使用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化方法。當(dāng)前已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植物中，有60%以上都是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的，可運(yùn)用到玉米轉(zhuǎn)基因操作中的農(nóng)桿菌主要有根癌農(nóng)桿菌、發(fā)根農(nóng)桿菌。其中，對(duì)Ti質(zhì)粒的研究最多，是現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的方法，可成功侵染到玉米中，在植物根部或莖基部傷口處形成冠癭瘤。

王陽(yáng)等科學(xué)家通過(guò)對(duì)抗蟲基因crylAb進(jìn)行改造，獲得了新的基因cryFLIa。他們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將該基因轉(zhuǎn)接到玉米幼胚中，經(jīng)過(guò)抗性檢測(cè)和抗病鑒定試驗(yàn)，成功獲得了抗玉米螟的玉米材料。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法主要使用玉米幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織、玉米幼胚或玉米黃化苗的莖尖作為轉(zhuǎn)化受體。常用的農(nóng)桿菌菌株有EHA105、C58和LBA4404。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法中，Ti質(zhì)粒會(huì)侵染玉米，T-DNA從質(zhì)粒上脫離并插入到植株的基因中，而轉(zhuǎn)基因后代不會(huì)發(fā)生性狀分離，具有穩(wěn)定的遺傳性。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法主要應(yīng)用于雙子葉植物和裸子植物的遺傳轉(zhuǎn)化。該方法通過(guò)使農(nóng)桿菌載體與植株體的分生組織和生殖器官接觸來(lái)完成遺傳轉(zhuǎn)化，接觸方法可選用真空滲透法、浸泡法或注射法。接觸完成后利用組織培養(yǎng)、抗生素篩選和分子檢測(cè)等方法，培養(yǎng)和分離轉(zhuǎn)基因的植株子代。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單快速、低成本、易于掌握等特點(diǎn)，能夠有效避免基因沉默現(xiàn)象，具有較高的轉(zhuǎn)化率和整合率，篩選可靠。因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是當(dāng)前制備轉(zhuǎn)基因植物成功率最高的方法之一，在植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

②基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是除農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法外使用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑尳閷?dǎo)轉(zhuǎn)化法也被稱為生物彈道技術(shù)，借助壓縮氣體產(chǎn)生的沖擊波，將粘有DNA的細(xì)微金粒高速射入受體細(xì)胞或組織中，穿過(guò)層層結(jié)構(gòu)，直至到達(dá)細(xì)胞核。粘有DNA的微粒在進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被整合到宿主細(xì)胞的DNA上，產(chǎn)生基因突變，從而達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的?；驑尳閷?dǎo)轉(zhuǎn)化法最早應(yīng)用于20世紀(jì)90年代，該方法的優(yōu)勢(shì)顯著，不受物種和轟擊部位限制，不需要重復(fù)培養(yǎng)原生受體，操作簡(jiǎn)單快捷，命中率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，無(wú)細(xì)胞特異性，不依賴基因型，受體材料、靶細(xì)胞來(lái)源廣泛。但是該方法也存在一定弊端，如會(huì)對(duì)玉米細(xì)胞造成損害、嵌合體多、轉(zhuǎn)化成本較高、遺傳性不穩(wěn)定、隨機(jī)性較強(qiáng)和整合效率較低等。

③花粉管通道法

花粉管通道法在我國(guó)的應(yīng)用十分廣泛，其原理是通過(guò)植物天然授粉過(guò)程中花粉粒萌發(fā)形成的花粉管通道，在自花授粉階段將外源基因?qū)肽遗撸怪仓曛苯赢a(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化后的種子?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ募夹g(shù)特點(diǎn)是不需要組織培養(yǎng)誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化后可直接得到種子，對(duì)設(shè)備要求較低，轉(zhuǎn)化率較高，可大批量轉(zhuǎn)化，且由于該方法利用植物天然授粉條件，適用作物類型廣泛。同時(shí)，花粉管通道法操作簡(jiǎn)單、很容易實(shí)施、育種周期短，可以轉(zhuǎn)化任何基因型材料，并直接運(yùn)用到常規(guī)育種中。此外，我們還有改進(jìn)的花粉管通道技術(shù)，首先，選取自交授粉后的玉米果穗，時(shí)間以授粉后18～26 h為宜，留下2 cm的花絲，其余部分剪除，然后用酒精進(jìn)行消毒處理，接著沿穗軸將玉米花莖基部的葉子平均切成3份，剝開后剪去部分花絲，最后滴加外源DNA溶液，使外源DNA直接進(jìn)入幼胚，以降低遺傳變異的概率。但是，玉米花絲通常較長(zhǎng)，且長(zhǎng)短不一，操作難度較大，加之授粉時(shí)間的限制，導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合的偶然性較大，從而使其應(yīng)用受限。

1.3.4 成果

（1）加快育種進(jìn)程

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在加快育種進(jìn)程方面發(fā)揮著重要作用，通過(guò)將外源基因?qū)肽繕?biāo)生物體中，農(nóng)作物能夠產(chǎn)生抗蟲、抗草藥或抗病毒等特性，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)部分重要性狀的改良，從而減少害蟲對(duì)作物的侵害，有效地加快了玉米育種進(jìn)程。同時(shí)，該技術(shù)能夠幫助農(nóng)民減少使用農(nóng)藥，提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量，增加農(nóng)作物的適應(yīng)性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這是傳統(tǒng)育種無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，特別是對(duì)于玉米自交系的改良，在攻克了自交系轉(zhuǎn)化的技術(shù)難題之后，改良周期可以大大縮短至2代左右。

（2）加速育種創(chuàng)新

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以利用異種生物的基因資源，培育更新的玉米品種，如環(huán)境友好型——蘇云金芽孢桿菌（Bt）等；勞動(dòng)與環(huán)境友好型——抗除草劑（高效無(wú)殘毒）；營(yíng)養(yǎng)高效型——高賴氨酸、高植酸、高蛋氨酸、高β-胡蘿卜素；環(huán)境開發(fā)利用型——抗旱、耐鹽、固氮、耐低磷；工程型——廉價(jià)的醫(yī)藥成分（疫苗、抗生素、激素）、動(dòng)物蛋白、工程塑料等。

（3）促進(jìn)新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展

利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器，使得植物器官成為新型的工業(yè)原料，從而促使許多珍稀物質(zhì)能夠被大量生產(chǎn)出來(lái)。同時(shí)，生物技術(shù)制藥的主要作用在于能大幅度降低醫(yī)藥成本，從而催生一些新的工藝和生產(chǎn)線。

（4）彌補(bǔ)玉米遺傳資源

轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得玉米的遺傳轉(zhuǎn)化有了突破性進(jìn)展，包括打破物種界限、克服有性雜交障礙、快速有效創(chuàng)造遺傳變異、培育新品種、創(chuàng)造新類型等；在玉米育種中，有些性狀的基因轉(zhuǎn)化取得了突破性進(jìn)展，如抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米、抗除草劑玉米和特種玉米等，其中抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用階段。

①抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米

相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，嚴(yán)重蟲害可導(dǎo)致年均減產(chǎn)30%，嚴(yán)重病害可導(dǎo)致年均減產(chǎn)10%。我國(guó)作為農(nóng)作物病蟲害多發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)，受玉米螟危害顯著，造成的玉米損失較大。在種子包衣中噴灑化學(xué)殺蟲劑，能夠預(yù)防部分侵蝕幼芽期的害蟲，一般不會(huì)對(duì)種芽造成傷害。但在植株生長(zhǎng)過(guò)程中噴灑殺蟲劑，則會(huì)對(duì)生態(tài)平衡造成影響，破壞生態(tài)環(huán)境，造成農(nóng)藥污染等問(wèn)題。傳統(tǒng)的抗螟品種培養(yǎng)方法育種周期較長(zhǎng)，并且實(shí)際的育種效果也不佳。因此，科學(xué)家們開始探索更加安全、有效和經(jīng)濟(jì)的生物防治技術(shù)，經(jīng)過(guò)不斷嘗試，蘇云金芽孢桿菌（Bt）表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蟲效果，但是這種基因只對(duì)鱗翅目害蟲具有毒害作用，且在光照作用下容易被分解，效果持續(xù)時(shí)間較短，田間實(shí)際操作較為困難，難以作為商品制劑批量生產(chǎn)。

Bt基因作為一種抗蟲基因，能夠在玉米包衣和植株的生長(zhǎng)過(guò)程中代替化學(xué)殺蟲劑的功效。Bt芽孢在形成過(guò)程中會(huì)分泌毒蛋白，并以原毒素的形式存在體孢晶體中，這種原毒素在微堿性環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生毒性肽鏈分子，一旦被蟲體攝取，會(huì)在蟲體腸道表面產(chǎn)生受體，從而破壞昆蟲的腸道環(huán)境，使幼蟲停止進(jìn)食，直到死亡，該方法可使玉米產(chǎn)量平均增加9%。此外，CpTL基因?qū)τ衩酌⑶食崮坑衩赘~甲、雜擬谷盜和直翅目蝗蟲等均具有抗性。

傳統(tǒng)的除蟲措施一般是使用化學(xué)殺蟲劑，但化學(xué)殺蟲劑對(duì)益蟲也有較強(qiáng)的殺傷力，且長(zhǎng)期大量使用化學(xué)殺蟲劑不僅會(huì)造成環(huán)境污染，破壞生態(tài)環(huán)境，還會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，容易引起人畜中毒。而依靠轉(zhuǎn)基因玉米，則能夠消除使用傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑的弊端，并且防治效果較好。同時(shí)，為了避免或延緩害蟲產(chǎn)生抗藥性，我們還需采取相應(yīng)的防治措施，如混種部分普通玉米種子、繼續(xù)篩選高抗蟲性雜交種子等。

②抗除草劑玉米

田間雜草對(duì)玉米的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)均具有不利影響，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，除草劑的使用越來(lái)越普遍，能夠節(jié)省勞動(dòng)力、提高勞動(dòng)效率、保護(hù)土壤結(jié)構(gòu)。但是，使用除草劑也會(huì)在一定程度上對(duì)玉米植株造成傷害，污染生態(tài)環(huán)境。在玉米植株的生長(zhǎng)過(guò)程中，將抗除草劑轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用其中，可保證玉米健康生長(zhǎng)，減少除草劑對(duì)玉米植株的傷害，降低種植成本，實(shí)現(xiàn)無(wú)公害除草，提高玉米產(chǎn)量，且有助于節(jié)省人力、物力。其中，IMI作為一種優(yōu)質(zhì)的抗除草劑玉米，具有非常強(qiáng)的耐受性，除草劑能夠直接噴灑在玉米植株上，對(duì)1年生雜草、寬葉雜草的生長(zhǎng)均具有良好的抑制效果。

③改良玉米

類蛋白轉(zhuǎn)基因玉米作為一種糧食作物與經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量雖然較為可觀，但玉米蛋白質(zhì)中賴氨酸含量較少，其整體品質(zhì)卻不容樂(lè)觀。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究過(guò)程中，科學(xué)家通過(guò)將外源基因?qū)肫胀ㄓ衩字?，可得到?yōu)良性狀的玉米。例如，科學(xué)家利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的馬鈴薯蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩字校褂衩桩a(chǎn)量顯著提升。基于此，研究人員開始將更加優(yōu)良的基因?qū)胗衩字仓曛?，以提高玉米中氨基酸的含量?/p>

1.3.5 轉(zhuǎn)基因種子對(duì)市場(chǎng)的影響

轉(zhuǎn)基因種子通常會(huì)把抗蟲、抗除草劑、抗病、高產(chǎn)等優(yōu)良性基因轉(zhuǎn)至受體品種中，它們相比常規(guī)種子有著更高的產(chǎn)量和價(jià)格，這對(duì)市場(chǎng)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。

一是提升了行業(yè)壁壘。轉(zhuǎn)基因育種研發(fā)門檻較高，研發(fā)投入大且研發(fā)審批周期較長(zhǎng)。在研發(fā)審批流程方面，轉(zhuǎn)基因種子需要經(jīng)歷安全證書獲批和種子審定上市兩個(gè)階段，通過(guò)后才能正式推向市場(chǎng)，而整個(gè)生物安全證書從申請(qǐng)到獲批的流程基本需要7～13年。在研發(fā)投入方面，轉(zhuǎn)基因種子從研發(fā)早期到通過(guò)一系列試驗(yàn)，再到進(jìn)行監(jiān)管登記大約需要1.36億美元，平均耗時(shí)13.1年，因此轉(zhuǎn)基因種子的商業(yè)化會(huì)大幅加深“行業(yè)護(hù)城河”。

二是提高了市場(chǎng)集中度。在政策推動(dòng)方面，種業(yè)是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈上科技含量最高的環(huán)節(jié)，為提高我國(guó)種業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力，國(guó)家頻繁出臺(tái)政策，以鼓勵(lì)種業(yè)企業(yè)兼并重組。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)推廣方面，1996年轉(zhuǎn)基因品種推廣以來(lái)，美國(guó)玉米種子市場(chǎng)CR5（業(yè)務(wù)規(guī)模前五名的公司所占的市場(chǎng)份額）不斷提升，2019年美國(guó)玉米種子市場(chǎng)CR5為88.7%。轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得行業(yè)門檻提升，規(guī)模較小、不具備競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的種業(yè)企業(yè)被逐步淘汰。

三是提升了轉(zhuǎn)基因技術(shù)企業(yè)的盈利能力。一方面，轉(zhuǎn)基因種子的推廣有助于提高優(yōu)勢(shì)企業(yè)市場(chǎng)占有率，進(jìn)而提升企業(yè)盈利能力；另一方面，轉(zhuǎn)基因性狀收費(fèi)收入也將提升企業(yè)盈利能力。大北農(nóng)調(diào)研數(shù)據(jù)顯示，相較于雜交玉米品種，轉(zhuǎn)基因玉米種子價(jià)格會(huì)增加20～25元/畝。