1.1　引言

在基因工程領域，簇狀規則間隔短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關蛋白（Cas）系統的研究和應用近年來取得了巨大進展?，F在已經開發出了多種CRISPR-Cas9作為基因組編輯工具。迄今為止，所有CRISPR-Cas系統被歸為兩類，每個類別又進一步分為幾種亞型。由于目前CRISPR-Cas領域還有多種應用工具正處于開發階段，許多研究團隊和公司也正就這些系統的專利權爭吵不休。本章將就CRISPR-Cas系統做一個簡短的概述。

自從Ishino等在1987年發現CRISPR-Cas系統以來[1]，CRISPR-Cas系統已發展成為一種基因編輯的強大工具。Mojica等在20世紀90年代完成了CRISPR-Cas系統的大部分初始表征工作[2]，而CRISPR的名字則是由Jansen等在2002年首次提出的[3]。自那時起，人們開始了CRISPR-Cas系統所涉及的蛋白質和分子的發現和表征過程[4]。以2類Ⅱ型的CRISPR-Cas9系統為例[4-6]，CRISPR-Cas系統進行基因編輯包括三個過程：表達、干擾和適應（匹配）[4,5]。在表達過程中，與特定靶序列（原間隔序列）同源的CRISPR陣列被轉錄為許多前CRISPR RNA（pre-crRNA）[4-6]［圖1.1 （a）］，這些pre-crRNA與更小的反式激活crRNA（tracrRNA）通過堿基配對形成復合物[4-6]。這種復合物可以與Cas9蛋白結合，導致較長的pre-crRNA被RNA酶Ⅲ切割，分離成單獨的crRNA/tracrRNA復合物［圖1.1 （b）］。當crRNA/tracrRNA將Cas9復合物引導至目標序列時，crRNA結合所謂的原間隔序列相鄰基序（PAM）后的目標序列，干擾就開始了［圖1.1 （c）］。在此階段靶序列解旋，并被Cas9蛋白的核酸酶結構域（RuvC和HNH）切割[4-6]，在靶DNA序列中留下斷裂雙鏈，然后Cas9復合物脫離。之后是將所需的DNA修復模板插入，并在干擾的末期通過同源定向修復（HDR）將其連接至經切割的靶DNA的平末端。修復的間隔區序列被轉錄并匹配嵌入基因組［圖1.1 （d）］[4-6]。在大多數已知的CRISPR-Cas系統中，適應過程由Cas1和Cas2蛋白（在某些時候為Cas4）控制，這些蛋白質通過整合RNA，然后誘導RNA逆轉錄成DNA，從而將所需的間隔區序列匹配入CRISPR陣列[4-6]。通過這些過程，某些細菌能夠在感染過程中將病毒基因組整合到自己的基因組（即CRISPR陣列）中，從而在將來的感染過程中實現更有效的免疫反應[4-7]。這些過程經過修改，就成為了分子生物學和基因工程領域的強大工具。

圖1.1　CRISPR-Cas系統進行基因編輯的過程

（a）來自CRISPR陣列的crRNA與較小的tracrRNA分子結合，成為gRNA復合體；（b）gRNA與Cas9蛋白結合，形成gRNA：Cas9復合物；（c）gRNA指導Cas9蛋白識別PAM基序并靶向特定的DNA序列，RuvC和HNC核酸酶位點切割靶序列，留下兩個同源的平末端；（d）所需的DNA修復模板插入所需的基因并通過HDR修復DNA鏈，然后使產物DNA適應匹配插入生物體的基因組