第一章　病毒病

第一節(jié)　禽　病

一、禽流感

禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，可引起禽類死亡，屬于人畜共患病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)和致死率，可將其分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。低致病性禽流感可使禽類出現(xiàn)輕度呼吸道癥狀，食量減少，下痢，產(chǎn)蛋量下降，出現(xiàn)零星死亡。高致病性禽流感最為嚴(yán)重，通常無典型臨床癥狀，發(fā)病急，體溫升高，食欲廢絕，伴有出血綜合征，并隨之死亡，死亡率高達(dá)100%，給養(yǎng)禽企業(yè)造成毀滅性的打擊，我國將其列為一類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病。

（一）病毒特征

禽流感病毒（AIV），屬于甲型流感病毒，RNA病毒的正黏病毒科，分為甲、乙、丙三個型，其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些甲型流感病毒也可感染豬、馬、海豹等各種哺乳動物及人類，乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。根據(jù)禽流感病毒對雞和火雞的致病性的不同，分為高、中、低/非致病性三級。

病毒呈多形性，其中球形直徑為80～120nm，有囊膜，基因組為分階段單股復(fù)鏈RNA。依據(jù)其外模血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可將其分為16個H亞型（H1～H16）和9個N亞型（N1～N9），其中H5和H7亞型毒株可導(dǎo)致高致病性禽流感的發(fā)生，引起人類、禽類、畜類共患急性傳染病。禽流感病毒抗原性變異的頻率很高，主要以抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變的方式，抗原漂移可引起HA和/或NA的次要抗原變化，而抗原轉(zhuǎn)變可引起HA和/或NA的主要抗原變化。抗原漂移：抗原性漂移可由編碼HA和/或NA蛋白的基因發(fā)生點突變引起的，是在免疫群體中篩選變異體的反應(yīng)，它可引起致病性更強病毒的出現(xiàn)。抗原性轉(zhuǎn)變：抗原性轉(zhuǎn)變是當(dāng)細(xì)胞感染兩種不同禽流感病毒時，病毒基因組的片段特性允許發(fā)生片段重組，從而引起突變。另外，禽流感病毒因其會隨外界環(huán)境刺激（藥物刺激、射線刺激等）及簡單的基因結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變異使其能逃脫動物產(chǎn)生的特異性抗體，這樣，原有的抗體即失去了作用，病毒可以使動物重新發(fā)病，因此，就目前的防疫和技術(shù)手段而言，禽流感病毒是消滅不了的。

禽流感病毒會侵害雞呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，造成肉雞生長緩慢，蛋雞產(chǎn)蛋下降，侵害雞群的生殖系統(tǒng)（卵巢和輸卵管）后，造成卵泡停止發(fā)育或損傷，卵子被破壞變形，破裂掉入腹腔，造成卵黃性腹膜炎。感染雞群可出現(xiàn)輸卵管充血、水腫等病理變化，引起產(chǎn)蛋率的下降，產(chǎn)出畸形蛋沙殼蛋和軟殼蛋，持續(xù)時間可長達(dá)1～2個月，引發(fā)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。康復(fù)雞有一定比例（10%～30%）終身停產(chǎn)。病愈后很難恢復(fù)到原有水平。

（二）臨床癥狀

高致病性禽流感往往突然暴發(fā)，雞無任何臨床癥狀而死亡，病程稍長的可見其精神萎靡，不食，羽毛松亂，頭、翅膀下垂，雞冠和肉髯呈暗紫色，頭部水腫（圖1-1），結(jié)膜腫脹發(fā)炎，鼻腔內(nèi)有黏性分泌物，常搖頭，呼吸困難。有些病例出現(xiàn)下痢和神經(jīng)癥狀，抽搐，運動失調(diào)，癱瘓和半癱瘓，失明。潛伏期從幾小時到數(shù)天，最長可達(dá)21天。表現(xiàn)為突然死亡，高死亡率，飼料和飲水消耗量及產(chǎn)蛋量急劇下降，腳鱗出血（圖1-2）和神經(jīng)紊亂。鴨鵝等水禽有明顯神經(jīng)和腹瀉癥狀，可出現(xiàn)角膜炎癥（圖1-3），甚至失明。

低致病性禽流感又叫溫和型禽流感，主要表現(xiàn)呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降，發(fā)病率高，但死亡率低，病程較長。感染后往往造成禽群的免疫力下降，對各種病原的抵抗力降低，常常易發(fā)生并發(fā)或繼發(fā)感染。當(dāng)這類毒株感染伴隨有其他病原的感染時，死亡率變化范圍較廣（5%～97%），高死亡率主要出現(xiàn)在青年雞、產(chǎn)蛋雞或嚴(yán)重應(yīng)激的雞，損傷主要發(fā)生在呼吸道、生殖道、腎或胰腺。因此低致病性禽流感對養(yǎng)禽業(yè)的危害也是很嚴(yán)重的。

不同種類和日齡的家禽感染低致病性禽流感后有不同的表現(xiàn)：

雞：初期表現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，叫聲減小，縮頸，嗜睡，采食量減少或急驟下降，嗉囊空虛，排黃綠色稀便。呼吸困難，咳嗽，打噴嚏，張口呼吸。后期部分雞只有神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)頭頸向后仰，抽搐，運動失調(diào)，癱瘓等。產(chǎn)蛋雞感染后，蛋殼質(zhì)量變差、畸形蛋增多，會出現(xiàn)軟殼蛋、無殼蛋、褪色蛋等。2～3天產(chǎn)蛋開始下降，7～14天產(chǎn)蛋可下降到5%～10%，嚴(yán)重的雞可停止產(chǎn)蛋。持續(xù)1～5周產(chǎn)蛋開始上升，但恢復(fù)不到原來的水平。一般經(jīng)1～2個月逐漸恢復(fù)到90%～70%的水平。種雞還表現(xiàn)種蛋受精率下降20%～40%，并導(dǎo)致10%左右的死胚，苗雛弱雛率增加，10%～20%的雛雞在1周內(nèi)出現(xiàn)死亡。

鴨：鴨群和病鴨采食變化不大，有的鴨群采食量還增加。病鴨精神沉郁，離群呆立，羽毛無光澤、蓬松，脫羽，不愿下水，下水后鴨體吃水深，上岸后羽毛難以干燥。病鴨腹瀉，個別鴨拉暗紅色稀糞。病程稍長的鴨出現(xiàn)衰竭死亡。早期死亡的鴨只往往體況較好，多為體重大的，剖檢其嗉囊和肌胃都有飼料，類似猝死癥。病鴨群產(chǎn)蛋量下降，7天內(nèi)產(chǎn)蛋率可由95%迅速下降到60%；60%產(chǎn)蛋率的鴨群發(fā)病后，產(chǎn)蛋率可下降到30%左右。產(chǎn)白殼蛋、沙殼蛋、畸形蛋，蛋殼變薄。康復(fù)后，產(chǎn)蛋率僅能恢復(fù)到75%左右。

（三）病理變化

病毒主要侵入呼吸道黏膜的上皮細(xì)胞，引起上皮細(xì)胞增生、壞死、黏膜局部充血、水腫和淺表潰瘍等卡他性病變。4～5d后，基底細(xì)胞層病變可擴(kuò)展到支氣管、細(xì)支氣管、肺泡和支氣管周圍組織，引起黏膜水腫、充血、淋巴細(xì)胞浸潤，并伴有微血管栓塞、壞死、小動脈瘤形成和出血等，引發(fā)全身毒血癥樣反應(yīng)。少數(shù)重癥進(jìn)行性肺炎除細(xì)支氣管炎癥變化外，可有肺泡壁水腫、纖維蛋白滲出，單核細(xì)胞浸潤和透明膜形成，以及肺出血等，引起諸多并發(fā)癥。其特征是角膜混濁，眼結(jié)膜出血、潰瘍；翅膀、嗉囊部皮膚表面有紅黑色斑塊狀出血等，還常見腳脛鱗片紅褐色出血斑塊，頭部眼周圍、耳和肉髯水腫，頸和胸部皮下有淡黃色膠凍樣液體（圖1-4）和充血；腺胃乳頭輕度出血、腺胃和肌胃的交界處黏膜輕度出血（圖1-5）；胰腺出血，胰腺表面有量的白色或淡黃色壞死點；口腔、肌胃角質(zhì)膜下、十二指腸出血；胸部肌肉、脂肪、胸骨內(nèi)面小點出血；心臟也有散在出血點；肝、脾、胃、肺常見有灰黃色壞死灶；心包有充血或積液，有些病例有纖維素樣滲出物，心肌有灰白色壞死性條紋；蛋雞或種雞，卵泡充血、出血、萎縮，輸卵管內(nèi)可見乳白色分泌物或凝塊，有的見卵泡破裂引起的卵黃性腹膜炎。

雞低致性禽流感的主要剖檢病變表現(xiàn)在以下三個方面。①呼吸系統(tǒng)：呼吸道尤其是鼻竇，典型特征是出現(xiàn)卡他性、纖維蛋白性、漿液纖維素性、黏膿性或纖維素性膿性的炎癥。氣管黏膜充血水腫，偶爾出血。②生殖系統(tǒng)病變：蛋雞的卵巢炎癥、卵泡出血、變性和壞死，輸卵管水腫，漿液性、干酪樣滲出，卵黃性腹膜炎。③消化系統(tǒng)病變：腺胃、肌胃出血，腸道出血及潰瘍。

病死鴨解剖主要表現(xiàn)為：早期氣管充血、出血嚴(yán)重，似紅地毯狀，支氣管內(nèi)有黃白色的干酪樣滲出物。肝臟輕微腫大。后期解剖可見氣管充血、出血嚴(yán)重，支氣管有黃白色的干酪樣物堵塞，肝臟有纖維素性滲出，心包液混濁，氣囊混濁有干酪樣物附著。胰臟腫大、出血，腸道黏膜充血、出血（圖1-6）。輸卵管黏膜充血、水腫。卵泡充血、出血。乳脂腺有干酪樣壞死。

（四）流行病學(xué)特征

高致病性禽流感病毒主要通過空氣進(jìn)行傳播，借助病毒表面的血凝素（H），與呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，吸附可宿主的呼吸道上皮細(xì)胞上。又借助病毒表面的神經(jīng)氨酸酶（N）作用于核蛋白的受體，使病毒和上皮細(xì)胞的核蛋白結(jié)合，在核內(nèi)組成RNA型可溶性抗原，并滲出至胞質(zhì)周圍，復(fù)制子代病毒，通過神經(jīng)氨酸酶作用，以出芽方式排出上皮細(xì)胞。一個復(fù)制過程的周期為4～6h，排除的病毒擴(kuò)散至附近細(xì)胞，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，臨床上出現(xiàn)發(fā)熱，肌肉痛和白細(xì)胞減低等全身毒血癥樣反應(yīng)。禽流感病毒常從病禽的眼、鼻腔分泌物和糞便中排出，病毒受到了這些有機(jī)物的保護(hù)極大地增加了存活時間。此外，禽流感病毒可以在自然環(huán)境中，特別是涼爽和潮濕的環(huán)境中存活很長時間，糞便中病毒的傳染性在4℃條件下可以保持長達(dá)30～50d，20℃為7d。

高致病性禽流感病毒與普通流感病毒相似，一年四季均可流行，但在冬季和春季容易流行，因此，禽流感病毒在低溫條件下抵抗力較強。各種品種和不同日齡的禽類均可感染高致病性禽流感，發(fā)病急、傳播快，其致死率可達(dá)100%。禽流感呈世界性分布，絕大多數(shù)呈隱性感染，不表現(xiàn)任何臨診癥狀；由H5及H7亞型所致時，常出現(xiàn)臨診癥狀甚至死亡。許多家禽、野禽和鳥類都對禽流感病毒敏感，在自然條件下，雞、火雞、鴨最易感，鵝次之。禽流感主要是橫向傳播，一般為接觸性傳染，禽類通過消化道和呼吸道感染。尚沒有證據(jù)表明該病毒可垂直傳播，但在感染蛋雞所產(chǎn)蛋中可分離到禽流感病毒。哺乳動物如豬等也可傳播本病。候鳥、觀賞鳥類等攜帶病毒遷徙可能是禽流感世界性流行的主要原因。

低致病性禽流感主要以水平傳播為主，即是指群體之間或個體之間以水平形式橫向平行傳播，如通過空氣、糞便、飲料和飲水等傳播，其中糞便是低致病性禽流感傳播的主要渠道。低致病性禽的病因主要是外界病源侵入感染，例如一些野生鳥類攜帶低致病性禽流感的現(xiàn)象就很普通。低致病性禽流感具有疫病傳播快、生產(chǎn)危害大的特點，多發(fā)于春季和秋冬交替季節(jié)，目前已是全球性的問題。

（五）預(yù)防及治療

要預(yù)防禽流感的發(fā)生和大面積擴(kuò)散，當(dāng)禽流感發(fā)生時，養(yǎng)殖戶應(yīng)提高對禽流感的防范意識，加大對禽流感的預(yù)防控制。疫苗接種是目前最有效的預(yù)防措施，要定期對家禽進(jìn)行禽流感疫苗的注射，對飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒。由于本病血清亞型較多，不同亞型之間不能產(chǎn)生交叉免疫，對禽流感疫苗的選擇要具有針對性，要選擇合適的毒株、高保護(hù)力和高抗體的疫苗，要使用國家批準(zhǔn)的疫苗接種。制定合理、科學(xué)的免疫程序，定期進(jìn)行抗體測定，對抗體較低、離散度較高的禽群進(jìn)行及時的補免補防。

（1）免疫接種　嚴(yán)格認(rèn)真地做好禽流感的疫苗免疫，特別是春秋兩季禽流感高發(fā)季節(jié)集中免疫，根據(jù)抗體檢測結(jié)果，每隔3～4個月進(jìn)行一次H5亞型、H7亞型和H9亞型禽流感的免疫接種，可以抵抗本血清型的流感病毒，抗體維持時間一般為10周以上，免疫密度要達(dá)到100%，免疫抗體合格率要達(dá)到70%以上。

（2）切實做好飼養(yǎng)管理　采取封閉式飼養(yǎng)，防止野鳥從門窗進(jìn)入禽舍；防止水源和飼料被野禽糞便污染，定期對禽舍及周圍環(huán)境周圍進(jìn)行消毒，加強帶雞消毒，定期消滅禽場內(nèi)的有害昆蟲及鼠類。提高禽群的抵抗力，盡量減少應(yīng)激的發(fā)生，注意秋冬、冬春的季節(jié)變化，做好防寒保暖工作。

（3）對于出現(xiàn)死亡和產(chǎn)蛋率下降的雞群可以使用提高免疫力的中草藥配合敏感的抗菌藥物用于治療腸炎和輸卵管炎，如并發(fā)呼吸道癥狀，再配合多西環(huán)素或泰樂菌素等，出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降時，飼料中添加維生素B12、亞硒酸鈉、維生素E等。

發(fā)生低致病性禽流感時應(yīng)采取“免疫為主，治療、消毒、改善飼養(yǎng)管理和防止繼發(fā)感染為輔”的綜合措施。通過及時治療，爭取縮短病程，控制繼發(fā)感染，使雞群較快耐過，減輕損失。一般來說，所用藥物應(yīng)包括以下功效：抑制病毒增殖（須在發(fā)病早期用藥）；增強機(jī)體免疫功能，使機(jī)體對感染的病毒盡快產(chǎn)生免疫力；退熱，促使病雞精神好轉(zhuǎn)，盡快恢復(fù)正常采食；防止細(xì)菌性繼發(fā)感染，阻止死亡，緩解呼吸道癥狀，保護(hù)生殖系統(tǒng)。前三項功效可考慮以中藥制劑為主，抗菌以西藥為主。具體方法如下：

（1）禽流感多價卵黃抗體或抗血清，雛雞用量1～2ml，青年雞和成年雞2～3ml，肌內(nèi)注射，每天1次，連用2d。

（2）中藥與抗菌西藥結(jié)合，如每羽成年雞按板藍(lán)根注射液（口服液）1～4ml，一次肌內(nèi)注射/口服；阿莫西林按0.01%～0.02%濃度混飲或混飼，每天2次，連用3～5d。

（3）用金絲桃素（貫葉、連翹提取物），預(yù)防劑量為每噸飼料中添加 400g，連用7d；治療劑量為每只雞用50～60毫克，連用3～4d。

（六）實驗室檢測

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 18936—2003。

1.病毒分離與鑒定技術(shù)

（1）材料準(zhǔn)備

1）病料的采集：死禽采集氣管、脾、肺、肝、腎和腦組織樣品，進(jìn)行分別處理或者同時處理；活禽病料采集應(yīng)包括氣管或泄殖腔拭子，尤其是采集氣管拭子更好；小珍禽用拭子采樣容易造成損傷，可采集新鮮糞便。

2） 病料應(yīng)放在含有抗生素的pH值應(yīng)調(diào)至7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）內(nèi)（無PBS可用25%～50%的甘油鹽水）。抗生素的選擇應(yīng)視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中應(yīng)含有青霉素（2000IU/ml）、鏈霉素（2mg/ml）、慶大霉素（50μg/ml）和制霉菌素（1000IU/ml），但糞便和泄殖腔拭子，所有的抗生素應(yīng)提高5倍，加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0～7.4。在室溫防治1～2h后，樣品應(yīng)盡快處理，沒有條件的可在4℃存放幾天，也可與低溫條件下保存（－70℃貯存最好）。

3）病料的處理：將棉拭子充分捻動、擰干后棄去拭子：糞便、捻碎的組織用含抗生素的pH 7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10～20g/100ml（g/ml）的懸液。樣品經(jīng)1000r/min離心10min，取上清液作為接種材料。

（2）病毒分離

1）樣品接種：取處理好的樣品，以0.2ml/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9～11日齡SPF雞胚，每個樣品接種5個胚，與35～37℃孵化箱內(nèi)孵育，18h后每8h觀察雞胚死亡情況。

2）病毒收獲：無菌收取18h以后的死胚以及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測血凝活性，陽性反應(yīng)說明可能有正黏病毒科的流感病毒；若無血凝活性或血凝價很低，則用尿囊液繼續(xù)傳2代，若仍為陰性，則認(rèn)為病毒分離陰性。

（3）病毒鑒定

1）A型流感病毒的特異性鑒定：樣品接種雞胚后，若雞胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性雞胚的絨毛囊膜（CAM）制成抗原，與A型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行AGID試驗，檢測樣品中是否含有A流感病毒。

① 抗原制備：從具有血凝活性的雞胚中取出絨毛尿囊膜，用pH7.2的PBS沖洗后，將CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反復(fù)凍融3～4次，以1000r/min后取上清，按終濃度為0.1%的量加入甲醛溶液。置37℃溫箱滅活36h做滅活檢驗后即可作為AGID試驗用抗原，用禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行特異性鑒定，若被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間出現(xiàn)清晰的沉淀線即可判定樣品中標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行特異性鑒定，若被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間出現(xiàn)清晰的沉淀線，即可判定樣品中含有A型禽流感病毒。

② AGID試驗方法：按“3.瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗”中的方法進(jìn)行。

2）血凝素亞型鑒定：當(dāng)雞胚尿囊液具有血凝活性時，首先應(yīng)排除血凝活性是否由新城疫、減蛋綜合征等病毒引起，同時要注意是否有禽流感病毒與其他病毒混合感染。雞胚尿囊液具有血凝活性或證明含有A型流感病毒存活后，采用HA～HI試驗方法，用禽流感病毒15種血凝素（H1～H15）亞型分型血清對樣品進(jìn)行病毒亞型鑒定。血凝素亞型鑒定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在國家指定的實驗室進(jìn)行。

（4）致病性測定

禽流感病毒致病性測定應(yīng)在具有高度生物安全性的實驗室中進(jìn)行，有以下兩種方法，任選其一。

1）靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）測定法

① 試驗雞：6周齡SPF雞，10只。

② 接種材料：感染雞胚的尿囊液，血凝價在4log2以上，未混有任何細(xì)菌和其他病毒。

③ 接種方法：將感染雞胚尿囊液用生理鹽水1∶10稀釋，以0.1ml/羽的劑量翅靜脈接種。

④ 每日觀察每只雞的發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10d，計算IVPI值。

⑤ 判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)IVPI值大于1.2時，判定此份離株為高致病性禽流感（HPAI）病毒株。

2）致死比例法測定

① 試驗雞：4～8周齡SPF雞，8只。

② 接種材料：感染雞胚的尿囊液，血凝價在4log2以上，未混有任何細(xì)菌和其他病毒。

③ 接種方法：將感染雞胚尿囊液用生理鹽水1∶10稀釋，以0.2ml/羽的劑量翅靜脈接種。每日觀察雞的死亡情況，連續(xù)觀察10d。

④ 判定方法

a.接種10d內(nèi)能導(dǎo)致6～8只雞死亡，判定該毒株為高致病性禽流感毒株。

b.分離物能使1～5只雞致死，但病毒不是H5或H7亞型，則應(yīng)進(jìn)行以下試驗：將病毒接種于細(xì)胞培養(yǎng)物上，觀察其胰蛋白酶缺乏時是否引起細(xì)胞病變或形成蝕斑。如果病毒不能在細(xì)胞上生長，則分離物應(yīng)被考慮為非高致病性禽流感病毒。

c.對低致病性的所有H5或H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的細(xì)胞上能夠生長時，則應(yīng)進(jìn)行與血凝素有關(guān)的肽鏈的氨基酸序列分析，如果分析結(jié)果同其他高致病性禽流感病毒相似，這種被檢驗的分離物應(yīng)被考慮為高致病性禽流感病毒。

2.血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗

（1）原理　禽流感病毒表面的血凝素能與豚鼠和雞的紅細(xì)胞表面的血凝素受體結(jié)合，引起紅細(xì)胞凝集。

（2）適用范圍　主要用于檢測禽流感免疫禽血清抗體效價。

（3）試驗器材和試劑

1）96孔110°V形血凝板

2）微量移液器（50μl、25μl）帶滴頭

3）微量振蕩器

4）禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型陽性血清

5）阿氏（Alsevers）液、1%雞紅細(xì)胞懸液，配制方法見附錄A

6）pH7.2 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）

（4）HA試驗方法

1）在微量反應(yīng)板的1～12孔均加入0.025ml PBS，換滴頭。

2）吸取0.025ml病毒懸液加入第1孔，混勻。

3）從第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025ml棄之，換滴頭。

4）每孔再加入0.025ml PBS。

5）每孔均加入0.025ml 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。

6）振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1h）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。

7）結(jié)果判定：將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見表1-1）。

能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（－），否則此次檢驗無效。

（5）血凝抑制（HI）試驗方法

1）根據(jù)（4）試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1∶256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶64（256除以4）。

2）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。

3）吸取0.025ml血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025ml于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025ml棄去。

4）1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025ml，室溫（約20℃）靜置至少30min。

5）每孔加入0.025ml體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，振蕩混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進(jìn)行1h），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)紐扣狀沉于孔底。

6）結(jié)果判定

以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。

只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于3log2判定HI試驗陰性；HI價等于4log2為可疑，需重復(fù)試驗；HI價大于或等于5log2為陽性。

3.瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗

（1）材料準(zhǔn)備

1）硫柳汞溶液、pH7.2、0.01mol/PBS溶液，配制方法見附錄B。

2）瓊脂板：制備方法見附錄C。

3）禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清。

（2）操作方法

1）打孔：在制備的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔（中間1孔，周圍6孔），孔徑5mm，孔距2～5mm。將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向?qū)傊舫觯饌吘壔蚴弓傊瑢用撾x皿底。

2）封底：用酒精燈清烤平皿底部至瓊脂剛剛要融化為止，封閉孔的底部，以防側(cè)漏。

3）加樣：用微量移液器或帶有6～7號針頭的0.25ml注射器，吸取抗原懸液滴入中間孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別加入外周的1和4孔中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個外周孔。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品應(yīng)換一個滴頭。

4）作用：加樣完畢后，靜置5～10min，然后將平皿輕輕倒置，放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中作用，分別在24h、48h和72h觀察并記錄結(jié)果。

（3）結(jié)果判定

1）判定標(biāo)準(zhǔn)

將瓊脂板置日光燈或側(cè)強光下觀察，若標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原之間出現(xiàn)一條清晰的白色沉淀線，則試驗成立。

2）判定標(biāo)準(zhǔn)

① 若被檢血清孔與中心抗原孔之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀線，且該線與抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間沉淀線的末端相吻合，則被檢血清判為陽性。

② 被檢血清與中心孔之間雖不出現(xiàn)沉淀線，但標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線一端向被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲，則此孔的被檢樣品判為弱陽性（凡弱陽性者應(yīng)重復(fù)試驗，仍為弱陽性者判為陽性）。

③ 若被檢血清孔與中心抗原孔之間不出現(xiàn)沉淀線，且標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陽性。

④ 被檢血清孔與中心抗原孔之間沉淀線粗而混濁或標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間的沉淀線交叉并直伸，被檢血清孔為非特異反應(yīng)，應(yīng)重做，若仍出現(xiàn)非特異性反應(yīng)則判為陰性。

4.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA）

（1）材料準(zhǔn)備

1）酶標(biāo)板、加樣器（帶滴頭）、酶標(biāo)測定儀。

2）使用溶液的配制：方法見附錄D。

3）間接ELISA抗原，間接ELISA酶標(biāo)抗體。

4）抗原包被板制備：方法見附錄E。

（2）操作步驟

1）樣品制備：將被檢血清用稀釋液做1∶400稀釋。

2）加樣：取出抗原包被板，倒掉孔內(nèi)包被液，用洗液洗3次。除A1、B1、C1和D1孔不加樣品，留做空白調(diào)零，陰性血清和陽性血清做對照各占1孔外，其余孔加1∶400稀釋的被檢血清，每孔100μl，將加樣位置做好記錄，將反應(yīng)板蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。

3）洗滌：倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上空干，每孔加滿洗液，靜置1～2min后倒掉，空干，再重復(fù)洗2次。

4）加酶標(biāo)抗體：除A1、B1、C1和D1孔外，其余每孔加酶標(biāo)抗體液100μl，蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。

5）洗滌：洗滌方法同3）。

6）加底物：加底物使用液，每孔90μl，置室溫避光顯色2～3min。

7）終止：加終止液，每孔90μl，使其終止反應(yīng)。

（3）結(jié)果判定　用酶標(biāo)儀測定每個孔在490nm波長的光密度值（即OD值），OD≥0.2者判為陽性，0.18≤OD<0.2需重復(fù)測試1次，若仍在此范圍判為陽性，OD<0.18者判定為陰性。

5.禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法

（1）依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 19438.1—2004。

（2）縮略語

熒光RT-PCR：熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

RNA：核糖核酸。

DEPC：焦碳酸乙二脂

PBS：磷酸鹽緩沖鹽水（配方見附錄F）

Taq酶：Taq DNA聚合酶。

（3）實驗原理　禽流感病毒各亞型均屬A型流感病毒，根據(jù)A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。該探針與禽流感病毒特有的共同基因特異性結(jié)合，結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域內(nèi)。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5’端標(biāo)記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測儀器接受，成為報告熒光基團(tuán)（用R表示），3’端一般標(biāo)記TAMRA熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收5’端報告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號，成為淬滅熒光基團(tuán)（用Q表示）。

當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結(jié)合，此時探針上的R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測不到R所發(fā)出的熒光信號；當(dāng)PCR反應(yīng)在延伸階段時，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種核苷酸為底物，根據(jù)堿基配對的原則，沿著模板鏈形成新鏈；當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位，受到探針的阻礙而無法繼續(xù)，此時的Taq酶發(fā)揮它的5’→3’外切核酸酶的功能，將探針?biāo)獬蓡魏塑账幔璧K，與此同時在探針上的R基團(tuán)游離出來，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測儀所接收；在Taq酶的作用下繼續(xù)延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團(tuán)均游離于溶液中，儀器可繼續(xù)被檢測到R所發(fā)出的熒光信號。

（4）材料與試劑

① 儀器與器材

熒光RT-PCR檢測儀

高速臺式離心機(jī)（離心速度12000r/min以上）

臺式離心機(jī)（離心速度3000r/min）

混勻器

冰箱（2～8℃和－20℃兩種）

微量可調(diào)移液器（10μl、100μl、1000μl）及配套帶濾芯吸頭

Eppendorf管（1.5ml）

② 試劑

除特別說明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器（用DEPC水處理后高壓滅菌）分裝。

氯仿：－20℃預(yù)冷；

PBS：121℃±2℃，15min高壓滅菌冷卻后，無菌條件下加入青霉素、鏈霉素各10000IU/ml；

75%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水（符合GB 6682要求）配制，－20℃預(yù)冷；

禽流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒：組成、功能及使用注意事項見附錄G。

（5）抽樣

① 采樣工具

② 樣品采樣

a.活禽

取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

——取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮3～5次取咽喉分泌液；

——取泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便；

——將拭子一并放入盛有1.0ml PBS的1.5ml Eppendorf管中，加蓋、編號。

b.肌肉或組織臟器：待檢樣品裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號，送實驗室。

c.血清、血漿：用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。

③ 樣品貯運：樣品采集后，放入密閉的塑料袋內(nèi)（一個采樣點的樣品，放一個塑料袋），于保溫箱中加冰、密封、送實驗室。

④ 樣品制備

咽喉、泄殖腔拭子：樣品在混合器上充分混合后，用高壓滅菌鑷子將拭子中的液體擠出，室溫放置30min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5ml Eppendorf管中，編號備用。

⑤ 樣本存放。制備的樣本在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存應(yīng)置－70℃以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。

（6）操作方法

① 實驗室標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置與管理。禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法的實驗室規(guī)范（見附錄H）。

② 樣本的處理。在樣本制備區(qū)進(jìn)行。

a.取n個滅菌的1.5ml Eppendorf管，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中以標(biāo)出），編號。

b.每管加入600μl裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μl，一份樣本換用一個吸頭，再加入200μl氯仿，混勻器上振蕩混勻5s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻）。于4℃、12000r/min離心15min。

c.取與a.相同數(shù)量滅菌的1.5ml Eppendorf管，加入500μl異丙醇（－20℃預(yù)冷），做標(biāo)記。吸取本標(biāo)準(zhǔn)b.各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取500μl，不能吸出中間層，顛倒混勻。

d.于4℃、12000r/min離心15min（Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，放置于吸水紙上，蘸干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方蘸干）；加入600μl 75%乙醇，顛倒洗滌。

e.于4℃、12000r/min離心10min（Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，放置于吸水紙上，蘸干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方蘸干）。

f.4000r/min離心10s（Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥3min，不能過于干燥，以免RNA不溶。

g.加入11μl DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腞NA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；若需長期保存須放置－70℃冰箱。

③ 檢測

a.擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備：在反應(yīng)混合物制備區(qū)進(jìn)行。

從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2000r/min離心5s。設(shè)所需熒光RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見表1-2：

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入適當(dāng)?shù)捏w積中，向其中加入0.25×n顆RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶顆粒，充分混合均勻，向每個熒光RT-PCR管中各分裝15μl，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

b.加樣：在樣品處理區(qū)進(jìn)行。

在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟②、g中制備的RNA溶液各10μl，蓋緊管蓋，500r/min離心30s。

c.熒光RT-PCR檢測：在檢測區(qū)進(jìn)行。

將b.中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。

循環(huán)條件設(shè)置。

第一階段，反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；

第二階段，預(yù)變性92℃/3min；

第三階段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5個循環(huán)；

第四階段，92℃/10s，60℃/30s，40個循環(huán)，在第四階段每個循環(huán)的退火延伸時收集熒光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線Ct值判定結(jié)果。

（7）結(jié)果判定

① 結(jié)果分析條件設(shè)定：直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。

② 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a.陰性對照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線。

b.陽性對照的Ct值應(yīng)<28.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次試驗視為無效。

③ 結(jié)果描述及判定

a.陰性：無Ct值并且無擴(kuò)增曲線，表示樣品中無禽流感病毒。

b.陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在禽流感病毒。

c.有效原則：Ct值>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無Ct值者為陰性，否則為陽性。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

HA和HI試驗用溶液的配制

A.1　阿氏（Alsevers）液配制

葡萄糖　　　　　 　　　　　　　　2.05g

檸檬酸鈉　　　　　　　　　　　　0.8g

檸檬酸　　　　　　　　　　　　　0.055g

氯化鈉　　　　　　　　　　　　　0.42g

加蒸餾水至100ml，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

A.2　1%雞紅細(xì)胞懸液制備

采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積的阿氏液混合，用pH7.2 0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

附錄B

（規(guī)范性附錄）

AGP試驗用溶液的配制

B.1　1%硫柳汞溶液的配制

硫柳汞　　　　　　　　　　　　　1.0g

加蒸餾水至100ml

溶解后，置100ml瓶中蓋好塞子存放備用。

B.2　pH7.2、0.01mol/L PBS的配制

（a）配制25×PB：稱重2.74g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至100ml。

（b）配制1×PBS：量取40ml 25×PBS，加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1000ml。

（c）用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2。

（d）滅菌或過濾。

（e）PBS一經(jīng)使用，于4℃保存不超過3周。

附錄C

（規(guī)范性附錄）

瓊脂板的制備

稱量瓊脂糖1.0g，加入100ml的pH7.2、0.01mol/L PBS液中在水浴中煮沸充分融化，加入8g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml。冷至45～50℃時，將潔凈干熱滅菌直徑為90mm的平皿置于平臺上，每個平皿加入18～20ml，加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發(fā)，放普通冰箱中保存?zhèn)溆茫〞r間不超過2周）。

附錄D

（規(guī)范性附錄）

高致病性禽流感間接ELISA使用溶液的配制

D.1　碳酸鹽緩沖液（0.05mol/L、pH9.6，CBS）

碳酸鈉　　　　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氫鈉　　　　　　　　　　　　　　2.93g

用雙蒸水溶解至1000ml，于4℃保存，不超過1個月。

D.2　磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L、pH7.4，PBS）

氯化鈉　　　　　　　　　　　　　　　8g

磷酸二氫鈉　　　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）　　　　2.9g

氯化鉀　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

加蒸餾水至1000ml

D.3　洗液（含0.05% 吐溫-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS即PBST）

吐溫-20 　　　　　　　　　　　　　　0.5ml

加0.01mol/L、pH7.4的PBS至1000ml

D.4　封閉液（含0.5%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA）　　　　　　　　0.5g

加洗液至100ml

4℃存放，避光。

D.5　稀釋液（含1%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA）　　　　　　　　0.1g

加洗液至100ml

4℃存放，避光。

D.6　間接ELISA底物緩沖液（磷酸氫二鈉-檸檬酸，pH5.4）

0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）　　　　26.7ml

0.1mol/L檸檬酸　　　　　　　　　　　　 　　　24.3ml

雙蒸水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　49ml

準(zhǔn)確稱量40mg鄰苯二胺（OPD），溶解后置暗處保存，臨用前加入30%過氧化氫150μl。

D.7　三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（0.05mol/L，pH7.6）

0.1mol/L Tris　　　　　　　　　　　250ml

0.1mol/L鹽酸　　　　　　　  　　　192.5ml

雙蒸水　　　　　　　　　　　  　　57.5ml

D.8　間接ELISA終止液

濃硫酸　　　                                     　11.1ml

蒸餾水　　　                                     　88.9ml

附錄E

（規(guī)范性附錄）

高致病性禽流感間接ELISA抗原包被板制備

抗原包被板也稱診斷板，將高致病性禽流感病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋成3μg/ml（全病毒抗原）或6μg/ml（重組核蛋白抗原），包被40孔聚苯乙烯微量板，每孔100μl，置4℃冰箱過夜，用洗液洗滌3次，用封閉液于37℃濕盒內(nèi)封閉60min，用洗滌液洗滌3次，干燥后即為診斷板，置4℃冰箱備用。

附錄F

（規(guī)范性附錄）

磷酸鹽緩沖鹽水配方

以下所用試劑均為分析純。

F.1　A液

0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液

NaH2PO4·H2O 27.6g，溶于蒸餾水，最后稀釋至1000ml。

F.2　B液

0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液

Na2HPO4·7H2O 53.6g（或Na2HPO4·2H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g），加蒸餾水溶解，最后稀釋至1000ml。

F.3　0.01mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖鹽水的配制

0.2mol/L　A液　　　               　14ml

0.2mol/L　B液　　                　　36ml

加NaCl 　　                             　　8.5g

用蒸餾水稀釋至1000ml

附錄G

（資料性附錄）

試劑盒的組成

G.1　試劑盒組成

每個試劑盒可做48個檢測，包括以下成分：

裂解液　　　　　　　　　　　　　　　   　           　　　30ml×1盒

DEPC水　　　　　　　　　　　　　　　　            　   　1ml×1管

RT-PCR反應(yīng)液（內(nèi)含禽流感病毒的引物、探針）        750μl×1管

RT-PCR酶　　　　　　　　　　　　　　　　　            　1顆/管×12管

Taq酶　　　　　　　　　　　　　　　　　　　             　12μl×1管

陰性對照　　　　　　　　　　　　　　　　                   　1ml×1管

陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA）　　　　  　             　1ml×1管

G.2　說明

（1）裂解液的主要成分為異硫氰酸胍和酚，為RNA提取試劑，外觀為紅色液體，于4℃保存。

（2）DEPC水，是用1%DEPC處理后的去離子水，用于溶解RNA。

（3）RT-PCR反應(yīng)液中含有特異性引物、探針及各種離子。

G.3　功能

試劑盒可用于禽類相關(guān)樣品（包括肌肉組織、臟器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血漿等）中禽流感病毒的檢測。

G.4　使用時的注意事項

（1）在檢測過程中，必須嚴(yán)防不同樣品間的交叉感染。

（2）反應(yīng)液分裝時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。

RT-PCR酶顆粒極易吸潮失活，必須在室溫條件下置于干燥器內(nèi)保存，使用時取出所需數(shù)量，剩余部分立即放回干燥器內(nèi)。

附錄H

（規(guī)范性附錄）

禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法的實驗室規(guī)范

H.1　實驗室設(shè)置要求

實驗室設(shè)置要求如下：

——實驗室分為三個相對獨立的工作區(qū)域：樣本制備區(qū)、反應(yīng)混合物制備區(qū)和檢測區(qū)；

——工作區(qū)域須有明確標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用；

——每一區(qū)域須有專用的儀器設(shè)備；

——整個實驗過程中均須使用無RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前須250℃干烤4h以上，以徹底去除RNA酶；

——各區(qū)域的儀器設(shè)備須有明確標(biāo)記，以避免設(shè)備物品從各自的區(qū)域內(nèi)移出，造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆；

——進(jìn)去各個工作區(qū)域嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從樣本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制區(qū)至檢測區(qū)；

——在不同的工作區(qū)域內(nèi)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別，離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出；

——實驗室清潔時應(yīng)按樣本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物制備區(qū)至檢測區(qū)的順序進(jìn)行；

——不同的試驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

H.2　工作區(qū)域儀器設(shè)備配置

（1）樣本制備區(qū)　樣本制備區(qū)需配置如下儀器設(shè)備：

——2～8℃冰箱；

——－20℃冰箱；

——高速臺式冷凍離心機(jī)（4℃，12000r/min）；

——混勻器；

——微量加樣器（0.5～10μl，5～20μl，20～200μl，200～1000μl）；

——可移動紫外燈（進(jìn)工作臺面）。

（2）反應(yīng)混合物配制區(qū)　反應(yīng)混合物制備區(qū)需配置如下儀器設(shè)備：

——2～8℃冰箱；

——－20℃冰箱；

——高速臺式冷凍離心機(jī)（3000r/min）；

——混勻器；

——微量加樣器（0.5～10μl，5～20μl，20～200μl，200～1000μl）；

——可移動紫外燈（進(jìn)工作臺面）。

（3）檢測區(qū)　檢測區(qū)需配置如下儀器設(shè)備：

——熒光PCR儀（配計算機(jī)）；

——移動紫外燈；

——打印機(jī)。

H.3　各工作區(qū)域功能及注意事項

（1）樣本制備區(qū)　樣本制備區(qū)的功能及注意事項如下；

——標(biāo)本的保存，核酸提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管在樣本制備區(qū)進(jìn)行；

——避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。可在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件以避免臨近區(qū)的氣溶膠進(jìn)入本區(qū)造成污染。為避免樣本之間的交叉污染，加入待測核酸后，必須立即蓋嚴(yán)含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管；

——用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒容器內(nèi)（例如含次氯酸鈉溶液）。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始樣本、提取過程樣本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，必須清潔處理并作出記錄；

——對實驗臺適當(dāng)?shù)淖贤庹丈洌?/span>254nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染。工作后通過移動紫外線燈管來確保對實驗臺面的充分照射。

（2）反應(yīng)混合物配制區(qū)　反應(yīng)混合物配制區(qū)功能及注意事項如下：

——試劑的分裝盒反應(yīng)混合液的制備在本區(qū)進(jìn)行；

——用于標(biāo)本制備的試劑應(yīng)直接運送至反應(yīng)混合物配制區(qū)，不能經(jīng)過檢測區(qū)，在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒；

——在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換，工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。在本區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉等化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面用可移動紫外燈（254nm波長）進(jìn)行照射。

（3）檢測區(qū)　檢測區(qū)功能及注意事項如下：

——RT-PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增片段的分析在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行；

——本區(qū)注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動；

——完成操作及每天工作后都必須對實驗臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。