第二節　始基卵泡發生與發育

卵泡是卵巢的基本結構和功能單位，由位于中間的卵母細胞及圍繞在其周圍的顆粒細胞和膜細胞組成。始基卵泡是卵泡發育的起點，始基卵泡的形成是卵巢中體細胞（隨后的顆粒細胞）侵入生殖細胞合胞體，包繞單個停留在減數第一次分裂雙線期的卵母細胞，從而形成卵泡的過程。始基卵泡的形成過程中有多種細胞及小分子的參與和相互作用。在人類，始基卵泡在女性胚胎妊娠早期就開始生成，直到出生后。總體而言，始基卵泡有三種不同的命運，即保持靜止、凋亡閉鎖及生長發育。

卵泡發育（follicles development）是指始基卵泡被激活，進入生長狀態，依次形成初級卵泡、次級卵泡再到三級卵泡，并最終成熟的過程。并且這個過程受到包括生長因子等在內的多種小分子的調控，通過不同的信號通路，維持卵泡池的穩定及發育。

一、始基卵泡的生長過程

哺乳動物卵巢由生殖細胞和多種體細胞組成，其中，卵泡（follicles）是卵巢的基本結構和功能單位。卵泡由一個處于不同發育階段的卵母細胞以及圍繞著卵母細胞的體細胞構成，后者主要包括顆粒細胞（granulosa cells，GCs）和膜細胞（theca cells，TCs）。在卵泡中，卵母細胞及其周圍的顆粒細胞和膜細胞相互作用，并在適當的外來分子的作用下共同維持卵泡的持續存在與生長發育。卵母細胞的存在可以預防卵泡的黃素化，也可影響顆粒細胞及膜細胞的包括甾體類激素在內的多種因子的生成并誘發細胞的增殖分化。反過來，顆粒細胞和膜細胞也可以接受外界及卵母細胞的信息，通過自分泌和旁分泌等作用維持卵母細胞的形態功能，以及促進其生長。

隨著對卵泡生長發育的不斷深入研究，目前多根據卵泡的大小，將其分為始基卵泡（primordial follicles）、中間卵泡（intermediary follicles）、初級卵泡（primary follicles）、次級卵泡（secondary follicles）、三級卵泡（tertiary follicles）及成熟卵泡（mature follicles）。而根據卵泡中是否有卵泡腔（antrum），又可將卵泡分為竇前卵泡（preantrum follicles）和竇卵泡（antrum follicles），前者包括始基卵泡到次級卵泡的過程，后者則包括三級卵泡與成熟卵泡。經典研究認為，竇前卵泡的生長階段是非促性腺激素依賴性的，竇卵泡的生長發育直至排卵過程依賴促性腺激素的作用（圖2-1）。

始基卵泡也稱原始卵泡，包括一個停留在減數第一次分裂前期雙線期的卵母細胞和包繞著它的單層扁平的顆粒細胞。在人類，始基卵泡在女性胚胎妊娠15~22周開始形成直至出生后。而在嚙齒動物中，始基卵泡的發生主要在出生后的前幾天，兔在出生后十天左右。始基卵泡體積小、數目多，女性胎兒出生時，卵巢中始基卵泡的數量大約有1×106~2×106，大部分位于卵巢淺層皮質。

始基卵泡直徑約20~35μm，沒有明顯的種間差異。停留在雙線期的卵母細胞位于卵泡的中央，呈圓形，細胞核大而圓，核仁明顯，染色質較細且著色淺，胞質呈嗜酸性。

此階段圍繞在卵母細胞周圍的顆粒細胞稱為始基卵泡顆粒細胞（primordial follicle granulose cells，pfGCs），也稱前顆粒細胞（pregranulosa cells，pGCs）。始基卵泡顆粒細胞較小，呈扁平狀，與其周圍的結締組織之間有薄層的基膜。不同物種始基卵泡里，圍繞著初級卵母細胞的顆粒細胞數目有較大差異，如嚙齒動物約10個、綿羊約28個、人類約13個。前顆粒細胞來源于卵巢表面的上皮樣間皮，同一個卵泡周圍的顆粒細胞群為寡克隆來源。顆粒細胞無直接血供，從而形成一個相對的血-卵泡屏障（blood follicle barrier），可以限制細胞及大分子物質進入卵泡中。顆粒細胞在卵泡的生長過程中對卵母細胞具有支持、營養和一定的調節作用。而反過來，顆粒細胞自身的增殖與分化也受到卵母細胞及多種小分子的調控，包括促性腺激素、生長因子（如表皮生長因子、胰島素樣生長因子）等，在顆粒細胞的表面也發現了對應的受體。值得一提的是，在發育到竇卵泡之前，顆粒細胞的功能被認為是非促性腺激素依賴性的，其增殖分化主要依賴于生長因子。卵泡發育至竇卵泡時期，顆粒細胞開始在FSH的作用下分泌雌激素，至排卵前階段，顆粒細胞則獲得在LH作用下分泌孕激素的能力。

卵母細胞和周圍的顆粒細胞相互交流與作用、共同生長和成熟，形成功能有序的整體單位。在卵泡中，顆粒細胞之間、顆粒細胞與卵母細胞之間，存在大量的縫隙連接（gap junction），這些縫隙連接的存在便于卵泡中細胞之間的小分子物質交換（如葡萄糖、氨基酸等）和信息傳遞，對卵泡的形成、生長、閉鎖，以及卵母細胞減數分裂的停滯與啟動等具有重要意義。縫隙連接由連接蛋白（connexin）組成，哺乳動物卵泡中最重要的是連接蛋白-37（Cx-37）和連接蛋白-43（Cx-43）兩種。其中Cx-37主要存在于卵母細胞中，Cx-43主要存在于顆粒細胞中，因此顆粒細胞之間的交流依靠的是同源的連接蛋白復合體，而顆粒細胞與卵母細胞之間的則是異源的。研究發現在Cx-37基因敲除的小鼠中，卵泡發育在竇前期停滯，卵母細胞發育停滯，無法恢復減數分裂。而Cx-43基因缺失或抑制的小鼠則表現為卵母細胞數目減少，顆粒細胞增殖障礙，以及受孕能力的減弱。顆粒細胞間的縫隙連接受促性腺激素的影響，FSH在促進顆粒細胞增殖的同時也會促進Cx-43的表達，排卵前的LH則抑制Cx-43，導致顆粒細胞之間、顆粒細胞與卵母細胞之間的連接網絡解體，有助于排卵的發生。

二、始基卵泡生成后的三種不同命運

始基卵泡生成之后，總體有三種不同的命運，分別是：

1.終身保持靜止狀態，不生長也不被募集與選擇，其意義是維持始基卵泡池的穩定及女性的卵巢儲備能力。

2.在女性胚胎期及生長發育過程中，直接由靜止期的卵泡進入凋亡過程及閉鎖狀態，這類卵泡的存在促進了女性生殖能力的老化。

3.僅有非常小的一部分始基卵泡被多種生長因子及激素類物質激活，進入生長狀態，生長為初級卵泡、次級卵泡，甚至有可能被募集、選擇與優勢化而完成排卵的過程。始基卵泡的這三種命運轉歸，保持靜止、凋亡閉鎖及繼續發育之間的平衡對于卵巢功能及女性生殖能力的維持具有至關重要的意義。

三、活化發育的調節機制

（一）神經、內分泌及局部調節因子的介紹

雌性哺乳動物的每個月經周期都會有一批始基卵泡被激活并開始生長，然而相對整個始基卵泡池，被激活的卵泡只是很小一部分。始基卵泡被激活的過程是通過神經-內分泌作用，以及卵母細胞和顆粒細胞的自分泌及旁分泌作用實現的，該過程受多種因素的調控，包括神經因子、內分泌因子（促性腺激素等）及卵巢局部的小分子（類固醇激素、生長因子和細胞因子等）。

1.神經源性因子

卵巢中最先啟動生長的卵泡往往是位于卵巢皮質并且緊鄰卵巢門處的始基卵泡，有學者通過動物實驗發現，卵巢門處有豐富的血管與神經末梢，此處的始基卵泡可以優先接觸到大量的神經遞質，如血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptides，VIP），可以通過誘導顆粒細胞內cAMP的大量生成，后者增強KitL相關基因的轉錄，使顆粒細胞分泌大量的KitL與位于卵母細胞表面的c-kit受體結合，激活卵母細胞，從而啟動靜止期始基卵泡的生長。除血管活性腸肽外，還有大量的神經遞質及神經營養因子被證明對于激活始基卵泡的生長有一定的作用，包括神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經營養素 -4（neutrophin-4）等，既可以促進神經纖維在卵巢內的生長，其本身也具有一定的激活始基卵泡的作用。有學者將新生雌性小鼠的交感神經切除，發現其卵泡發育不良及甾體類激素分泌下降。因此，有理由認為，多種神經源性的營養因子及神經遞質在始基卵泡啟動生長的過程中發揮作用。而具體的作用機制還有待進一步的探究。

2.生長因子

卵巢中存在著多種生長因子（growth factor，GF），在卵巢多種生理過程中發揮作用。生長因子是由不同細胞分泌的小分子多肽，大多全身各處都有分布，也有部分生長因子由卵泡分泌。對始基卵泡生長發育有作用的生長因子主要包括表皮生長因子類（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子超家族（transforming growth factor，TGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、生長激素（growth hormone，GH）、成纖維細胞生長因子 2（fibroblast growth factor 2，FGF2）、角化細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）等。研究發現在始基卵泡發育的過程中，顆粒細胞生長的啟動先于卵母細胞本身，因此認為顆粒細胞的生長和分化對于始基卵泡的激活起到關鍵的作用。

3.Kit Ligand/c-kit

Kit Ligand（KitL）是第一個被發現的可促進卵泡生長與發育的生長因子，在卵泡的多個過程中起重要作用，包括原始生殖細胞的生成、始基卵泡的激活、卵母細胞的生長、顆粒細胞增殖分化及防止卵泡閉鎖等過程。KitL由顆粒細胞合成，通常有KitL1與KitL2兩種形式，前者通常為可溶型，后者多為膜結合型，兩者作用相似。KitL可與位于卵母細胞表面的受體c-kit結合而發揮作用，c-kit屬于酪氨酸激酶受體。卵巢組織培養的實驗表明，向培養液中加入KitL后，始基卵泡被激活進入生長的比率明顯高于對照組，而加入c-kit抗體以后，又有大量始基卵泡停滯在靜止階段，被激活的數量下降，說明KitL與c-kit的結合可以有效地促進始基卵泡的生長。此外，有學者已經證明KitL與c-kit是通過激活酪氨酸激酶受體下游的蛋白激酶C及MEK通路實現的。

EGF可由卵巢自身分泌，可以使靜止期始基卵泡的顆粒細胞表達PCNA，促進其增殖和分化，進一步可促進啟動始基卵泡的生長和分泌類固醇激素。因此，EGF被認為是可以調節卵泡生長的重要分子。

IGF家族包括IGF蛋白及6種IGF結合蛋白（IGF-binding protein，IGFBP）。IGF的作用受其結合蛋白的調控，研究證實這6種IGFBP中有5種在人的卵巢中有表達。IGF-Ⅰ由顆粒細胞或卵巢外的體細胞分泌。在IGF-Ⅰ基因敲除的小鼠卵巢中，卵泡在竇前階段停滯發育。但是學者認為IGF-Ⅰ在卵泡形成與早期發育的過程中的重要性不如IGF-Ⅱ。IGF-ⅡmRNA被發現在所有發育階段卵泡的卵母細胞中高表達。并且不同于IGF-Ⅰ，女性的卵泡膜細胞及顆粒細胞均可表達IGF-Ⅱ。始基卵泡及竇前卵泡中的卵母細胞表面存在IGF的Ⅰ型和Ⅱ型受體，可與兩類IGF結合，通過不同的信號轉導途徑，激活抗凋亡基因，促進顆粒細胞的增殖和卵母細胞的生長，啟動卵泡的生長。IGFBP在初級卵泡和次級卵泡中大量表達，而在竇前卵泡及排卵前卵泡中則顯著減少。IGFBP也可與IGF結合，介導抑制信號，可抑制IGF的生物活性，因此認為IGFBP在早期卵泡的生長中主要起到減慢生長速率、維持卵泡池穩定的作用。

TGF-β超家族是一組功能不同、結構相關的分泌性異二聚體蛋白。由33個基因所編碼，包括TGF-β、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和激活素/抑制素（activins/inhibins）三大類。廣泛存在于體內各種組織器官中，在機體生長發育、物質代謝等多方面具有重要作用。TGF-β超家族中的各個成員在功能上可由一定的重復及協同，互相之間也有調節的作用。與始基卵泡生長發育相關的TGF-β超家族成員包括GDF-9、BMP15、抑制素、激活素及抗米勒管激素等。

GDF-9和BMP-15被認為是TGF-β超家族中對卵泡發育影響最大的因子之一，兩者在結構與功能上都十分相似。GDF-9和BMP-15均由卵泡中的卵母細胞在卵泡發育的整個過程中分泌，可以調節顆粒細胞的功能（如調節甾體類激素的分泌）、啟動始基卵泡的生長并促進卵泡在不同階段的發育以及最終的成熟，甚至在排卵、受精及黃素化過程中有著不可替代的作用。GDF-9是第一個被發現的調劑卵泡中多種關鍵分子作用的卵母細胞特異性分子，通過旁分泌的方式對早期卵泡的激活與生長發揮作用。在GDF-9基因缺失的小鼠模型中，始基卵泡的生成無異常，但卵泡停滯在早期發育的各個階段，并且顆粒細胞的增殖及隨后卵泡膜細胞的生成受到明顯的影響。在利用GDF-9對新生小鼠處理后，始基卵泡相比對照組大量減少，初級卵泡和次級卵泡增多，都說明GDF-9對始基卵泡生長的激活有作用，并可進一步影響隨后卵泡的募集。BMP-15又稱GDF-9β，可與GDF-9協同作用于顆粒細胞，促進后者的增殖分化，并可以刺激KITL基因的表達，共同對卵泡的生長及發育起到調劑的作用。實驗證明，BMP-15基因敲除的小鼠出現排卵及受精障礙，并認為BMP-15在初級卵泡向次級卵泡發育的過程中有較為關鍵的作用。研究表明，GDF-9和BMP-15均可與位于顆粒細胞表面的骨形成蛋白受體-Ⅰ、Ⅱ作用，通過TGF-β經典的Smad信號通路而發揮作用。

抗米勒管激素（AMH），由次級卵泡、竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細胞產生，在始基卵泡中沒有表達，但可以對始基卵泡向初級卵泡的轉化過程起到抑制的作用，是目前唯一一種對早期卵泡激活與生長進行負調節的分子。AMH敲除小鼠始基卵泡的形成與對照組無明顯差異，但出生后大量始基卵泡迅速啟動生長，成年鼠的卵巢內甚至看不到靜止期的始基卵泡。此外，AMH可以負向調節哺乳動物卵巢中芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成。AMH是實現卵泡之間相互調節的重要分子，生長期卵泡通過AMH對靜止期卵泡進行負反饋調節，對卵泡池平衡的維持，以及隨后優勢卵泡的選擇與成熟具有重要意義。

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）主要由始基卵泡、初級卵泡顆粒細胞及所有腔前卵泡的卵母細胞分泌，可與特異性糖蛋白130受體結合，通過JAK-STAT通路來調節體內多種組織細胞的生長、分化與凋亡。在卵泡的生長階段，卵泡液中LIF含量相對其他時期最高。體內與體外實驗均發現LIF可以在早期促進始基卵泡向初級卵泡的生長，并可以誘導KitL的表達，推測LIF是通過間接作用調節卵泡生長的。另外，有研究認為胰島素的存在可以增強LIF在始基卵泡生長過程中的促進作用，具體機制還有待進一步研究。

堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）定位于哺乳動物始基卵泡及初級卵泡，主要在早期促進卵泡的生長。在人類，bFGF主要由卵母細胞合成分泌，通過旁分泌作用與顆粒細胞、膜細胞表面的受體結合，參與卵泡生長中多個過程的調控，包括調節顆粒細胞的有絲分裂、甾體類激素的合成等。實驗發現bFGF具有與KitL相似的作用，可大幅減少靜止期的始基卵泡，增加生長中卵泡的比率，因此被認為是激活始基卵泡生長的分子之一，與KitL具有協同作用。

角化細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）屬于成纖維細胞生長因子的一種（FGF7），由卵巢中的早期卵泡周圍部分間質細胞（即早期被募集的前體膜細胞）以及竇卵泡的膜細胞合成，是一種28kDa的有絲分裂原，其受體為FGF受體的一種。KGF可與早期卵泡中在生長中的顆粒細胞相互作用，促進后者的增殖，并可以顯著促進始基卵泡向初級卵泡的生長。

（二）涉及的通路介紹

靜止期始基卵泡的激活包括始基卵泡顆粒細胞的增殖分化及靜止的卵母細胞進入生長狀態，顆粒細胞數目增多，形態由扁平狀變為立方狀。而卵母細胞不僅是體積的改變，多數研究認為其本身也對卵泡整體啟動生長的過程有關鍵作用。以下介紹始基卵泡激活過程中卵母細胞內的調節通路。

1.PI3K信號通路

PI3K信號通路是目前為止關于始基卵泡激活過程中研究最多的信號通路。其主要過程是PI3K-PTEN-AKT，最終底物是叉頭蛋白O3（FOXO3）。PTEN是PI3K的負反饋調節因子，可以抑制此通路的活性，Pten缺失的小鼠卵泡中卵母細胞過度并持續生長。FOXO3屬于叉頭轉錄因子超家族，是第一個被發現的PI3K作用靶點，可以調節始基卵泡生長的激活。研究表明在Foxo3基因缺失的小鼠，所有靜止期的卵泡均會在青春期進入生長，而Foxo3基因過表達時，卵巢儲備則一直被維持在穩定狀態，成年至老年鼠卵巢內依然存在大量始基卵泡，遠遠超過對照組。因此認為，FOXO3是一種維持卵泡靜止狀態的轉錄因子，PI3K-PTEN-AKT-FOXO3信號通路在調節始基卵泡激活過程中有重要意義，主要是通過負向作用、抑制激活、維持靜止而實現的。

2.mTORC1信號

mTORC1是一種序列保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要是在生長因子的作用下，調節機體多種細胞的生長和代謝過程，包括蛋白合成、核糖體生成調節等。在靜止期的始基卵泡中，過表達的mTORC1及其下游蛋白可以促使卵泡的過度激活。而隨后的研究發現，敲除mTORC1下游的蛋白則對始基卵泡的生長沒有明顯影響。目前認為mTORC1信號可以促進卵泡的激活，但對這一過程并不是必需的。

3.p27-CDK系統

p27蛋白是一種細胞周期的抑制蛋白，屬于CDK抑制物的Kip家族，存在于靜止的卵母細胞核中，對于維持始基卵泡的靜止狀態有重要意義。在對其他細胞的研究中發現，p27蛋白也受PI3K信號通路的調節，在卵母細胞中也發現，p27蛋白與FOXO3的表達無明顯的相關性，但同時敲除p27和Foxo3基因則會導致始基卵泡大量快速的激活與生長，認為p27-CDK系統和PI3K信號通路在始基卵泡激活的調節過程中并非完全獨立，具有協同作用。

4.其他

Nobox基因即新生卵巢Homebox基因（newborn ovary homebox gene，NOBOX），是最早報道的特異性表達于卵母細胞的調控始基卵泡激活的基因。隨后發現在卵巢中，無論是原始生殖細胞還是靜止期、生長中卵泡的卵母細胞中，都發現有Nobox的表達。Nobox缺失小鼠卵泡的生成正常但生長嚴重受影響，并發現Foxo3基因的下調，被認為是FOXO3及PI3K通路的調節因子。其他研究發現，Nobox敲除后多種卵母細胞基因的表達都受影響，包括Gdf9、Bmp15等。因此，Nobox基因可以通過直接或間接的途徑調節卵泡的生長。Sohlh1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1）為另一種生殖細胞特異性的可以調節靜止卵泡激活的基因，具有上調Nobox基因的作用。Sohlh1基因缺失的小鼠不能完成始基卵泡到初級卵泡的生長過程。另外，有研究發現WT1、pRb、myc基因等也參與了這個過程的調控。