1.4　飛秒激光生物光子學

飛秒激光技術在生物研究中逐步獲得了越來越多的交叉和應用。超短的飛秒脈沖使得人類首次可以對生物樣本實現在分辨時間上達到飛秒量級的無創式精確操作。同時，飛秒脈沖內超高的峰值功率使得光與物質的相互作用以非線性過程為主，這種相互作用的有效范圍僅僅是非線性區域，使得空間分辨率突破了衍射極限而達到了百納米量級。

從20世紀90年代開始，人們首先將飛秒激光的非線性過程用于細胞成像的熒光激發。顯微成像是研究生物學（特別是細胞生物學和分子生物學）最為核心的技術手段，高分辨率的顯微成像在一切與生物相關的研究中都有重要的應用和研究價值。成像分辨率是顯微成像最為重要的指標。傳統的熒光成像和共聚焦掃描顯微鏡提供了衍射極限的分辨精度（500 nm附近），但對于若干生物大分子和細胞結構仍顯不足；而近場和掃描電子顯微鏡則無法保持對生物樣本的活體觀測和熒光標記。此外，由于可見光波段在組織中會被散射和吸收，傳播深度會隨之降低，因此嚴重限制了組織的熒光成像。飛秒激光的超高峰值功率為生物中的非線性激發提供了技術基礎，在在體動物成像和組織熒光顯微成像中可能會有一些成像深度和分辨率上的優勢。但是，基于飛秒激光的多光子成像系統昂貴而龐大，在很多細胞水平的研究中并不比共聚焦掃描顯微鏡具有明顯的優勢。因此，在較長的一段時間內，飛秒激光在生物領域的應用主要停留在技術研究的層次，而缺少實際意義上的應用，沒有真正去解決一些生命科學中的重大問題。

在2005年光遺傳學技術出現后，腦科學和神經科學研究發生了革命性的變化，而對活體動物的腦神經熒光成像的需求急速增加。基于飛秒激光的多光子顯微成像技術與神經科學的研究快速結合，并獲得了廣泛的應用，取得了一系列重大突破。圖1.18所示為鼠的大腦皮層和海馬區的三光子顯微成像。由于飛秒脈沖具有優異的時域特性以及近紅外波段的散射和吸收特性，它在組織中具備了比連續光或長脈沖好得多的傳播優勢。近期，通過飛秒激光對腦中的神經元成像，以及飛秒激光對神經元內光遺傳蛋白的雙光子激發，哈佛大學醫學院的課題組首次發現了視覺皮層神經元的競爭機制。而斯坦福大學的Karl Diesseroth組首次通過少數幾個神經元的刺激調控，以及通過飛秒激光的雙光子激發刺激，實現了對視覺的植入。哥倫比亞大學的Yuste小組使用飛秒激光對小鼠的運動神經元進行觀測和刺激，實現了只通過幾個神經元的雙光子刺激即可控制小鼠的行為。

圖1.18　鼠的大腦皮層和海馬區的三光子顯微成像

21世紀以來，利用飛秒激光對細胞的精確手術和離子調控（例如對鈣離子的調控，其示意圖如圖1.19所示），也在近年取得很多重大的突破。飛秒激光具有長脈沖間隔且波長對于生物樣本較為安全，可以對生物樣本進行較長時間的照射，因此在衍射極限精度的精密細胞手術在轉基因、細胞生理過程和骨架的研究、細胞融合、神經組織再生、分子信號調控等多領域都取得了很大的進展。例如，飛秒激光在緊致聚焦時僅在聚焦區域產生極高的能量密度，從而實現蝕除線粒體、切割染色體等亞細胞級的細胞手術；飛秒激光轉基因技術首次使得生物大分子（如RNA），以及一些特殊的蛋白質等被轉染到細胞內成為可能；通過這項技術，人們可以有效地研究一些特殊疾病的機理，控制干細胞分化，控制誘導細胞變種，生產單克隆抗體等，這將有可能在癌癥治療、干細胞科學等領域實現突破。

圖1.19　激光對鈣離子的調控示意圖

因此，飛秒激光生物光子學為一些針對基因、癌癥，以及細胞生物學的研究提供了新的切入方法，在一定程度上擺脫了傳統生物化學手段的限制。這種新的光學方法具備了一些全新的特征，為很多研究提供了新思路、新視角，為進一步研究探索生命科學中的新問題、新現象，以及最終在臨床上的應用提供了可能。