4.2　CRISPR-Cas9生物學

簇狀規則間隔短回文重復序列-CRISPR相關蛋白9（CRISPR-Cas9）系統是自然界中細菌針對噬菌體感染和質粒轉移而采取的一種防御機制，現已被用作功能強大的RNA引導的DNA靶向平臺，用于基因組編輯、轉錄擾動、表觀遺傳調控和基因組成像。這項技術使人們可以精確地操縱由一小段向導RNA指定的任何基因組序列[1]，從而闡明涉及疾病發展和進程的基因的功能；通過使用核酸酶缺陷的Cas9和效應子結構域的融合蛋白，糾正引起疾病的致癌基因的激活突變以及抑癌基因的失活[2]。此外，這項可編程的核酸內切酶技術使研究人員可以通過在單個實驗中同時靶向多個基因組位點從而一次性檢查多個基因的功能[3]，這極大地加快了人們對涉及大量基因或突變的病理過程的理解。使用sgRNA文庫，基于CRISPR的全基因組篩選可用于鑒定新型藥物靶標或抗病基因（例如新型腫瘤抑制因子或致癌基因），并快速評估藥物靶標[4]。不僅如此，CRISPR-Cas9介導的基因組工程有望治療甚至治愈遺傳性疾病，包括多種形式的癌癥、神經退行性疾病、鐮狀細胞貧血、囊性纖維化、杜氏肌營養不良癥、病毒感染、免疫性疾病和心血管疾病[5,6]。盡管有其優點和廣闊前景，但是CRISPR-Cas9與充分發揮治療潛力之間仍存在一些障礙[7]。減少或避免非靶位點上出現不需要的脫靶突變，是在臨床應用中有效利用CRISPR介導的基因組工程的關鍵[8]。因此，Cas9如何定位特定的20個堿基對（bp）（基因組中的靶序列長度達數百萬至數十億個堿基對），并隨后誘導序列特異性雙鏈DNA（dsDNA）切割，不僅是CRISPR生物學中的一個關鍵問題，而且在開發精確高效的Cas9工具過程中也是一個關鍵問題。在DNA靶標監測的不同階段對Cas9進行廣泛生化和結構研究，以及對識別不同PAM的變體和Cas9直系同源物進行研究，對我們理解CRISPR-Cas9的機制具有重要意義。在本章中，我們將簡要介紹CRISPR-Cas9技術的生物學基礎，然后重點關注化膿性鏈球菌的Cas9酶靶向和切割DNA分子機制的最新結構和力學知識。

許多細菌和大多數古菌已經進化出由CRISPR基因位點和伴隨的CRISPR相關（cas）基因所編碼的復雜的RNA防御系統，以提供針對噬菌體感染和質粒轉移的獲得性免疫力[9]。在暴露于噬菌體或質粒侵入性遺傳元件后的免疫過程中，外來DNA的短片段作為新的間隔子被整合到宿主染色體內的CRISPR重復間隔陣列中[10]，從而記錄了先前感染的遺傳物質，使宿主能夠阻止同一入侵者的再次入侵[11]。CRISPR陣列的后續轉錄及核酸內切酶對前體CRISPR轉錄本進行的酶切處理，產生了短的成熟CRISPR RNA（crRNA）[12]。在crRNA的5′末端包含間隔子，即與來自外來遺傳元件的序列互補的一段RNA短片段，而3′末端則包含一段CRISPR重復序列。crRNA間隔子會與互補的外源靶序列（原間隔子）雜交，在第二次感染時觸發Cas核酸酶對入侵的DNA或RNA進行序列特異性破壞[13]。CRISPR-Cas系統的一個特征是成熟的crRNA跟Cas蛋白組裝成crRNA效應復合物，以搜尋DNA靶標并破壞其中的匹配序列[14]。值得注意的是，位于靶DNA原間隔序列附近的一個短的保守序列基序（2～5bp），即PAM[15]，在靶DNA選擇和降解中起著至關重要的作用。目前CRISPR系統分為六種不同的類型（Ⅰ～Ⅵ），每個類型又進一步分為多個亞型，每個亞型都使用一套獨特的Cas蛋白和crRNA進行CRISPR干擾[16]。與Ⅰ型和Ⅲ型系統利用大型多亞基Cas蛋白復合物進行crRNA結合和靶序列降解不同[17]，Ⅱ型CRISPR系統采用單個效應蛋白Cas9識別雙鏈DNA底物，以其獨特的核酸酶結構域（HNH或RuvC）去切割兩條鏈[13,18]。在Ⅱ型Cas9介導的干擾過程中，稱為反式激活crRNA（tracrRNA）的小非編碼RNA與crRNA中的重復序列堿基配對，形成了獨特的雙RNA雜交結構[19]。該雙RNA引導Cas9切割包含20個核苷酸（nt）互補靶序列和PAM基序的任意DNA[18]。值得注意的是，tracrRNA是Ⅱ型系統中crRNA成熟所必需的[19]。將crRNA和tracrRNA組合成單個sgRNA后簡化了系統，但功能仍然保留[20]。通過改變crRNA中的向導RNA序列（間隔子），這個簡化的兩組分CRISPR-Cas9系統可以被編程，以靶向基因組中幾乎所有感興趣的DNA序列，并進一步產生位點特異的平末端雙鏈斷裂（DSB）[20]。然后，通過容錯的非同源末端連接[21]修復Cas9切割產生的DSB，從而在切割位點引入小的隨機插入和/或缺失（indels），或者通過高保真同源性定向修復在DSB的位點進行精確的基因組修飾[22]。因此CRISPR-Cas9系統可以被用作基因組編輯工具[20]，由于其設計簡便，使用方便和高效[23]，已迅速成為在各種生物體中進行基因組操縱的強大工具。與傳統的核酸酶介導的DNA編輯技術鋅指核酸酶（ZFN）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）不同，CRISPR-Cas9系統對DNA識別的特異性不是由蛋白質決定[24]，而是由20nt向導RNA決定[25]。因此無需對核酸酶上的DNA識別結構域進行繁瑣的蛋白質工程改造[26]，從而極大地擴展了CRISPR-Cas9在大規模基因組操作或篩選中的應用以及在科學界的適用性。