第四章　超聲分子成像概論

第一節　超聲分子成像

超聲分子成像（ultrasound molecular imaging）是指將特異性配體連接到超聲造影劑表面，通過血液循環特異性地聚集于靶組織，觀察靶組織在分子或細胞水平的特異性改變，以此來反映病變組織在細胞、亞細胞及分子水平上的病理變化。它是近年來提出的新一代醫學超聲成像方法，在腫瘤、心腦血管等疾病的早期檢測和療效評價方面有重大應用前景。

（一）超聲分子顯像劑

超聲造影劑為直徑1～4μm，膜包裹氣體的氣-液乳劑。在超聲波照射下，微泡內氣體核心的強聲反射性能顯著增強了造影劑/周圍背景組織信號比。超聲造影劑由不同的膜材料（如磷脂、生物相容性聚合物、蛋白質）和氣體（如空氣、全氟化碳、六氟化硫及氮氣）合成。與空氣比較，高分子氣體溶解度低，使得微泡更穩定并能在血液循環中停留更長的時間。

超聲分子探針是一類能特異性識別和結合于靶組織的配體、抗體等與超聲造影劑以特定方式相結合而形成的復合物。用于分子成像的靶向配體可以是抗體和多肽，可以在合成微泡的過程中或微泡合成后被直接整合于膜殼中，或在分子末端連接聚乙二醇臂。

超聲分子探針中造影劑分類

（1）按粒徑大小不同，超聲造影劑可以分為微米級超聲造影劑和納米級超聲造影劑。

微米級超聲造影劑為常規超聲造影劑，平均直徑約1～4μm，小于紅細胞，可以自由通過肺循環，但不能穿過正常毛細血管基底膜，是一種血池顯像劑。因此，微米級超聲造影劑應用范圍較局限，常用于血管腔內一些伴隨有細胞表型改變的疾病，如動脈粥樣硬化斑塊、炎癥、腫瘤血管、缺血再灌注損傷、移植排斥反應等血管或者淋巴管上異常的靶分子成像。

納米級微泡的問世對于超聲分子影像學發展是一個巨大的進步，與普通造影劑相比具有以下優勢：①極強的穿透力。普通造影劑微泡不能透過血管內皮間隙，而納米級造影劑能夠穿透血管壁到達血管外，實現靶組織血管外顯像；②聚集成像。粒徑小于700nm的造影劑可以透過腫瘤新生血管，在腫瘤組織中聚集，從而達到了靶組織增強和背景噪聲低的目的；③納米微泡表面積相對較大，吸附能力強，具有良好的生物親和性；④穩定性較強，可以在血液循環中存留更長時間。目前已有的研究證實，粒徑在500nm左右的納米脂質超聲微泡能夠穿過腫瘤血管進入組織間隙，Wang等的研究證實攜載前列腺特異性膜抗原單抗的靶向納米級超聲微泡能使前列腺癌移植瘤顯影信號的強度高于普通納米級超聲微泡。

納米級微泡主要包括三大類：①含氣納米微泡，直徑小于1μm，由磷脂包裹全氟化碳氣體組成，比如Gao等以針對卵巢癌的CA-125抗體共價連接于納米微泡表面，結果顯示靶向微泡造影信號較非靶向微泡高2倍。但是含氣納米微泡的缺點在于微泡直徑的縮小不僅影響了顆粒的聲反射能力，也使得含氣微泡在溶液中的穩定性降低，比如Gao等的研究中顯像只能在注射造影劑后10分鐘內進行，這一缺點限制了臨床轉化；②相變納米液滴。由脂質、蛋白或聚合物膜包裹沸點低于人體溫度的氟碳化合物液體顆粒，注入人體后仍處于液態，在受熱、超聲輻照或光照作用下，內部液體氣化并體積增大，使顆粒具備良好的聲反射特性；③產氣納米顆粒。納米顆粒在特殊微環境下產生具有聲反射特性的氣體，如Min等的研究中，基于PLGA的產氣納米顆粒在碳酸酯共聚物水解時可產生CO₂氣體，納米顆粒靜脈注射于荷瘤小鼠后在腫瘤組織聚集并產生CO₂氣體，在長達4小時內可以探測到氣體強回聲。

（2）按不同的功能，超聲分子探針又可分為單功能（只用于超聲分子顯像）、多模態。后者包括：①超聲-磁共振成像。如Liu等以“一鍋合成法”聚合反應合成了含有超順磁性氧化鐵納米顆粒、基于PBCA的聚合物微泡，研究表明上述微泡可以同時用于超聲和磁共振成像；②光聲成像。光聲成像基于使用短脈沖激光束激發組織發色團，后者導致組織的熱彈性膨脹并發射寬帶超聲，超聲換能器可捕獲發射的超聲波并用于圖像重建。這使得光聲成像具有光學成像的分子敏感性和超聲成像的空間分辨力；③聲光成像。聲光造影劑是通過在微泡合成時或直接向已合成的微泡中摻入光學成像造影劑（如有機染料）而制備的。聲-光造影劑探針可以量化靶向配體在微泡的表面覆蓋度，也可用于研究微泡與生物靶標的結合動力學和靜脈內給藥后氣泡的轉歸；④超聲-核素顯像。放射性標記的微泡通常用于研究靜脈注射后微泡的生物分布。與光學成像相比，放射性核素成像技術能更好地進行定量分析。然而，光學成像和放射性核素成像的問題在于無法區分完整的微泡及其片段。

（二）超聲分子顯像劑的配體

通常連接于靶向超聲微泡上的配體主要包括多肽、蛋白質、多聚體、抗體、納米抗體。理想的配體要求具備以下條件：①高度的靶向特異性：配體的特異性對于靶向對比超聲成像來說至關重要，配體的特異性保證了其靶向黏附于特異靶點，以實現對感興趣區域的顯像；②快速的結合和良好的抗解離能力：理想的配體要有能夠耐受血流切應力的能力，以實現同靶點快速牢固地結合，這樣才能保證在注射造影劑后迅速而長時間的顯影；③非免疫原性：選擇配體時，應選用人源化的抗體片段或非免疫原性的配體以避免免疫反應；④穩定性：不僅要求配體在存儲過程中要保持穩定性，還要求其在注入體內后仍能保持穩定性，以實現對靶組織的良好顯影。

目前的研究傾向用小分子配體取代大分子抗體與微泡連接構建靶向微泡，已有研究報道精氨酸-精氨酸-亮氨酸（arginine-arginine-leucune，RRL）肽、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginineglycine-aspartate）肽、P選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）蛋白的糖硫肽片段構建靶向微泡。

（三）微泡與配體結合技術

靶向微泡造影劑具有靶向性的關鍵在于將選擇性配體連接于微泡外殼，其制備是一個相當復雜的過程。過去30年，配體連接化學主要在靶向核素和MRI造影劑領域有很好的發展和應用。配體與微泡的結合需考慮以下因素：這種連接不能削弱配體與靶點的結合能力；必須選用可經靜脈給藥的配體；微泡表面連接的配體密度要足夠大。目前常用的微泡-配體連接方法有以下幾種：

1.靜電吸附法

在不添加任何外在化學成分的情況下通過自身離子鍵、物理吸附等方法將靶向配體或靶向配體混合物直接連接到微囊成分上，該方法制備靶向超聲造影劑過程簡單，不需改變造影劑制備過程，僅在制備完成后通過調節溶液pH值、離子強度、溫度、時間將靶向配體吸附到微囊表面，得到靶向超聲造影劑。

2.偶聯劑連接法

偶聯劑是一類兩端帶有不同性質基團的物質，它的分子中一部分基團可與有機分子中一部分基團或與無機物分子特定基團反應，形成化學鍵，另一部分基團可與有機分子反應，形成牢固黏合。偶聯劑連接方式：一種是先將配體共價結合到偶聯劑上，微泡形成后這些配體和偶聯劑就鑲嵌于囊上；另一種是先將偶聯劑嵌入囊中，微泡形成后再結合配體。

3.橋連接劑結合法

又稱共價結合法，與偶聯劑連接法的區別是此法首先引入必要的化學基團對橋連接劑進行結構修飾形成功能基團，而橋連接劑本身屬于微囊構成成分，微泡形成后激活功能基團，然后與配體結合。其核心是磷脂衍生物（或PEG-磷脂）的活化羧基與配體分子的氨基形成酰胺連接。其優點是多數抗原的IgG單抗已商品化；IgG分子序列中賴氨酸較多，其氨基殘基可隨機黏附于微泡表面而不會降低抗體與抗原的結合力。缺點是：抗體消耗量大，因為酰胺化反應需要弱堿性環境，而多數活化磷脂在弱堿性條件下發生水解作用（副反應）無法與抗體結合，只有少數未水解的脂類可連接抗體，因此必須加入超量的抗體才能保證微泡表面連接的抗體密度足夠大，可用于臨床研究。

4.非吸附性非共價鍵結合的免疫化學固定

通過一種非共價非吸附性固定抗原抗體方法使脂質微囊富集于病灶，典型代表為生物素-親和素（Biotin-avidin）連接法。該方法適用于體外研究和動物實驗。其優點是在研究的初期階段可快速將各種新配體連接于微泡，目前大量生物素化的靶向配體（如單抗）已商品化；所需（生物素化）配體量少，節約費用，調控配體與微泡的比例可使絕大部分配體連接到微泡上。限制其臨床應用的缺點是鏈霉親和素是一種異體蛋白，可引起人體免疫反應；合成的多個步驟需反復多次的離心漂洗，較煩瑣。

（四）超聲分子成像定量技術

超聲分子成像的前提是靶向結合的微泡信號和背景信號之間有顯著差別。低機械指數成像可以避免破壞微泡。微泡在超聲波正向和負向壓力的作用下膨脹和收縮而發生直徑改變，產生非對稱性非線性振蕩，后者產生諧波和次諧波，利用不同的顯像技術可以將諧波信號（如脈沖反轉和幅度調制）提取出來，提高顯像的信噪比。研究表明這些技術甚至可以探測到單個微泡。上述超聲造影成像技術已經用于臨床非靶向超聲造影。不同于非靶向性顯像，超聲分子成像需要將結合于靶分子的小劑量造影劑從周圍背景和循環中與未與靶分子結合的微泡信號識別開來。其中一種方法是靜脈注射后10分鐘成像，等待血管內游離微泡清除。這一方法直接，也可以進行定量分析，但前提條件是靶區有足夠的靶向微泡，缺點是不利于進行長時間動態監測，因為靶向微泡會隨著時間的推移而降解。

破壞-再灌注成像是一種更適合定量分析的技術。通過采集破壞微泡前后的圖像并扣除代表循環內游離微泡的再灌注微泡信號，可以得到靶向結合的微泡信號。這一技術的缺點在于后處理耗時，另外，微泡破壞過程中的超聲空化效應可能導致生物學損傷。

現有的超聲成像技術致力于不需要破壞微泡的快速、實時、易于臨床轉化的數據定量分析方法。其中一個概念是基于閾值、從單個成像像素提取的“微泡駐留時間”，后者可以將靶向結合的微泡與循環中的游離微泡信號識別開來。另外一種新的概念是利用聲輻射力的定量技術得到殘留-飽和信號比（聲輻射力脈沖作用前后信號比），這一定量技術不受超聲衰減和系統設置的影響。Rychakk等和Frinking等的研究分別證實，應用聲輻射力使得P-選擇素特異性微泡與股動脈炎性部位結合增加20倍，VEGFR2靶向微泡（BR55）在實驗性大鼠前列腺癌血管中的結合也得到了增強。

（五）超聲分子成像臨床應用領域

普通超聲微泡經靜脈注射進入人體后會被循環中的血液迅速稀釋，到達特定部位的濃度很低，超聲分子成像需對普通微泡進行特殊的靶向微泡協助成像。靶向微泡體內靶點目前局限于血管內皮，主要用于炎癥、腫瘤血管生成、血栓、缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）損傷等分子成像研究，在了解疾病發生的分子機制、指導腫瘤治療、研發新的治療靶點和藥物等方面發揮重要作用。

1.炎癥

炎癥是采用靶向微泡造影劑觀察的最佳病變區，其發生和發展的病理過程均在微循環中進行，而微泡亦存在于微循環內，微泡在聲學特性保持不變的情況下被激活的中性粒細胞和單核細胞黏附并吞噬，因此可以用來發現炎癥的發生部位。

2.心肌缺血

研究發現P-選擇素可作為一種特異性的缺血記憶成像靶標。Kaufmann等用生物素-親和素-生物素（biotin-streptavidin-biotin，BSB）配體橋連技術，制備攜帶抗P-選擇素單克隆抗體靶向超聲微泡，用于評價心肌缺血-再灌注損傷。P-選擇素靶向超聲微泡能在心肌壞死前確定缺血心肌的存在，并能明顯增強微泡的成像效果。Bettinger等作了進一步研究，制備了攜帶重組P-選擇素糖蛋白配體（recombinant P-selectin glycoprotein ligand-1 analogue，rPSGL-Ig）的靶向超聲造影劑，在實驗過程中發現，用重組P-選擇素糖蛋白配體進行心肌成像時，I-R損傷心肌聲像圖的回聲強度明顯增高，是非特異性超聲造影劑的20倍。

3.評價心臟移植后的急性排斥反應

心臟排斥反應的病理生理主要為內皮功能的異常，其特點表現為白細胞黏附因子的炎性上調，促使血液中白細胞經血管壁進入炎性區。發生急性心臟排斥反應時，內皮細胞上有ICAM-1的過度表達，若在此造影劑外衣上結合抗ICAM-1抗體，經外周靜脈注入造影劑后，則在心臟排斥區通過抗ICAM-1抗體與內皮細胞上的ICAM-1相結合，促使超聲造影劑在排斥區滯留，局部造影劑濃度增加。因此，超聲分子成像可利用攜帶細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的靶向微泡評價心臟移植后的急性排斥反應。此外，通過攜帶黏附素細胞黏附分子1（mucosal addressin cell adhesion molecule-1，MAdCAM-1），靶向微泡造影劑還可非侵入性、準確地診斷及評估炎性腸病。

4.血栓

在血栓形成過程中，血管內膜受損，內皮下膠原暴露，激活血小板和凝血系統，血小板的黏附、活化以及纖維蛋白原介導血小板間的大量聚集在血栓形成過程中起著關鍵的作用。活化的血小板膜表面高濃度表達一些糖蛋白整合素受體，如血小板膜糖蛋白受體（GlycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）、整合素受體等。MRX-408 脂質微泡（aerosomes）是一種GPⅡb/Ⅲa受體靶向造影劑，其表面連接了一個可以被GPⅡb/Ⅲa受體精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結合位點識別的寡肽序列，故可用于靶向性血栓顯影。Unger等報道MRX-408脂質微泡可結合特異性寡肽，與活化血小板的GPⅡb/Ⅲa受體具有強的親和力。顯微鏡下觀察發現，微泡可特異性地結合到血凝塊上，這些微泡不僅被血栓周邊或表面攝取，而且吸收到血栓塊的深部。該研究者認為，相對于陳舊性血栓，新鮮血栓有更多表達GPⅡb/Ⅲa受體的血小板，可黏附更多的微泡，因此，MRX-408可有助于新鮮與陳舊性血栓的鑒別。

5.動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）

AS的形成是動脈對血管內膜損傷作出炎癥-纖維增生性反應的結果。從脂紋到纖維斑塊和粥樣斑塊，乃至不穩定斑塊的生成、破裂和血栓形成，始終都有各種炎癥細胞和大量炎性遞質參與。炎癥反應中，內皮細胞表達細胞膜黏附蛋白免疫球蛋白、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、ICAM-1和選擇素 E、P、L（E-selection，P-selection，L-selection）家族等明顯升高，因此，若以這些分子為靶點可實現對粥樣硬化斑塊的良好顯影。Villanueva等利用構建的靶向ICAM-1的微泡，作用于培養的正常或由白介素活化的冠狀動脈內皮細胞，熒光顯微鏡定量發現，靶向組內皮細胞ICAM-1微泡量是非靶向組的40倍。Kaufmann等以VCAM-1為靶點同樣實現了對動脈粥樣硬化區域的良好的靶向顯影。李馨等建立腹主動脈粥樣硬化兔模型，分別經兔外周靜脈注射白蛋白微泡及攜帶CD54的ICAM-1單克隆抗體靶向造影劑，造影后血管內膜、粥樣斑塊峰值密度與造影前基值相比均有增加。攜帶CD54靶向造影劑與普通造影劑相比，對內膜及斑塊有更強的靶向顯影價值，免疫組織化學檢測也驗證了這一點，同時可發現普通造影劑所漏診的弱回聲斑塊，從而提高超聲診斷的敏感性。

6.腫瘤和新生血管

血管新生（angiogenesis）是指在機體生長發育過程中或創傷修復、缺血缺氧和炎癥等情況下，原有微血管內皮細胞經過生芽、遷移、增殖與基質重塑等形成新毛細血管的過程。整合素家族是一個內皮細胞膜蛋白家族，它是一種跨膜黏附受體，作為含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽的細胞外基質蛋白的黏附受體，能夠控制腫瘤血管內皮細胞的增殖和存活。α_Vβ₃受體是整合素家族中最重要的一種分子，它在靜息細胞內幾乎不表達，在平滑肌細胞上也僅有少量的表達，而在腫瘤新生血管和腫瘤細胞中均高表達。因此，利用作用于α_Vβ₃的靶向微泡將可實現腫瘤新生血管的顯影。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達與血管形成程度之間有緊密的聯系。通常情況下，單獨的VEGF表達水平處于靜息狀態，只有當它與血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結合后才能發揮作用。其中，VEGFR-2是VEGF發揮功能的主要受體，在多種實體腫瘤中過度表達，其活性與腫瘤的轉移和保持血管的完整性有關，是腫瘤新生血管內皮的分子標志物。因此，利用靶向作用于VEGFR-2的靶向微泡也可以實現腫瘤新生血管的顯影。

Willmann等將攜帶抗VEGFR-2單抗的脂質微泡用于評價腫瘤血管新生，在成功復制大鼠膠質瘤和小鼠血管肉瘤模型的基礎上，注入靶向和非靶向超聲微泡，觀察到在兩種不同的腫瘤模型中靶向微泡的信號均要明顯強于非靶向微泡。目前，雙靶向微泡的制備已經取得了成功并應用于腫瘤血管新生的評價。Willmann等成功制備同時攜帶抗VEGFR-2單抗和抗α_Vβ₃單抗的雙靶向微泡，并將其用于評價人卵巢癌模型。結果顯示雙靶向微泡的信號強度要明顯強于二種不同的單靶向微泡。雙靶向微泡造影劑的出現大大地提高了靶向超聲分子成像識別腫瘤血管新生的敏感性，更加有利于腫瘤的早期發現和治療效果的動態監測。Anna等通過復制小鼠乳腺癌2LMP細胞模型，成功將α_Vβ₃、P-選擇素和VEGFR-2進行整合，通過超聲分子成像多靶點微泡造影來評價早期腫瘤的抗血管生成治療。

對于腫瘤性疾病來說，及早顯示新生血管能早期發現腫瘤及微小轉移灶，有利于腫瘤患者的治療；而動態監測新生血管則可以評估抗腫瘤治療的效果。有研究經靜脈注入表面偶聯單克隆抗體或Echistatin分子（一種可與表達在新生血管內皮細胞特定分子結合的解離素）的脂質體超聲微泡，然后通過活體顯微鏡發現，Echistatin和單抗包被的脂質體微泡緊密黏附在微血管內皮上。在此基礎上，他們給大鼠皮下注射由腫瘤分泌的膠狀物質，造模10天后，注入靶向超聲微泡造影劑，超聲發現微泡量與新生血管數密切相關。

雖然超聲微泡技術具有其他技術無法比擬的優點，如無創性或微創性、靶向性和可重復使用性等。但是，這種新技術目前仍有許多有待解決的問題：①超聲微泡與靶向分子的偶聯技術尚需進一步完善，這是超聲分子影像研究的基礎；②改善微泡化學組成，以延長微泡在靶器官中的停留時間；③進一步闡明靶向微泡的聲學特性；④超聲分子探針的安全性及如何向臨床應用轉化的問題；⑤拓展靶向超聲微泡的應用領域。盡管目前還存在許多難題，但隨著超聲分子影像學的發展及多學科的交叉融合，超聲造影劑將在疾病的診斷和治療中發揮更大的作用，具有廣闊的應用前景。

第二節　超聲靶向破壞微泡釋放藥物

藥物攜載近年來迅速發展，是目前臨床醫學重要的研究領域之一。目前大多數靶向制劑尚處于試驗研究階段，其發展還有很多問題有待解決，如脂質體靶向系統存在靶向分布不理想，自身穩定性欠佳等缺點；磁性制劑尚處于研究開發階段，使用磁場不易聚焦，很難達到靶向要求等。因此，如何將治療藥物安全、高效、靶向性地導入人體內特定器官、組織并在靶細胞內起作用是目前研究重點。超聲波具有良好的組織穿透性，且能夠靈活聚焦于病灶局部，利用其進行藥物靶向釋放的研究日益備受關注。

一、超聲靶向破壞微泡釋放藥物的機制

超聲靶向破壞微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）釋放藥物是近些年研究的熱點。超聲介導藥物靶向遞送系統是局部或全身給予攜帶藥物或基因的微泡，當超聲微泡到達特定組織時，超聲波破壞攜帶藥物的微泡，通過空化效應在靶器官局部釋放藥物，達到定向治療的目的（圖4-1，圖4-2）。

超聲波空化效應是指存在于液體中的微氣核空化泡在聲波的作用下振動，當聲壓達到一定值時發生的生長和崩潰的動力學過程。空化效應分為兩類：穩態空化效應和瞬態空化效應。穩態空化指微泡在超聲作用下沿著平衡半徑左右多次振蕩，在每一個振動微泡周圍的不均一環狀區域將產生直徑較小的穩定、均勻的微流，在此過程中無微泡的破裂。隨聲強的增大，空化核將隨著超聲周期相而膨脹、收縮及爆破，最后在瞬間內爆階段，微泡釋放出內部聚集的巨大能量，并伴有強大沖擊波、高速微射流和自由基的產生，此為瞬態空化。研究表明，瞬態空化作用通過以下機制促進藥物釋放：

（一）提高細胞膜通透性

細胞膜是治療藥物進入細胞需要克服的屏障之一，細胞膜通透性改變是藥物治療的前提。超聲照射可使組織和液體內存在的微氣泡發生空化效應，在細胞膜上產生一過性的空隙，即聲孔效應，這種小孔有利于藥物進入細胞內，增強藥物療效。超聲造影劑微泡的加入增強空化效應，降低空化閾值，因而明顯增加藥物進入細胞。

（二）提高血管通透性

空化作用通過以下不同機制改變血管通透性：①在血管內皮細胞表面形成瞬態孔隙即聲孔作用，促進大分子吸收進入細胞內；②破壞血管內皮完整性，使大分子通過細胞間隙進行轉運；③通過超聲輻照產生的熱效應增加磷脂雙分子膜的流動性；④刺激細胞內吞攝取作用，促進細胞內遞送。

（三）增強細胞內吞和細胞外泌作用

微泡空化對細胞內反應的影響常被忽略，由于人們普遍認為細胞膜聲孔效應和機械破壞血管完整性為促進藥物靶向遞送的主要機制。然而最近研究表明，與細胞接觸的振動微泡產生的機械擾動可改變細胞膜電位，刺激細胞內吞作用。

二、UTMD釋放藥物影響因素

UTMD釋放藥物受以下因素的影響：①微泡攜帶藥物的方式，即藥物是否與微泡混合或負載于微泡上；②微泡和藥物給藥途徑；③超聲參數；④治療的時相性。

（一）微泡與藥物直接混合

微泡與藥物混合注射是UTMD介導藥物釋放的方法之一，其優點之一是可以應用市場上可以購買得到的臨床級微泡如Optison，Definity，Lumason和SonoVue。Sorace等以Definity混合化療藥物注射于小鼠乳腺癌模型后進行超聲輻照（1.0MHz，脈沖重復時間為5秒，機械指數0.5，20%占空比，輻照時間5分鐘）。治療3周后，腫瘤顯示40%抑制率，與單純藥物治療組相比壞死率更高。Wang等2013年注射混合了自殺基因（HSV-TK）的SonoVue，超聲輻照（機械指數1.2，輻照時間10分鐘）后，小鼠卵巢癌TKmRNA表達上升47倍，凋亡率上升2倍。

直接混合的缺點在于：①一些藥物或RNA會快速降解；②有可能會增加其他器官的毒性（而不是聚集于普通微泡常被清除的臟器，如肝臟或脾臟）。為了解決這個難題，人們試圖修飾超聲微泡表面，采取不同途徑將治療藥物連接于微泡或整合入微泡的膜內。比如藥物包被于膜內，溶解于氣體和膜之間的脂質層或與微泡表面相連。然而，這種方法藥物負載率常常很低。為了提高負載率，人們試圖將包載了藥物的脂質體或納米微泡連接于微泡膜上。

（二）藥物和微泡的給藥途徑

藥物和微泡的給藥途徑包括靜脈注射，瘤內注射以及腹腔注射，瘤內和腹腔注射，可以得到局部高濃度釋放，但是具有創傷性。

1.大多數動物實驗中微泡和藥物都是經靜脈注射。缺點是可能存在潛在的全身毒性，如果是基因轉染，可能導致藥物在循環里面的迅速降解。這兩個缺點都可以通過將藥物直接連接于微泡或將藥物負載于納米顆粒而得以克服。全身給藥的另外一個缺點為對于一些乏血供腫瘤，藥物釋放效率可能較低，因為這一途徑有賴于腫瘤內有足夠的血管以保證足夠量的微泡和藥物懸浮于靶區域。

2.瘤內注射早期的動物實驗證實微泡輻照后可以提高藥物釋放。主要優點在于該方法局部藥物釋放濃度高，全身毒性作用低。但是，位置較深的病灶無法接受局部注射，而且該方法為有創性。

3.腹腔注射適合腹腔內病變或伴隨腹腔轉移的病灶。微米級微泡經腹腔注射后可以在腹腔內穩定存在較長時間而被淋巴系統清除。Pu等向小鼠卵巢癌腹腔轉移模型注射針對LHRH受體的載紫杉醇微泡，微泡特異性結合于表達LHRH的腫瘤細胞，超聲輻照后藥物被選擇性釋放于腫瘤部位。該治療方法造成高達2倍的細胞凋亡率，治療組小鼠平均存活時間延長了37～47天，腫瘤血管生成減少了55%。

（三）超聲輻照參數

很多研究成功應用臨床超聲顯像設備進行了藥物釋放試驗，但是藥物釋放效率各報道互不一致。目前尚無明確的超聲輻照參數標準。到目前為止，用于藥物釋放的臨床診斷用超聲儀器尚無標準化的超聲輻照參數，原因可能為這些儀器無法進行標準化的參數調節。這使得在這些儀器上無法進行系統化和定量的優化藥物釋放研究。優化超聲輻照參數有助于提高治療效果。為了確定有效釋放的優化條件，一些研究應用可以自由設定超聲參數的定制的超聲設備，以比較藥物釋放結果，并且在體外細胞水平和整體動物水平均進行了大量參數試驗。以下是文獻報道的體內藥物釋放的參數條件：

1.超聲頻率

0.4～3MHz。造成空化效應所需要的壓力域值隨著頻率的減低而減低。超聲強度：0.3～3w/cm²。這一范圍接近或高于診斷超聲（0.1～100mW/cm²），但是低于高強度聚焦超聲。這使得向腫瘤內釋放藥物時對正常組織的損傷最小化。

2.機械指數

0.2～1.9。機械指數的定義為負壓峰值與中心頻率平方根的比值，它指示發生空化效應的可能性。空化效應發生的可能性隨超聲強度的提高和頻率的減低而增加，聲場的機械指數也是臨床超聲診斷儀器的安全參數之一。FDA規定臨床診斷超聲機械指數上限為1.9。人們認為機械指數低于0.7不會發生空化效應。但是，微泡的存在致使發生空化效應的域值大大降低，這使得UTMD釋放藥物可以在機械指數低于1.9的水平得以實現。

3.占空比

＜ 1%～90%。占空比表示脈沖超聲發射時間所占的比例。不同文獻報道所用的占空比不一致，常常取決于所用的超聲強度。總的來說，高占空比聯合高強度可以產生熱效應。因此，應用高強度超聲時，占空比會減低以免產生熱效應。

4.超聲輻照持續時間

10秒～30分鐘。持續時間需足夠長以破壞微泡。但是，為安全起見，輻照時間應盡可能短以減輕對組織的損傷。大多數研究者采用過1～5分鐘的輻照時間。

（四）治療策略

治療策略包括給藥時間順序，UTMD治療時間，治療時間和重復治療周期之間的時間間隔可能對治療效果產生巨大影響。由于UTMD在數秒和數小時提高通透性，治療藥物在超聲輻照后的不同時間點給藥會導致完全不同的治療效果，比如Zhao等2012年針對乳腺癌小鼠的治療中，在輻照前2小時，輻照后2小時或超聲輻照的同時注射載阿霉素的脂質體。輻照后2小時給藥組抑瘤率最低，這表明藥物釋放應于輻照后2小時以內進行。了解治療窗口期對于UTMD治療腫瘤至關重要。Liao等研究了治療間隔時間長短對療效的影響，研究以UTMD釋放endostatin和calreticulin給皮下種植肝細胞癌模型，第一組動物每周輻照給藥一次，第二組動物每天輻照給藥，觀察4周后發現第一組動物治療效果顯著好于第二組，因此研究認為血管生成抑制治療每周一次較短時間高劑量更為有效。

三、UTMD釋放藥物的應用領域

（一）在心血管系統的應用

1.超聲溶栓治療

Slikkerveer等2012年在阿姆斯特丹開始了應用超聲溶栓治療ST段抬高型心肌梗死的臨床試驗研究。他們對10例初次發生ST段抬高型心肌梗死的患者以超聲輻照微泡聯合注射tPA進行了溶栓治療，研究表明治療有效，并且副作用發生率與安慰劑組沒有顯著差異。另有研究表明超聲輻照微泡可以擊碎冠脈和腦血管中的致病血栓。

2.抑制動脈新生內皮形成

在經皮介入治療后數天和數周，主要的擔憂是患者新生內皮的形成和動脈損傷部位的炎癥，在這種情況下再狹窄的發生率高達25%～50%。日本學者應用UTMD釋放細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）siRNA進行治療，通過抑制ICAM-1，血管受損的小鼠顯示有限的炎癥反應和新生內皮形成。

（二）在腫瘤治療中的應用

大量研究顯示UTMD介導的藥物釋放可成功治療不同腫瘤。這一技術可以提高腫瘤化療效果，提高了藥物在腫瘤內的生物學分布，扭轉了一部分腫瘤的耐藥。有人提出該技術可以作為腫瘤治療的新的輔助手段。

1.增強抑瘤效果

大量研究表明UTMD釋放藥物可以提高抑瘤效果，抑制腫瘤生長，促進腫瘤凋亡和壞死，抑制血管生成，調節相關蛋白的表達。比如，Goertz等發現靜脈注射化療藥物多西塔賽和微泡至前列腺癌腫瘤模型，輔以超聲輻照，治療后24小時腫瘤壞死率高于單純多西塔賽治療組4倍。UTMD釋放多種藥物可以進一步提高抑瘤效果，Yu等對皮下移植肝癌模型的研究表明，UTMD轉染兩種質粒HSV-TK/GCV和基質金屬蛋白酶3組織抑制劑，與單一一種基因轉染相比，抑瘤率提高30%。UTMD治療轉移性腫瘤同樣有效，Park等的研究表明，UTMD經顱釋放曲妥珠單抗，與單純靜脈注射曲妥珠單抗組比較，UTMD釋放藥物組可以提高動物生存時間，顯著抑制腫瘤生長，有些動物甚至可以完全緩解。

2.減輕化療藥物毒性

化療最為嚴重的副作用是其全身毒性，包括心臟毒性和骨髓抑制。Cochran等以UTMD輻照負載阿霉素的微泡于皮下種植肝臟腫瘤模型，與同劑量直接注射藥物組相比，腫瘤組織內藥物濃度顯著增高，心肌組織內藥物濃度減低50%。這一研究結果具有很好的臨床應用前景：一方面可能減低患者全身副反應，另一方面可以減輕一些需要應用昂貴化療藥物治療患者的經濟負擔。

3.扭轉耐藥

對于很多腫瘤，藥物抵抗是導致治療失敗的常見原因。盡管吉西他濱是胰腺癌的一線化療藥，但75%的胰腺癌患者對吉西他濱耐藥。乳腺癌中，高于60%～70%的腫瘤患者對蒽環類化療藥物耐藥。耐藥常常是由于腫瘤細胞部分受體表達上調，抑制細胞對藥物的攝取，將藥物自胞質泵出細胞外。Yan等研究發現UTMD釋放藥物可以顯著下調乳腺癌細胞內p-糖蛋白（多藥耐藥相關蛋白泵）的表達。阿霉素耐藥的MCF-7乳腺癌細胞經阿霉素脂質體微泡輻照后，細胞對阿霉素攝取增加，細胞核藥物濃聚增加，藥物釋放減少，細胞內P-糖蛋白水平顯著減低。

4.其他腫瘤治療方案的輔助治療

輔助化療或放療常常用于術后減少局部腫瘤復發和腫瘤轉移。UTMD介導下將藥物釋放于手術切除面有可能成為減少腫瘤局部復發率的多模態治療方法的一部分。Sorace等提出UTMD介導釋放西妥昔單抗可以作為小鼠頭頸部腫瘤手術切除后的輔助治療措施，治療后60天，UTMD釋放藥物組未出現復發，但是單純手術全切后的動物66%出現復發。

（三）UTMD在神經系統的應用

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）由腦毛細血管內皮細胞之間的緊密連接、基底膜以及毛細血管周圍的星形膠質細胞突起構成，其中血管內皮細胞及其緊密連接是BBB的重要形態學基礎。98%以上的治療藥物難以通過BBB進入腦內，只有極少部分具有高脂溶性和分子量小于400～500D小分子物質能穿過BBB。對于危及生命的中樞神經系統疾病如腦腫瘤、腦卒中、脊髓和腦部創傷、HIV感染等都沒有有效的治療方法。上述一些疾病可以用藥物、酶、基因或者大分子生物科技產物如重組蛋白進行治療，但是這些藥物都不能順利透過BBB。為促進中樞神經系統藥物釋放，人們試圖以鞘內或腦室穿刺直接給藥，或對藥物進行化學修飾，改變分子量大小和電荷，但是前者技術操作要求較高，且為有創性，后者研究進展緩慢，均難以廣泛應用于臨床。

1.聚焦超聲開放血腦屏障

以往文獻中，可用于開放血腦屏障的超聲波包括：聚焦超聲、診斷超聲（如經顱多普勒超聲）和低頻超聲（如頻率43kHz的超聲波）。但以聚焦超聲的應用最為廣泛和深入。1995年，Vykhodtseva等觀察不同參數下BBB的通透性改變及腦組織損傷情況。研究者發現高脈沖作用時間造成了出血和難以控制的組織崩解，并猜測這些BBB的破壞可能是由于空化效應所產生。隨著研究的深入，Hynynen等提出了使用聚焦超聲聯合超聲微泡Optison促使BBB的開放的新方法，研究表明該超聲聯合微泡對大腦組織的損傷微不足道。聚焦超聲開放BBB的優勢在于：在MRI影像設備的定位下，聚焦超聲可以“瞄準”靶點區，注射超聲微泡后精準開放目標區域血腦屏障和釋放藥物，而周圍的腦組織卻不受影響，最大限度地減少了藥物的毒副作用；更重要的是，在適宜的參數下，聚焦超聲聯合微泡所引起BBB的開放，是暫時和可逆的，即可以多次、重復給藥。

2.聚焦超聲聯合微泡開放BBB的時相

超聲聯合微泡輻照所致BBB的開放持續時間的長短因各種檢測方法的不同而不盡相同。以光鏡顯示BBB開放區腦組織損傷情況和電鏡檢查毛細血管內皮細胞緊密連接的開閉提示BBB可持續開放72小時。早期的研究常采用經典的示蹤劑伊文思藍（分子量為961D）觀察BBB開放情況，經靜脈注射后的伊文思藍立即與血漿白蛋白結合，形成伊文思藍-白蛋白復合物（ESA），并在血液中持續存在數小時。由于ESA分子量大，不能透過正常的BBB，超聲開放BBB后ESA通過BBB進入腦實質并使其染色，可應用分光光度計在最大吸收光譜635nm處檢測腦組織中的伊文思藍含量，判斷并定量檢測BBB開放的程度，有研究以此方法顯示超聲開放BBB的時間在15分鐘至數小時。該方法優點在于血腦屏障開放區域藍染，可直觀顯示BBB開放范圍，缺點在于需處死動物后檢測，無法在活體水平實時監測BBB開放。

增強MRI則能無創、實時監測BBB開放情況。在超聲輻照后立即以MRI增強掃描（T₁相），超聲輻照開放區可得以強化。Hynynen等以MRI增強顯影的方法報告開放持續的時間長度不一，一般照射當時的信號增強最大，之后即開始衰減，至3小時后所測得的信號強度只有最初的10%～20%，說明此時BBB的完整性已開始恢復，至5小時后再次掃描未能看到BBB的開放增強，由此認為輻照5小時后BBB就已經完全恢復。但他另一組的研究報道在6小時后還可見到MRI增強，至24小時未見強化。McDannold等做了更長時間的監測，發現72小時乃至4周后都沒有強化，這些研究說明了這種持續開放最長時間在24～72小時以內。另外，MRI監測UTMD開放血腦屏障需要磁共振兼容的超聲輻照系統（圖4-1）。

3.UTMD經顱釋放藥物種類

（1）UTMD開放BBB轉運單克隆抗體：

抗體可以用于一些腦部疾病的治療，比如針對人表皮細胞生長因子的單克隆抗體——曲妥珠單抗（赫賽汀），可以用于治療乳腺癌腦部轉移灶，抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗（美羅華）可以治療惡性淋巴瘤，針對Aβ肽抗體可以扭轉早期阿爾茨海默病遺傳缺陷。但是這些藥物因為分子量大，在中樞神經系統的應用受到限制。因此，如果采用靜脈途徑給藥，UTMD開放BBB有望提高上述藥物在局部的濃度。有研究以UTMD轉運多巴胺D4受體抗體，在10ms的脈沖作用時間，脈沖重復頻率1Hz，作用時間20秒，頻率680kHz的條件輻照腦部，在超聲波輻照區域的基底神經節的海馬和小細胞內可以檢測到抗體。同一研究小組使用相同的超聲輻照參數，成功地以超聲協同微泡促進赫賽汀透過BBB并于顱內釋放。另有研究將Aβ肽抗體成功轉運入TgCRND8阿爾茨海默病模型。

（2）轉運化療藥物：

BBB開放有助于化療藥物在腦部腫瘤的靶向釋放。關于化療藥物的轉運，首次報道的是轉運脂質體包裹的阿霉素，研究表明在10ms脈沖作用時間，PRF 1Hz，作用120秒，頻率1.5MHz及1.7MHz輻照條件下，大鼠腦內輻照部位阿霉素濃度較對側顯著提高，腦組織內的藥物濃度與微泡濃度呈線性相關，0.1ml/kg濃度下，組織中的藥物濃度可以達到1 000ng/g，如果能夠在腫瘤組織聚集，阿霉素濃度將足以產生臨床治療效果。

（3）轉運基因：

對于很多中樞神經系統疾病，基因治療具有非常好的臨床應用前景。但是由于治療基因分子量大無法穿過BBB，限制了該療法在這一領域的研究與應用。為了證實超聲微泡在中樞神經系統基因轉染中的應用價值，Huang等以超聲輻照微泡的方式將綠色熒光蛋白基因釋放入小鼠腦內，發現EGFP在輻照區神經元胞質內表達，該區域僅見少許紅細胞滲出，EGFP mRNA表達顯著上調。研究表明UTMD可以成功將裸質粒DNA、病毒表達載體、siRNA寡核苷酸等轉運入顱內。

UTMD輔助釋放藥物具有無創、可重復、不良反應小、靶向性強等優點，盡管很多體外試驗和一部分體內動物試驗證實UTMD釋放藥物能有效治療腫瘤和心血管疾病，并且對優化治療參數進行了探討，但是是否可以應用于大動物甚至人類還不確定，尤其是一些聲窗不好，易于出現衰減，位置較深的部位。另外，限制UTMD藥物釋放在臨床應用的另外一個因素是安全性和實現實時監測的問題。盡管診斷超聲聯合微泡在臨床診斷上的應用被認為是安全的，但是超聲和微泡用于治療的安全性還需要系統、深入的研究。少數動物試驗研究采用了一些較為簡單的觀察指標，比如體重，進食習慣和死亡率，但在轉化為臨床應用前尚需要進行全面的毒性試驗研究。

（張艷容）

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