第六節　呼吸道疾病細菌病原學診斷

呼吸道感染是兒童最常見的感染性疾病之一，其中肺炎是兒童時期的第一位死因。其病原體包括細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體等，細菌感染在兒童呼吸道疾病相當多見。細菌病原學診斷是呼吸道疾病防治中的關鍵環節。快速準確的細菌病原學診斷不僅對提高臨床診斷水平、合理應用抗生素、遏制與延緩耐藥細菌病原體的產生具有重要意義，同時也為研究呼吸道疾病病原的致病機制和流行病學特點、指導有效預防提供依據。

呼吸道疾病的細菌病原學具有地域和時間特點，可因季節和年齡而異。目前，常見呼吸道疾病的致病菌的威脅不但沒有消除，且出現了嚴重的耐藥問題，給臨床治療帶來更大困難。嚴峻的現實向病原微生物檢驗和診斷提出了更高的要求。為了更準確、更快速地檢出與監測病原體，現代生物科學技術逐步應用于細菌病原的診斷與檢測。

一、兒童呼吸道疾病的病原學診斷現狀

傳統的病原學診斷方法包括涂片革蘭氏染色和培養，但革蘭氏染色陽性率較低，病原菌分離培養和鑒定至少需要48小時才能報道結果，而且培養陽性率會受到之前經驗性治療的影響。由于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等易培養菌可作為共生菌存在于上呼吸道，故采用傳統的分離培養技術進行診斷時要求標本為血液等無菌體液或通過侵入性方法（如肺穿刺、經纖維支氣管鏡等）獲得的呼吸道標本，存在血培養陽性率低、侵入性方法易造成嚴重并發癥等諸多問題。免疫學檢測技術目前主要用于診斷病毒、支原體、衣原體等難培養病原體導致的下呼吸道感染，多采用酶鏈免疫吸附試驗、免疫熒光抗體試驗、對流免疫電泳等方法檢測血、痰等標本中的病原體抗原或血清特異性抗體。由于缺乏統一的參考標準，免疫學檢測方法的敏感性和特異性在不同實驗室間差異較大，影響了其在下呼吸道感染中的診斷效用。基因診斷技術如今已在下呼吸道感染的快速病原學診斷中發揮越來越重要的作用。若以傳統的血培養方法作為診斷金標準，用PCR技術對血和痰標本肺炎鏈球菌的檢測敏感性分別可達57%～100% 和 68%～100%^［1，2］。在兒童肺炎支原體、肺炎衣原體所致下呼吸道感染的診斷中，核酸擴增技術亦顯示出傳統培養法和血清免疫學檢測方法無法比擬的優勢。可以預言，一旦核酸擴增技術的現存問題得以解決，它必將成為兒童下呼吸道感染病原學診斷的最有效手段。

因此，傳統的細菌分離、培養及生化反應等病原微生物的診斷方法，已遠遠不能滿足臨床和流行病學的研究需要。隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學及計算機技術的不斷發展，新的微生物診斷技術和方法已廣泛被應用。近年來國內外學者不斷努力，已創建不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的微生物診斷方法，尤其是DNA探針和以PCR為代表的分子生物學技術的發展及自動化儀器的應用已明顯加快了微生物檢驗的速度，顯著提高了微生物的診斷水平。

二、兒童呼吸道疾病細菌病原標本的采集

兒童呼吸道疾病的細菌病原學鑒定與診斷的關鍵是標本采取。呼吸道標本的采集方法多樣，常用方法有：

1.痰標本、咽拭子、鼻咽拭子等標本培養

兒童咽部正常就有帶菌，來自上呼吸道的分泌物培養不能真實反映肺部感染，只能協助呼吸道疾病的細菌病原學診斷。

2.血培養

在呼吸道疾病的細菌病原學檢測中常應用血培養方法，但呼吸道疾病的細菌常僅有短時的病毒血癥或菌血癥過程，因此血培養分離細菌病原的陽性率極低，一般不足10%^［3，4］。尤其是近年來抗生素的早期廣泛應用，使得絕大多數呼吸道疾病的細菌血培養陰性，例如巴西的一項3 431例兒童社區獲得性肺炎研究顯示，65.5%的患兒血培養，肺炎鏈球菌陽性率僅為0.8%。也有在6個月～18歲兒童和青少年的社區獲得性肺炎中僅0.4%的血培養陽性率^［5］。當合并有胸腔積液時血培養的陽性率增高，可達10%～35%。

3.肺穿刺

肺穿刺方法是目前公認的呼吸道疾病的細菌病原學檢查的“金標準”，透視下肺病變部位的穿刺能夠真正反映肺炎病原學情況。但這種方法對操作人員技術要求高，在兒童不能很好配合的情況下，可出現較嚴重的并發癥，如氣胸、肺出血等，患兒及家長不易接受。

4.使用經氣管抽吸采取分泌物方法

可避免上呼吸道攜帶病原污染。實踐證明這種方法可較好地減少攜帶菌，提高呼吸道疾病的細菌病原診斷的陽性率。但它需要負壓吸引設備，吸管經咽喉部進入氣管，易造成患兒刺激性咳嗽、氣道短暫梗阻、嘔吐等。

5.經纖維支氣管鏡采取標本

此方法是近年來迅速發展的一種診療技術，它可在直視下觀察肺內各部位支氣管的病理變化、采取標本、給藥、灌洗和取出異物等。有報道纖維支氣管鏡灌洗液培養分離病原較以往的氣管抽吸分泌物培養方法陽性率高，準確性更好。然而這一技術也有危險性，需要一定的設備條件，技術要求高，在多數基層醫院不易廣泛開展。

呼吸道疾病的病原學診斷，通常是通過痰培養和顯微鏡檢查方法獲得。咽喉部定植的復雜微生物菌群濃度高達10⁶CFU/ml 以上，容易污染從下呼吸道排出的分泌物，而難以鑒別感染菌與定植菌。盡管用細胞學方法篩選痰標本、或行痰液洗滌及定量培養等方法可以在一定程度上減少污染，但結果仍不盡人意，且操作煩瑣而影響其推廣。環甲膜穿刺吸引下呼吸道分泌物雖可減少上呼吸道的污染，但并發癥多，目前已較少應用。為克服上述障礙，近年來發展通過保護型毛刷經纖維支氣管鏡（FOB）采集下呼吸道分泌物的診斷技術能正確獲得醫院感染肺炎的病原學診斷。然而醫院感染肺炎患者常因基礎疾病病情嚴重，使FOB 檢查在操作時間和檢查項目上受到限制。經FOB直接吸引并做細菌定性定量培養，操作簡單，對肺部特殊感染具較高的診斷價值。直接涂片染色可快速檢測結核、卡氏肺孢菌等，但對肺部細菌性感染的診斷特異性差，僅20%～30%。經FOB進行支氣管肺泡灌洗，可以獲得較大面積肺泡及支氣管分泌物的樣本，是診斷下呼吸道感染的一種敏感工具。

三、呼吸道疾病細菌病原學診斷方法

（一）形態學檢測技術

1.光鏡檢查

對呼吸道分泌物等標本制成的涂片，進行革蘭氏或特殊染色后置普通光學顯微鏡下直接觀察，是確定很多呼吸道疾病病原體的最基本、快速的方法。

2.電鏡檢查

主要用于觀察細菌的超微結構，在電鏡下根據不同細菌的特征性的超微結構進行診斷，對細菌感染具有快速診斷價值。

3.分離培養

分離培養是確定細菌病原最常用方法，要求標本應采集自感染肺組織。有研究表明，肺穿刺標本細菌培養陽性率在非洲兒童肺炎患者達79%。但常規穿刺顯然不切臨床實際，更不適合肺炎初始治療的患兒。直接取痰或用3%～5%高滲鹽水誘導獲取痰液或經氣管負壓抽取痰液標本送培養和涂片染色（可以發現胞內菌），所得結果在一定程度上對臨床有指導意義。鼻咽分泌物培養有細菌生長并不能確立該細菌就是肺炎致病菌。當懷疑有特殊病原體或耐藥菌感染致肺炎或經驗治療無效時，應盡可能采集合格痰標本（可結合痰液細胞學涂片判斷：中性粒細胞≥25個/低倍視野，上皮細胞＜10個/低倍視野為合格標本）以明確病原。疑有侵襲性感染的肺炎住院患兒，尤其是嬰幼兒，應及時送檢血培養。一項對840例0～12歲小兒肺炎的研究表明，胸腔積液培養陽性率為17.7%，因此對胸腔積液者應做胸腔穿刺以獲取積液或膿液標本培養，對明確肺炎病原學有一定價值。

對病原體的分離培養不僅能使呼吸道疾病病原得以確診，而且建立在此基礎上的藥敏試驗可指導臨床合理用藥。但是某些病原體目前還無法進行體外培養，或培養步驟繁復而無法在小型實驗室常規開展。更重要的是許多兒科感染常見病原體的培養結果無法及時獲取以指導臨床治療，這些缺點大大限制了分離培養技術在病原學診斷中的應用。

（二）免疫學檢測技術

免疫學檢測技術的基本原理是抗原抗體反應，可利用單克隆抗體檢測病原體的特異性抗原，也可利用病原體抗原檢測患者體內的特異性抗體。免疫學檢測在難培養的細菌和支原體、衣原體、立克次體等病原體的診斷中具有很大的實用價值。應用單克隆抗體結合各種形式的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、熒光免疫分析（FIA）、時間分辨熒光免疫分析（TrFIA）、化學發光免疫分析（CIA）、生物發光免疫分析（BIA），以及免疫層析法等^［6］，足以檢出臨床標本中痕量的（10¹⁸～10²¹）微生物抗原，免去細菌培養過程，直接完成微生物感染的快速診斷。

1.抗血清凝集技術

早在1933年，就成功地用多價血清對鏈球菌進行了血清分型。隨著抗體制備技術的進一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細菌凝集實驗的特異性。今天已廣泛用于細菌的分型和鑒定，如沙門氏菌、霍亂弧菌等。

當然，血清抗體檢測還是受到一些限制，如檢測血抗肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體水平，或檢測血清肺炎鏈球菌抗原抗體復合物。迄今尚無一種檢測方法可獨立用于診斷肺炎并有足夠高的敏感性和特異性，對年幼兒價值更差。

2.應用不同載體的快速凝集試劑檢查與鑒定微生物

實驗室所用的載體有聚苯乙烯粒子（Latex）、明膠粒子、炭末、含蛋白A的金黃色葡萄球菌、膠體金、膠體硒等。商品試劑將白色、紅色、黃色、藍色的Latex粒子分別結合不同的單抗，可快速將細菌分群。如沙門氏菌或鏈球菌與此種復合的Latex試劑做凝集反應，可在1～2分鐘內以出現的凝集粒子的顏色判定出A、B、C、D等群，快速檢查葡萄球菌的凝固酶或DNA。

3.免疫熒光技術（immunofluorescent assay，IFA）

IFA是用熒光素標記抗體分子，借助熒光顯微鏡檢測相應抗原，該方法可清楚地觀察病原體抗原并定位，具有簡單、敏感、特異等優點，已廣泛應用于感染性疾病的診斷。但IFA易產生非特異性染色，所以必須有嚴格的對照和排除試驗，才能得出準確結果。

用于快速檢測細菌的熒光抗體技術主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣本上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在待檢測樣本上滴加已知的細菌特異性抗體，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體，如抗沙門氏菌熒光抗體。

4.間接凝集反應

包括正向間接凝集反應和反向間接凝集反應。正向間接凝集反應是以抗原致敏載體檢測標本中的相應抗體；反向間接凝集反應是以抗體致敏載體檢測標本中的相應抗原。由于其操作簡便、反應快速，因而常用于流行病學調查和篩選陽性標本。在標本中直接檢出細菌抗原，有利于呼吸道疾病的早期診斷。比常規法節省時間，而且具有較高的特異性和敏感性。

5.酶免疫技術（enzyme immunoassay，EIA）

是20世紀60年代末建立并開始用于感染性疾病的診斷。隨著反應體系的不斷改進，單克隆抗體、基因表達抗原及人工多肽的廣泛應用，其技術水平日趨成熟。EIA具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有可溶性抗原抗體反應系統均可檢測，最小可測值可達納克甚至皮克水平，與IFA比較具有操作簡便、結果易判定、重現性好等優點。常用的EIA有免疫酶標試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡技術及免疫膠體金標記技術。酶聯免疫技術的應用，大大提高了檢測的敏感性和特異性，現已廣泛地應用在病原微生物的檢驗中。

6.應用變態反應檢查病原微生物或其抗體

變態反應是機體對某些抗原物質發生的一種可導致生理功能紊亂或組織損傷的異常免疫反應，常表現為免疫反應性增高，多發生于再次接觸同種抗原的時候。變態反應亦稱過敏反應（anaphylaxis）或超敏感性（hypersensitivity），引起變態反應的物質稱為變應原（allergen）或過敏原（anaphylactogen），包括完全抗原、半抗原或小分子的化學物質等，如細菌、寄生蟲（原蟲、蠕蟲）、異種血清等。這些變應原可通過呼吸道進入體內，使其致敏和激發變態反應。可利用變應原來檢測病原的感染。

（三）分子生物學技術

隨著分子微生物學和分子化學的飛速發展，對病原微生物的鑒定已不再局限于其外部形態結構及生理特性等一般檢驗，而是從分子生物學水平研究生物大分子，特別是核酸結構及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術中，核酸探針（nucleic acid probe）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction）以其敏感特異、簡便、快速的特點成為世人矚目的生物技術革命的新產物，已逐步應用于微生物的檢測。

1.核酸雜交技術

核酸雜交技術是利用放射性核素或非放射性核素標記已知特異性核酸片段作為探針，將已知核苷酸序列或DNA片段用放射性核素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA片段形成雜交雙鏈，檢測標本中具有相同序列的目的核酸，借助放射自顯影或其他方法示蹤，其靈敏度可達5×10⁸pg/L水平。這種能識別特異性核苷酸序列有標記的單鏈稱為DNA分子核酸探針或基因探針。根據核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針。根據選用基因的不同DNA探針分成兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性。另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。

核酸探針的應用：

（1）用于檢測無法培養，不能用做生化鑒定、不可觀察的微生物產物以及缺乏診斷抗原等方面的檢測，如腸毒素。

（2）用于流行病學調查研究，區分有毒和無毒菌株。

（3）檢測細菌內抗藥基因。

（4）細菌分型，包括rRNA分型。

常用方法有斑點雜交、Southern印跡、Northern印跡、原位雜交等。核酸雜交技術的特異性比免疫學檢測更高，但存在耗時長、技術要求高等缺點，因此尚未能常規用于感染性疾病的病原學診斷。

2.聚合酶鏈反應技術（polymerase chain reaction，PCR）

PCR 技術自 1985年建立以來，發展迅速、應用廣泛，表明其具有強大的生命力。近些年來基于PCR的基本原理，對PCR技術進行研究和改進，使PCR技術得到了進一步的完善，并在此基礎上派生出了許多新的用途。如：原位PCR技術、連接酶鏈反應（ligase chain reaction，LCR）、依賴核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉錄依賴的擴增系統（transcript-based amplification system，TAS）、Qβ復制酶（Q-beta replicase）系統擴增法、標 記 PCR（labelled primers，LP-PCR）、彩 色 PCR（color complementation assay PCR，CCAPCR）、反向 PCR（reverse PCR）、不 對 稱 PCR（asymmetric PCR）、重 組 PCR（recombinant PCR）、多 重 PCR（multiplex PCR）和免疫-PCR（immuno-PCR）等。

采用熒光多重PCR檢測細菌特異基因，如肺炎鏈球菌編碼溶血素（ply）基因、流感嗜血桿菌編碼細菌莢膜多糖（bex）基因。也有選擇穩定、廣范圍的細菌拓撲異構酶基因（gyr B/par E）序列，如利用寡核苷酸陣列結合PCR擴增技術診斷9種呼吸道感染常見細菌病原等。

PCR可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，它是在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增。可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染^［7，8］。PCR也可用于病原微生物的分型鑒定，如多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別等。PCR技術在敏感性、特異性、檢測速度等方面的強大優勢使其越來越廣泛地被應用于各種感染的病原學診斷。同時，PCR技術也存在標本易污染、檢測費用高、需專業設備和人員等缺點，自動化和標準化是其目前急需解決的問題。

3.基因定量診斷與基因芯片技術

基因定量診斷技術是在基因定性診斷技術基礎上發展起來的新技術，包括核酸雜交定量技術和PCR定量技術。實時熒光定量PCR法為目前應用最廣的基因定量診斷技術，根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數量，具有自動化程度高、動態監測、防止污染等優點，也有無假陽性和假陰性。基因定量診斷可用于病情評估、療效預測、預后判斷等，在感染性疾病診斷中具有重要的臨床應用價值。

基因芯片技術是近年來分子生物學及醫學診斷技術的重要進展，它的突出特點在于其高度的并行性、多樣化、微型化和自動化。該技術是通過把巨大數量的寡核苷酸，肽核苷酸或DNA固定在一塊面積很小的硅片、玻片或尼龍膜上而構成基因芯片，它主要是基于近年來的一種全新的DNA測序方法之一雜交測序法應運而生的。由于該技術同時將大量的探針固定于支持物上，所以可以一次性對大量序列進行檢測和基因分析，解決了傳統的核酸印跡雜交操作復雜、操作序列數量少等缺點。因此可在短時間內對診斷不明的感染性疾病做出判斷。基因芯片還可用于細菌變異株、基因分型、耐藥基因等檢測。隨著該技術的日趨成熟必將在感染性疾病的病原學診斷中發揮巨大作用。液態芯片是近年來新出現的一種可用于多指標同步分析的新型芯片技術，它將細胞大小的微球作為探針的載體，為生物分子相互作用提供充分反應的液態環境。該技術既具有以往生物芯片高通量的特性，又具有優于過去芯片的操作簡便、重復性好、靈敏度高的特點。

固定在玻片等支持物上的DNA 序列往往是根據特異性 PCR 擴增得到的片段（500～5 000bp）、細菌基因組的隨機片段或者是人工合成的代表不同基因的單鏈核酸序列（20～70bp）。該方法的主要優點是可以同時鑒定多種細菌的混合污染。現在這種技術主要用來檢測致病菌的基因表達水平，同時也可以快速鑒定致病菌基因。常規的PCR 檢測方法只能夠檢測一種基因，而只是通過一個基因進行菌種鑒定的檢測方法在特異性方面存在一定的不足。如大腸埃希菌O157：H7的slt-Ⅰ和slt-Ⅱ基因、eae基因、rfbE基因和fliC基因，只有同時檢測到這些基因才能夠鑒定為大腸桿菌O157：H7。現在應用較多的是復合PCR這種方法，此種方法也有一定的缺點，如同一個PCR 反應中由于引物間的相互作用而使檢測基因的數量有一定的限制，還會因非特異性擴增和擴增片段的大小相近而不易區分。DNA 基因芯片技術由于利用的是DNA-DNA雜交而克服了上述缺點，PCR 擴增的產物必須能夠和相應的基因序列雜交才能確定為陽性，而不是僅僅依靠擴增片段的大小進行確定，而且可以利用隨機六聚體引物（hexamers）對全基因組序列進行擴增。這既解決了非特異性擴增的問題，又解決了通過DNA 片段大小進行確定的問題。

基因芯片（microarray）分析作為一種新興的技術，在過去的10 年中，已經有37 種微生物的基因組序列被獲得，還有128 種微生物的序列正在測序中。隨之而來的是快速篩選技術，如DNA 基因芯片技術，這種技術利用從細菌中擴增到的序列標記熒光作為探針，與固定在玻片上成千上萬的DNA序列進行雜交，結果可以通過直接的熒光掃描或酶學方法進行測定。基因芯片技術可以利用相關細菌的特異性基因（如毒力基因、抗生素耐受基因）和基因庫中的rDNA序列設計玻片上的片段。這種方法可以快速、準確地檢測和鑒定呼吸道疾病的病原菌。通過復合PCR 擴增產物和芯片進行雜交，明顯地增強了反應的特異性和敏感度。如利用細菌的16S rDNA 序列設計芯片對細菌進行檢測，以及利用細菌基因組的隨機片段設計芯片進行雜交對細菌進行鑒定，可以同時鑒定多種細菌，并且可以形成雜交圖譜進行交流和為以后的研究打下基礎。

與傳統方法相比，生物芯片在疾病檢測診斷方面具有獨特的優勢，它可以在一張芯片同時對多個患者進行多種疾病的檢測。僅用極小量的樣品，在短時間內，即可為醫務人員提供大量的疾病診斷信息。這些信息有助于醫生在短時間內采取正確的治療措施。例如對腫瘤、糖尿病和傳染疾病等常見病和多發病的臨床檢驗及健康人群檢查，均可以應用生物芯片技術。

有些實驗室難題在高通量的檢測中可以得到解決，如呼吸道、消化道致病菌檢測，結核的培養困難，耐藥很難檢測（可以測耐藥基因）等，國內也有人在研究致病菌分析用芯片。在臨床基因診斷中，基因芯片也逐漸得以應用。可以預見，基因技術在細菌病原學的檢測中將會發揮越來越重要的作用。

（四）流式細胞術

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是用流式細胞儀對單細胞懸液進行自動快速定量分析和分選的新技術，它綜合了熒光標記、激光、單抗和計算機技術，具有速度快、精確度高、計數細胞量大及多參數分析等特點。FCM因能快速、多參數分析細胞特征，顯示細胞的DNA、RNA水平和體積大小，近年來在臨床上已逐步用于多種細菌的檢測、計數及鑒定。

（五）檢查某些細菌的專有酶及代謝產物進行快速鑒定

快速酶觸反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將它們配制在相關的培養基中。根據細菌反應后出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統的細菌分離與生化反應有機地結合起來，并使得檢測結果直觀，正成為今后微生物檢測發展的一個主要方向。Rosa等將樣本直接接種于Granda培養基，經18小時培養后，B群鏈球菌呈紅色菌落且可抑制其他菌的生長。Deliae等新合成一種羥基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的藍色物質。將一定量的IBDG加入到麥康基（MAC）瓊脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培養18小時，出現深藍色菌落者為大腸埃希陽性菌株。其色彩獨特，且靛藍不易擴散，易與其他菌株區別。

已發現某些具有特征性的酶，應用適當的底物可迅速完成細菌鑒定。如沙門氏菌具有辛酸醋酶，以4MU-辛酸酯酶為底物經沙門氏菌酶解，在紫外線下觀察游離4MU的熒光，國內已有應用。β-萘酚辛酯酶為底物，經沙門氏菌酶解，釋出β-萘酚與固藍作用出現紫色，反應在紙片上進行，只需5分鐘即可完成沙門氏菌的鑒定。卡他莫拉菌具有丁酸醋酶，可用丁酸酯色原底物快速鑒定。大腸埃希菌具β-葡萄糖醛酸酶，故β-葡萄糖醛酸酶已成為初步篩查大腸埃希菌的重要特征。白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N-乙酰β-D半乳糖苷酶，分別以適當物檢測，試驗只需20分鐘，兩酶均陽性即為白色念珠菌。難辨梭菌是醫院內感染的重要厭氧菌，細菌培養需3～7日，且該菌培養困難，診斷主要檢測其產生的A或B毒素。近來發現該菌具谷氨酸脫氫酶（GDH），如應用此酶的IgG抗體包被固相檢測卡，應用雙抗體夾心法檢查糞便中的GDH。試驗只需5分鐘，已有商品的檢測卡供應。

（六）細菌毒素的快速檢測

自臨床標本中直接檢出細菌的毒素，常比細菌培養更可靠。如難辨梭菌在正常腸道中也可出現，故對抗生素相關腸炎的診斷，檢出其毒素比細菌培養更有意義。已應用此類毒素的單抗以快速凝集或EIA法自糞便標本中直接檢出毒素A或B進行診斷。產毒素埃希菌（ETEC）感染的診斷主要依靠檢查細菌的LT（熱敏毒素）與ST（耐熱毒素），可應用其單抗以多種免疫學手段檢出。腸出血性大腸埃希菌（EHEC）的重要特征是產生Vero細胞毒素（VT）或稱志賀樣毒素（SLT）。由于EHEC的血清型繁多，生化反應也可不典型，故檢查該菌的毒素極具診斷價值。英國Unipaih公司已研制出VTEC的PRLA乳膠凝集試劑分別檢查VT-1與VT-2，試驗時以多黏菌素裂解菌體，釋出VT，與乳膠試劑在U形板中溫育24小時，肉眼判定有無凝集。金黃色葡萄球菌產生的多種腸毒素也用單抗的協同凝集試驗迅速檢出，是診斷該菌致病的可靠手段。

（七）細菌對抗菌藥物的敏感性試驗的快速檢測

目前，檢測細菌對抗菌藥物的敏感性試驗需用CLSI推薦的方法與標準。新的檢測手段，如分子生物學手段檢測細菌的耐藥基因，自動化的藥敏試驗儀器，E-test法等可提高準確性與效率，但也難以實現快速。快速紙片法檢查β內酰胺酶，對革蘭氏陽性球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌有重要意義。快速鑒定MRSA和MRCNS的快速乳膠凝集試驗可檢出變異的青霉素結合蛋白（PBP2a），經與mecA基因檢測比較，其敏感性為98.5%，特異性達100%。快速結核分枝桿菌藥敏試驗：BBL公司的MGIT（Mcobacterium growth inhibitor tube）于結核分枝桿菌TH9培養基中加入異煙肼、利福平等藥物及熒光指示劑，熒光在有氧時淬滅，如細菌存活進行代謝而耗氧又復發熒光，在365nm的紫外線燈下觀察有無熒光而判定敏感或耐藥，試驗僅需4～5小時。Jacobs等將螢蟲素酶的基因導入結核分枝桿菌的噬菌體。噬菌體只侵入活的結核分枝桿菌而發出熒光。菌體與一定濃度藥物作用后，如菌體存活則感染噬菌體，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光，即為耐藥；無熒光者為敏感菌。

另外，應用氧化還原指示劑，可指示存活細菌的代謝活動，其顏色的改變可由敏感的光度計測定，使檢測時間明顯縮短。最新的敏感指示劑是Alamar blue，現已應用于革蘭氏陰性桿菌、陽性球菌、酵母樣菌、絲狀真菌以及結核分枝桿菌的MIC測定，對多數細菌4～6小時即可判讀結果。細菌對抗菌藥物的敏感性反映一定的耐藥機制，對正確鑒定細菌也有重要價值。

（八）病原微生物的自動化系統

近年來，隨著計算機技術的不斷發展，對病原微生物的鑒定技術朝著微量化、系列化、自動化的方向發展，開辟了微生物檢測與鑒定的新領域。最有代表性的是AMS微生物自動分析系統。AMS為美國VITEK廠產品，屬于自動化程度高的儀器，由7個部件組成，應用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。操作時，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數功能的孵箱內，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養基的發酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結果。該套系統檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應指標，基本同常規檢測鑒定，檢測所需時間4～8小時，最長不超過20小時。用自動化/半自動化系統進行的鑒定和敏感性檢測可以在92%～99%的敗血癥病例中鑒定革蘭氏陰性病原體，而在43%～75%的病例中鑒定出革蘭氏陽性。這些系統的優點是常規微生物中最常見的病原體可以在4～16小時內鑒定。敏感性結果顯示與常規方法95%的相關性。

MALDI-TOF MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法）：大多數實驗室可以使用MALDITOF MS來鑒定培養的細菌和真菌。由于該方法基于保守的微生物核糖體和其他蛋白質的質譜測量，結果是精確的，大部分等同于DNA測序。由于可以從非常小的樣品量（10⁴～10⁶CFU/ml）進行測試，因此通常可以在短時間內進行幾乎不可見的分離菌落的測試，并將物種鑒定結果及時傳達給醫生。應該強調的是，MALDI-TOF MS可用于直接從血液培養瓶中鑒定病原體^［9］。可以鑒定到物種水平，鑒別致病菌和污染菌^［10］。不同的分離和裂解方案可用于從培養基中除去人源蛋白質，并將樣品中的細菌濃縮至合適的量，得到80%～96%的正確鑒定結果（與常規培養和鑒定方法相比）。然而，該方法并不適用所有的標本（例如含有活性炭的BC培養基，多微生物感染）。

（楊永弘　沈敘莊）

參考文獻

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