4.5　目標搜索與識別

一旦Cas9結合了其向導RNA，該復合體即可開始尋找互補的靶DNA位點[36]。靶標的搜索和識別既需要靶標DNA中20nt原間隔子序列與向導RNA上的間隔子互補配對，也需要在靶標位點附近存在保守的PAM序列[18,20]。PAM序列對于宿主區分自身序列和非自身序列至關重要[41]，在體外PAM中的單個突變可導致Cas9切割活性喪失[20]，并使噬菌體逃脫宿主的免疫反應[42]。常用的SpCas9 PAM序列是5′-NGG-3′，其中N可以是四個DNA堿基中的任何一個。單分子實驗表明，Cas9通過探尋合適的PAM序列來啟動目標DNA的搜索過程，然后再搜索側翼DNA是否具有潛在的向導RNA互補性[30]。靶向識別是通過三維碰撞發生的，其中Cas9快速從不包含適當PAM序列的DNA上解離，而當存在適當PAM時，停留時間取決于向導RNA與相鄰DNA之間的互補性[30,43]。一旦Cas9找到具有適當PAM的靶位點且向導RNA與靶DNA的靶標鏈互補，它就會在PAM鄰近的成核位點觸發局部DNA熔解。隨后RNA鏈入侵，從近PAM端到遠PAM端形成RNA-靶DNA雜合鏈并置換出非靶DNA鏈（形成R環）[30,44]。sgRNA的種子區域和靶DNA之間的完美互補是Cas9介導的DNA靶向和切割所必需的，而非種子區域的不完美堿基配對對靶DNA結合特異性來說則相對影響較小[45]。

4.5.1　RNA-DNA異源雙鏈

最近解析的Cas9-sgRNA與互補的單鏈靶DNA（帶有和不帶有PAM雙鏈）[31]，以及Cas9-sgRNA與完全配對的靶標dsDNA結合所形成復合物的EM和晶體結構模型[37]，共同為Cas9-sgRNA如何識別底物DNA提供了重要的結構見解。其中一種是Cas9-sgRNA與靶ssDNA鏈相互作用的機制，這是從結合ssDNA的結構中首次發現的[31]。在這種結構中，目標DNA鏈通過20個Watson-Crick堿基對與sgRNA中的20nt間隔序列進行整體雜交，形成RNA-DNA異源雙鏈體，其構象主要為A型。RNA-DNA異源雙鏈位于REC和NUC葉之間的中央通道中，并被Cas9以不依賴序列的方式識別，這表明Cas9識別RNA-DNA異源雙鏈體的幾何結構而不是其核酸堿基。RNA-DNA異源雙鏈的假A型構型在PAM雙鏈結合的結構中也存在[46]。這為寡脫氧核糖核苷酸PAMmers（包含PAM序列的DNA寡核苷酸的簡短序列）存在時Cas9靶向RNA提供了結構解釋[47]，因為RNA-RNA異源雙鏈通常采用類似的A型構象。比較所有與DNA結合的結構中的RNA-DNA異源雙鏈體，包括ssDNA結合、PAM雙鏈體結合和雙鏈DNA結合狀態，發現雜合雙鏈體在延伸至向導RNA 5′末端時表現出更明顯的畸變，尤其是從位置+12到+17（從sgRNA內間隔區的3′末端算起）。相對于PAM近端片段，PAM遠端區域的RNA-DNA異源雙鏈體所采用的結構可塑性顯著提高，這與Hel-Ⅲ的高柔韌性和Hel-Ⅰ的低移動性（分別容納雜合鏈遠端和近端）有關。這可以解釋為什么PAM遠端非種子區錯配比PAM近端種子區域配對更能被容忍。單鏈靶DNA鏈的結合相對于PAM結合在Cas9內引起了更為顯著的構象變化，進一步突顯了RNA-DNA雜交在誘導Cas9的構象激活中的重要作用。

4.5.2　PAM識別

PAM識別的分子機制由PAM雙鏈結合后結構來闡明[47]。在這種結構中，Cas9切口酶（H840A）與83nt sgRNA和在非靶標鏈上包含5′-TGG-3′ PAM序列的部分雙鏈體靶標DNA形成復合體，這種DNA模擬了含有被切割的非靶標DNA的部分產物鏈和完整的靶DNA鏈。PAM雙鏈體位于REC和NUC葉之間的帶正電荷的凹槽中，而含PAM的非靶標鏈主要位于CTD中。PAM序列中的第一個堿基（表示為N）與其互補堿基保持堿基配對，但不與Cas9相互作用。通過與位于CTD中的β-發夾結構中的兩個精氨酸殘基（R1333和R1335）的堿基特異性氫鍵相互作用，保守的PAM GG二核苷酸可在大溝中被直接讀出。與DNA小溝中的識別相比，通過DNA大溝中水介導的氫鍵直接相互作用讀取堿基賦予了Cas9更大的序列特異性和區分性[48]。與之相比，Cascade也識別雙鏈形式的PAM序列，但從小溝側開始，這解釋了Ⅰ型CRISPR-Cas系統中PAM識別的混雜性[49]。除了與GG二核苷酸的堿基特異性接觸外，Cas9的CTD還與含PAM的非靶DNA鏈的脫氧核糖-磷酸骨架形成許多氫鍵相互作用。但是，未發現在Cas9和靶鏈核苷酸之間的直接相互作用[46]。這使先前的生化觀察結果趨于合理，表明Cas9特異性識別非靶鏈而不是靶鏈上的PAM序列，同時解釋了Cas9對PAM雙鏈體靶鏈區錯配的耐受性[20,30]。SpCas9變體的最新結構研究表明，Cas9通過誘導契合機制識別非經典PAM序列[50]，其中非經典PAM的識別在不改變Cas9構象（包括PAM）的情況下，在PAM雙鏈體的DNA骨架中產生細微的變形，包括位于CTD結構域中與PAM相互作用的β-發夾結構。有趣的是，工程化精氨酸殘基（T1337R）參與了PAM（5′-NGNG-3′）第四位鳥嘌呤堿基的識別。工程化Cas9變體表現出的PAM識別的結構可塑性進一步印證了PAM識別在誘導靶DNA解鏈中的重要作用[30]。

4.5.3　局部DNA熔解和R環形成

結合PAM雙鏈和結合dsDNA的結構解析顯示，特定的PAM-Cas9相互作用觸發了局部結構變化，使相鄰DNA雙鏈體不穩定，并促進了向導RNA和靶DNA鏈之間隨后的Watson-Crick堿基配對[46,50]。在PAM雙鏈結構中，在緊鄰PAM上游的靶鏈中觀察到一個明顯的扭結轉彎，它通過位于CTD結構域中的磷酸酯鎖環（K1107-S1109）穩定連接磷酸二酯基團（稱為+1磷酸酯）[46]。這種扭結轉彎構型對于驅動靶標DNA從與非靶鏈配對過渡到與向導RNA配對是必需的。將結合DNA的結構與結合sgRNA的結構做疊加，磷酸酯鎖環顯示出多種構象，并在與PAM結合后向外移動。這些觀察結果與生化和單分子研究結果相結合，表明PAM識別與相鄰序列的局部不穩定相伴[20,30]，而且在PAM識別后，磷酸酯鎖環和+1位磷酸之間相互作用的形成有助于DNA雙鏈體的局部熔解和RNA-DNA雜交的穩定化[46]。如果沒有最初的PAM結合并通過該磷酸酯鎖環穩定+1磷酸酯，目標DNA序列的第一個核堿基就不能輕易翻轉并向上朝向導RNA方向旋轉，結果是向導RNA很少能夠結合靶DNA以啟動RNA鏈入侵。這種結構特征也使以前的研究結果相吻合，表明非靶鏈上PAM的存在可以激活ssDNA靶鏈的切割[30]。dsDNA結合結構進一步揭示了在無ATP依賴的解旋酶活性存在的情況下，PAM識別如何觸發誘導R環形成[37]。為了捕獲處于切割狀態的R環結構，在存在金屬離子螯合劑的情況下，用含有30個堿基對（bp）的dsDNA與野生型SpCas9-sgRNA結晶，以防止靶DNA切割。如在PAM雙鏈結合結構中觀察到的[46]，未纏繞的靶DNA鏈在+1磷酸二酯鍵處扭結，然后與間隔區配對形成假A型RNA-DNA異源雙鏈體。靶DNA鏈在兩個Cas9葉之間形成的中央通道中延伸，與之相反，被置換出的非靶DNA鏈穿入位于NUC葉內的緊鄰側通道中。PAM遠端的非靶鏈完全無序[37]，這與以前的足跡實驗數據非常吻合[29]。通過疏水和范德華力相互作用組成的精細網絡，PAM近端非靶DNA鏈得以穩定[37]。它顯示出扭曲的螺旋構象，PAM上游的第一個核苷酸（稱為-1位置）堆疊在PAM雙鏈體上。如在PAM雙鏈結合結構中觀察到的，這種鏈內堿基堆疊可能有助于穩定PAM雙鏈并通過Cas9與GG二核苷酸的堿基特異性相互作用促進PAM識別。非靶DNA鏈在-1磷酸位置發生明顯的扭結，沒有直接的蛋白質相互作用[37]。相反，通過Cas9與-2和-3位置的翻轉核苷酸之間的廣泛相互作用，可以使扭結的DNA構型穩定。在這種具有切割功能的構象中，非靶標鏈再次在-4位置扭結，然后從RuvC和HNH核酸酶結構域之間形成的狹窄的帶正電荷的通道中橫向穿出。在未纏繞的靶鏈和置換的非靶鏈中觀察到的尖銳扭結和翻轉堿基[37,46]，表明緊鄰PAM上游的兩個種子核苷酸在很大程度上暴露于本體溶劑中，從而成為PAM的成核位點以啟動靶DNA的結合[36]，這些發現闡明了Cas9如何檢測鄰近DNA用于與向導RNA互補，并在PAM識別后打開DNA雙鏈體以啟動R環形成[30]。此外，這些結構與早期的生化研究結果非常吻合，后者表明緊鄰PAM的2bp錯配使結合完全喪失，而進一步在此位置引入2bp小DNA氣泡則會消除在該位置形成RNA-DNA異源雙鏈的需要，并且導致牢固結合和快速的切割[30]。

4.5.4　Cas9誘導的DNA彎曲

Cas9-sgRNA復合物與dsDNA結合的Cryo-EM結構進一步闡明了Cas9如何將未解鏈的dsDNA的兩端固定在更長的螺旋中[37]。在這種真正的R環結構中，與結合PAM雙鏈和雙鏈DNA的晶體結構相同，雙鏈PAM的近端也保留在PAM相互作用的CTD結構域中，而PAM遠端的靶標DNA雙鏈則被保持在Hel-Ⅲ和RuvC核酸酶結構域之間。Cas9顯著扭曲了DNA螺旋，從而改變了雙鏈體的軌跡，在結合的DNA片段中產生了從180°到150°的整體彎曲。盡管大多數非靶標鏈在該EM結構中都無法解析，但密度清楚地表明，PAM遠端非靶標鏈受到有利的靜電環境的吸引，采取向下的溝槽路線朝向RuvC核酸酶結構域的背面。Cas9引起的DNA彎曲與轉錄過程中RNA聚合酶誘導的DNA變形[51]類似，最有可能促進鏈分離并防止再雜交（R環塌陷）。