- 基因工程藥物研究與應用
- 李校堃主編
- 18238字
- 2021-04-16 15:28:41
三、不同表達系統中影響發酵（培養）的主要因素及控制
目前基因重組蛋白的表達系統主要分為大腸埃希菌表達系統、酵母表達系統、哺乳動物表達系統、昆蟲表達系統、轉基因動物表達系統及轉基因植物表達系統。各表達系統的優缺點如表4-4所示。
表4-4 不同表達系統優缺點
這里主要針對基因重組蛋白中常用的微生物表達系統、哺乳動物細胞表達系統的發酵（培養）主要因素及控制進行概述。
(一)微生物表達系統 1.培養方法
基因工程菌常用的培養方式有分批發酵（batch fermentation）、補料分批發酵（fed-batch fermentation）、連續發酵（continuous fermentation）、透析培養、固定化培養等。
分批發酵是指在一個密閉系統內投入有限數量的營養物質后，接入工程菌種進行培養，使其生長繁殖和產物合成。除了不斷進行通氣（好氧發酵）和為調節發酵液的pH而加入酸堿溶液外，與外界沒有其他物料交換的一種發酵方式。其優點是工藝操作簡單，比較容易解決雜菌污染等問題；缺點是菌體產量及表達量相對低，生產周期長，設備有效利用率低，生產成本高。
補料分批培養是介于分批發酵和連續發酵之間的一種發酵技術，又稱半連續發酵，是指在分批發酵過程中間歇或連續地補加新鮮培養基或某些營養物質，但并不連續地向外放出發酵液的發酵技術，是目前應用最廣泛的發酵技術，是實現高密度培養的關鍵要素。補料方式分為非反饋補料（包括恒速補料、變速補料、指數補料）和反饋補料（包括恒溶氧法、恒pH法、菌體濃度反饋法、CERT法、DO-stat法）。和傳統的分批發酵相比，補料分批發酵可以降低底物對工程菌生長及產物合成的抑制，有效提高產量及表達量，染菌和退化的概率小，保持質粒穩定性，設備有效利用率高，降低生產成本，并對發酵過程可實現優化控制。
連續培養又叫開放培養，是指菌體培養達到一定濃度后，以一定的流速向發酵罐內添加新鮮培養基，同時以相同速度流出培養液，以控制一定稀釋率，進行不間斷培養的發酵過程。其優點可為工程菌提供恒定的生長環境，控制其比生長速率、產物穩定，設備利用率高；缺點是較分批發酵營養成分利用率和產物濃度較低，染菌概率和質粒不穩定增大并對設備要求較高。
透析培養是利用膜的半透性原理使代謝產物和培養基分離，通過去除培養液中的代謝產物來解除其對生產菌的不利影響。采用膜透析裝置在發酵過程中用蠕動泵將發酵液打入罐外的膜透析器的一側循環，其另一側通入透析液循環。用這種方法培養，微生物可不斷地受到新營養的補給，同時也不斷地排出代謝副產物如醋酸等，因此可以延長對數期的增殖，獲得高密度菌體。膜的種類、孔徑、面積，發酵液和透析液的比例，透析液組成，循環流速，開始透析的時間和透析培養的持續時間等都對產物的產率有影響。該方法的優點是解決了傳統發酵過程中，由于醋酸等代謝副產物的積累影響菌體的生長和外源基因的表達。
固定化培養就是將被培養生物體固定在一定的培養基上進行培養的過程。基因工程菌經固定化培養后，解決了質粒的穩定性問題，便于進行連續培養，特別對分泌型菌更為有利。
2.影響因素 （1）溫度對發酵的影響及控制：
在影響微生物生長繁殖的各種物理因素中，溫度是最重要因素之一。由于微生物的生長繁殖和產物的合成都是在各種酶的催化下進行的，而溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發酵過程中必須保證穩定而又合適的溫度環境。溫度對發酵的影響是多方面的，對微生物細胞的生長和代謝、產物合成的影響是各種因素綜合表現的結果。
1）溫度對微生物細胞生長的影響：
大多數微生物適宜在20～40℃的溫度范圍內生長，嗜冷菌在溫度低于20℃生長速率最大，嗜中溫菌在30～35℃生長，嗜熱菌在50℃以上生長。在最適宜的溫度范圍內，微生物的生長速率可以達到最大，當溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度的增加或降低而下降。
溫度對細胞生長的影響是多方面的。一方面在其最適溫度范圍內，生長速率隨溫度的升高而增加，一般當溫度增加10℃，生長速率大致增長1倍。這是由于生長代謝以及繁殖都是酶促反應，根據酶促反應的動力學來看，溫度升高，反應速度加快，呼吸強度加強，必然最終導致細胞生長繁殖加快。當溫度超過最適生長溫度，生長速率將隨溫度的增加而迅速下降。高溫會使微生物細胞內的蛋白質發生變性或者凝固，同時破壞微生物細胞內的酶活性，從而殺死微生物。溫度越高，微生物的死亡就越快。微生物的種類不同，所具有的酶系及其性質不同，生長所要求的溫度也不同。即使同一種微生物，由于培養條件的不同，其最適的溫度也有所不同。另一方面，不同生長階段的微生物對溫度的反應不同，處于遲滯期的細菌對溫度最敏感。將其置于最適生長溫度，可以大大縮短遲滯期，反之會增加發酵時間。對于對數生長期的細菌，即使在發酵過程中升溫，對其破壞作用也較弱。因此一般在發酵過程中，在最適溫度范圍內提高對數生長期的溫度，即加快菌體生長，又避免了熱作用的破壞。
2）溫度對發酵產物的影響：
溫度除了影響發酵過程中菌體生長和產物形成外，還通過影響基質和氧在發酵液中的溶解速度和傳遞速率，影響菌對某些基質的分解吸收速度，使生物合成途徑發生改變。如在某些重組工程菌的表達過程中，在較低溫度下以可溶或大部分為可溶的形式表達目的蛋白，而在較高溫度下易形成包含體。
3）溫度的控制：
最適溫度的選擇：最適發酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產物合成的溫度。但最適生長溫度與最適生產溫度往往是不一致的。各種微生物在一定條件下，都有一個最適的溫度范圍。微生物種類不同，所具有的酶系不同，所要求的溫度不同。同一微生物，培養條件不同，最適溫度不同。
最適發酵溫度隨著菌種、培養基成分、培養條件和菌體生長階段不同而改變。理論上，整個發酵過程中不應只選一個培養溫度，而應根據發酵不同階段，選擇不同的培養溫度。在生長階段，應選擇最適生長溫度；在產物生成階段，應選擇最適生產溫度。發酵溫度可根據不同菌種、不同產品進行控制。但在工業發酵中，由于發酵液的體積很大，升降溫度都比較困難，所以在整個發酵過程中，往往采用一個比較適合的恒定培養溫度，使得到的產物產量最高，或者在可能條件下進行變溫發酵。
溫度的控制：在發酵過程中隨著微生物對營養物質的利用，以及機械攪拌的作用，將產生一定的熱能。同時因為罐壁散熱、水分蒸發等也會帶走部分熱量。在發酵過程中，引起溫度變化的原因是由于發酵過程中所產生的凈熱量，稱為發酵熱（Q 發酵）。它包括生物熱、攪拌熱、蒸發熱、通氣熱、輻射熱和顯熱等。因此，要維持一定的發酵溫度，必須采取保溫措施，利用自動控制或手動調整的閥門，將冷卻水通入發酵罐的夾層或蛇形管中，通過熱交換來降溫，保持恒溫發酵。如果氣溫較高，作為冷卻水的地表水溫度又高于所控制的溫度，致使冷卻效果差，達不到預定的溫度，須采用冷凍鹽水進行循環式降溫，以迅速降到最適發酵溫度。因此大工廠需要建立冷凍站，提高冷卻能力，以保證發酵在最適溫度下進行。
（2）pH對發酵的影響及其控制：
pH是影響微生物生長和產物合成最重要的因素之一，是代謝活動的綜合指標。不同種類的微生物對pH的要求不同。大多數細菌最適pH為6.5～7.5，真菌一般為4.0～5.8，酵母為3.8～6.0，放線菌為6.5～8.0。控制適宜的pH不僅能保證微生物正常生長與產物的合成，還是防止雜菌污染的有效措施。
1）pH對發酵的影響：
發酵培養基的pH對微生物生長具有非常明顯的影響，也是影響發酵過程中各種酶活性的重要因素。pH對微生物的生長繁殖和產物合成的影響有以下幾個方面：影響酶的活性，當pH抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝；影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養物質的吸收和代謝產物的排泄；影響培養基中某些組分的解離，進而影響微生物對這些成分的吸收；pH不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發生改變。
培養基中營養物質的代謝是引起pH變化的主要原因，發酵液pH的變化是菌體代謝的綜合效果。由于pH不當，可能嚴重影響菌體的生長和產物的合成，因此對微生物發酵來說有各自的最適生長pH和最適生產pH。各種不同的微生物，對pH的要求不同。在微生物的生長過程和產物的合成過程的最適pH也可能有所不同。多數微生物生長都有最適pH范圍及其變化的上下限：上限都在8.5左右，超過此上限，微生物將無法忍受而自溶；下限以酵母為最低（2.5），但菌體內的pH一般認為是中性附近。pH對產物的合成有明顯的影響，因為菌體生長和產物合成都是酶反應的結果，僅僅是酶的種類不同而已，因此代謝產物的合成也有自己最適的pH范圍。另外，pH還會影響某些菌的形態。
2）發酵過程pH的變化：
在發酵過程中，pH往往處于動態變化中。pH的變化決定于所用的菌種、培養基的成分和培養條件。在產生菌的代謝過程中，菌體本身具有一定的調整周圍環境pH、構建最適pH的能力。但外界條件發生較大變化時，pH將會不斷波動。一方面，微生物通過代謝活動分泌有機酸如乳酸、醋酸、枸櫞酸等或一些堿性物質，導致發酵環境的pH變化；另一方面，微生物通過利用發酵培養基中的酸性物質或堿性物質，導致發酵環境的pH變化。
培養基中的營養物質的代謝也是引起pH變化的重要原因。微生物生長或合成產物過程中消耗碳源釋放二氧化碳，pH降低；消耗蛋白質或其他含氮有機物釋放氨，pH上升。發酵所用的碳源種類不同，pH變化也不一樣。發酵液的pH變化是菌體代謝反應的綜合結果。從代謝曲線的pH變化就可以推測發酵罐中的各種生化反應的進展和pH變化異常的可能原因。在發酵過程中，要選擇好發酵培養基的成分及其配比，并控制好發酵工藝條件，才能保證pH不會產生明顯的波動，維持在最佳的范圍內，得到良好的結果。實踐證明，維持穩定的pH，對產物的形成有利。
3）發酵pH的確定和控制：
發酵pH的確定：微生物發酵的最適pH范圍一般是在5～8之間，但發酵的pH又隨菌種和產品不同而不同。由于發酵是多酶復合反應系統，各酶的最適pH也不相同，因此，同一菌種，生長最適pH可能與產物合成的最適pH是不一樣的。因此，應該按發酵過程的不同階段分別控制不同的pH范圍，使產物的產量達到最大。
最適pH是根據試驗結果來確定的。將發酵培養基調節成不同的出發pH進行發酵，在發酵過程中，定時測定和調節pH以維持出發pH，或者利用緩沖液配制培養基來維持。定時觀察菌體的生長情況，以菌體生長達到最高值的pH為菌體生長的最適pH。以同樣的方法，可測得產物合成的最適pH。但同一產物的最適pH，還與所用的菌種、培養基組成和培養條件有關。在確定發酵最適pH時，要不定期考慮培養溫度的影響，若溫度提高或降低，最適pH也可能發生變動。
pH的控制：發酵過程中為穩定保持最適pH，首先需要考慮和試驗發酵培養基的基礎配方，使它們有個適當的配比，使發酵過程中的pH變化在合適的范圍內。在培養基的組成中加入一定量的碳酸鈣或磷酸鹽，形成緩沖溶液調節發酵過程中的pH變化；還可以在培養基中加入一定量的生理酸性或生理堿性化合物，中和代謝過程中產生的酸或堿，以維持一定pH。利用上述方法調節pH的能力是有限的，如果達不到要求，可以在發酵過程中直接補加酸、堿或補料的方式來控制，特別是補料的方法，效果比較明顯。過去是直接加入酸（如HCl）或堿（如NaOH）來控制，但現在常用的是以碳源（如葡萄糖）和堿性物質（如氨水、尿素）來控制。它們不僅可以調節pH，還可以補充碳源或氮源。當發酵的pH降低時，補加氨水，就可達到調節pH和補充氨氮的目的；反之，pH升高，就補加碳源。
目前，常采用補料的方法來調節pH，這種方法既可以達到穩定pH的目的，又可以不斷補充營養物質，解除對產物合成的阻遏作用，提高產物產量。也就是說，采用補料的方法，可以同時實現補充營養、延長發酵周期、調節pH和培養液的特性（如菌濃等）等幾個目的。
（3）溶解氧對發酵的影響及其控制：
好氣性生物的生長發育和產物的合成都需要消耗氧氣，它們只有在氧分子存在的情況下才能完成生物氧化作用。菌群在大量擴增過程中，進行耗氧的氧化分解代謝，發酵過程中隨溶解氧濃度的下降，細胞生長減慢；外源基因的高效轉錄和翻譯需要大量的能量，促進細胞的呼吸作用，提高對氧的需求。因此維持較高水平的溶解氧濃度，才能提高菌的生長及外源蛋白產物的合成。一般在生長過程中溶解氧濃度≥40%，產物合成過程中解氧濃度≥30%。
1）溶解氧對發酵的影響：
在 25℃、0.10MPa下，空氣中的氧在水中的溶解度為0.25mmol/L，在發酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而發酵液中的大量微生物耗氧迅速，耗氧速率大于25～100mmol/（L·h）。因此，供氧對于好氧微生物來說是非常重要。在好氧發酵中，微生物對氧有一個最低要求，滿足微生物呼吸的最低氧濃度叫臨界溶氧濃度（critical value of dissolved oxygen concentration），用c臨界表示。在c臨界以下，微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。當不存在其他限制性基質時，溶解氧高于c臨界，細胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶解氧低于c臨界，細胞的比耗氧速率就會大大下降，細胞處于半厭氧狀態，代謝活動受到阻礙。培養液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡，才能滿足微生物對氧的利用。
在發酵過程中，影響溶解氧的因素有以下幾方面：
培養基的成分和菌濃顯著影響耗氧。培養液營養豐富，菌體生長快，耗氧量大；菌濃高，耗氧量大；發酵過程補料或補糖，微生物對氧的攝取量隨之增大。
菌齡影響耗氧。對數生長期呼吸旺盛，耗氧量大；發酵后期菌體處于衰老狀態，耗氧量自然減弱。
發酵條件影響耗氧。在最適條件下發酵，耗氧量大；發酵過程中，排出有毒代謝產物如二氧化碳、揮發性的有機酸和過量的氨，也有利于提高菌體的攝氧量。
2）供氧與微生物呼吸代謝的關系：
好氧微生物生長和代謝均需要氧氣，因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要。由于各種好氧微生物所含的氧化酶系（如過氧化氫酶、細胞色素氧化酶、黃素脫氫酶、多酚氧化酶等）的種類和數量不同，在不同的環境條件下，各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的。微生物的吸氧量常用呼吸強度和耗氧速率兩種方法來表示。呼吸強度又稱氧比消耗速率，是指單位質量的干菌體在單位時間內所吸取的氧量，單位為mmol O 2/（g干菌體·h）。耗氧速率又稱攝氧率，是指單位體積培養液在單位時間內的吸氧量，單位為mmol O 2/（L·h）。呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量，但是，當培養液中有固體成分存在時，測定起來有困難，這時可用耗氧速率來表示。微生物在發酵過程中的耗氧速率取決于微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度。
在發酵生產中，供氧的多少應根據不同的菌種、發酵條件和發酵階段等具體情況決定。在菌體生長期，供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量，若菌體的需氧量得不到滿足，則菌體呼吸受到抑制，從而抑制菌體生長，引起乳酸等副產物的積累，菌體收率降低。但是供氧并非越大越好，當供氧滿足菌體需要，菌體的生長速率達最大值，如果再提高供氧，不但不能促進菌體生長，造成能源浪費，而且高氧水平會抑制菌體生長。
3）發酵過程溶解氧的變化：
在發酵過程中，在已有設備和正常發酵條件下，每種產物發酵的溶解氧變化都有自己的規律。一般在發酵的延滯期，菌體繁殖速率緩慢，氧消耗量較低。在對數生長期菌群大量繁殖，需氧量不斷增加，此時的需氧量超過供氧量，使溶解氧明顯下降，出現一個低峰，工程菌的攝氧率同時出現一個高峰，發酵液中的菌濃也不斷上升，黏度一般在這個時期也會出現一高峰階段。發酵中后期，對于分批發酵來說，溶解氧變化比較小。進入穩定期，因為菌體已繁殖到一定濃度，呼吸強度變化也不大，如不補加基質，發酵液的攝氧率變化也不大，供氧能力仍保持不變，溶解氧變化也不大。但當外界進行補料（包括碳源、前體、消泡劑），則溶解氧就會發生改變，變化的大小和持續時間的長短，則隨補料時的菌齡、補入物質的種類和劑量不同而不同。如補加糖后，發酵液的攝氧率就會增加，引起溶解氧下降，經過一段時間后又逐步回升；如繼續補糖，甚至降至c臨界以下，而成為生產的限制因素。在生產后期，由于菌體衰老，呼吸強度減弱，溶解氧也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶解氧更會明顯上升。
在發酵過程中，有時出現溶解氧明顯降低或明顯升高的異常變化。常見的是溶解氧異常下降，排除設備自身原因外，可能有下列幾種原因：污染好氣性雜菌，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧在較短時間內下降到零附近，如果雜菌本身耗氧能力不強，溶解氧變化就可能不明顯；菌體代謝發生異常現象，需氧要求增加，使溶解氧下降；工藝控制發生變化，也可能引起溶解氧下降，如碳源補加過多或消泡劑加量太多等。引起溶解氧異常升高的原因，在供氧條件沒有發生變化的情況下，主要是耗氧出現改變，如菌體代謝出現異常，耗氧能力下降，使溶解氧上升。特別是污染烈性噬菌體，影響最為明顯，產生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶解氧有可能上升，直到菌體破裂后，完全失去呼吸能力，溶解氧就直線上升。
由上可知，從發酵液中的溶解氧變化，就可以了解微生物生長代謝是否正常，工藝控制是否合理，設備供氧能力是否充足等問題，幫助我們查找發酵不正常的原因和控制好發酵生產。
發酵液的溶解氧濃度，是由供氧和需氧兩方面所決定的。也就是說，當發酵的供氧量大于需氧量，溶解氧就上升，直到飽和；反之就下降。因此要控制好發酵液中的溶解氧，需從這兩方面著手。
在供氧方面，主要是設法提高氧傳遞的推動力和液相體積氧傳遞系數 K L a值。結合生產實際，在可能的條件下，采取適當的措施來提高溶解氧，如調節攪拌轉速或通氣速率來控制供氧。但供氧量的大小還必須與需氧量相協調，也就是說，要有適當的工藝條件來控制需氧量，使產生菌的生長和產物生成對氧的需求量不超過設備的供氧能力，使產生菌發揮出最大的生產能力。這對生產實際具有重要的意義。
發酵液的需氧量，受菌濃、基質的種類和濃度以及培養條件等因素的影響，其中以菌濃的影響最為明顯。發酵液的攝氧速率OUR是隨菌濃增加而按比例增加，但傳氧速率OTR是隨菌濃的對數關系減少，因此可以控制菌的比生長速率比臨界比生長速率μ臨略高一點的水平，達到最適菌濃，菌體的生產率最高。這是控制最適溶解氧濃度的重要方法。最適菌濃既能保證產物的比生產速率維持在最大值，又不會使需氧大于供氧。控制最適的菌濃可以通過控制基質的濃度來實現。如通過控制補加葡萄糖的速率達到最適菌濃，利用溶解氧的變化來自動控制補糖速率，間接控制供氧速率和pH，實現菌體生長、溶氧和pH三位一體的控制體系。
除控制補料速度外，在工業上，還可采用調節溫度（降低培養溫度可提高溶氧濃度）、增加罐壓、液化培養基、中間補水、添加表面活性劑等工藝措施，來改善溶解氧水平。
（4）基質的影響及其控制：
基質即培養微生物的營養物質也稱為底物，主要包括碳源、氮源、無機鹽等。對于發酵控制來說，基質是生產菌代謝的物質基礎，既涉及菌體的生長繁殖，又涉及產物的形成。因此基質的種類和濃度與發酵代謝有著密切的關系。所以選擇適當的基質和控制適當的濃度，是提高代謝產物產量的重要方法。就產物的形成來說，培養基過于豐富，有時會使菌體生長過旺，黏度增大，傳質差，菌體不得不花費較多的能量來維持其生存環境，即用于非生產的能量大量增加。所以，在分批發酵中，控制合適的基質濃度不但對菌體的生長有利，對產物的形成也有益處。
1）碳源對發酵的影響及其控制：
常用的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、糖蜜等。使用不同的碳源對菌體生長和外源基因的表達有較大影響。葡萄糖為速效碳源，易被菌體消耗，生長速率快，但所產生的副產物較多（如醋酸），影響菌體的生長和表達；以甘油為碳源時，生長速率緩慢，發酵周期延長，但它的代謝途徑與葡萄糖不同，不產生醋酸等影響生長與表達的副產物，因此更易達到高密度培養。目前在發酵生產中常稱使用葡萄糖作為碳源，它對Lac啟動子有阻遏作用，因此通常降低葡萄糖在底物中的濃度（一般≤10g/L），采用流加的方式加入，以減少或消除對Lac啟動子的阻遏作用。對Lac啟動子來說，使用乳糖作為碳源，既可以提供能量，還可以起到誘導作用。因此選擇最適碳源對提高代謝產物產量是很重要的。
碳源的濃度也有明顯的影響。由于營養過于豐富所引起的菌體異常繁殖，對菌體的代謝、產物的合成及氧的傳遞都會產生不良的影響。若產生阻遏作用的碳源（葡萄糖）用量過大，則產物的合成會受到明顯的抑制；反之，菌體生長和產物合成就都停止。所以控制合適的碳源濃度非常重要。控制碳源的濃度，可采用經驗法和動力學法，即在發酵過程中采用中間補料的方法來控制。這要根據不同代謝類型來確定補糖時間、補糖量和補糖方式。動力學方法是要根據菌體的比生長速率、糖比消耗速率及產物的比生成速率等動力學參數來控制。
2）氮源對發酵的影響及其控制：
氮源有無機氮源和有機氮源兩類。常用的有蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、玉米漿和氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等。它們對菌體代謝都能產生明顯的影響，不同的種類和不同的濃度都能影響產物合成的方向和產量。例如有些氮源容易被菌體所利用，促進菌體生長，但對某些代謝產物的合成，特別是某些抗生素的合成產生調節作用，影響產量。因此也要選擇適當的氮源和濃度。
發酵培養基一般是選用含有快速利用和慢速利用的混合氮源，除了基礎培養基中的氮源外，還要在發酵過程中補加氮源來控制其濃度。如根據產生菌的代謝情況，可在發酵過程中添加某些具有調節生長代謝作用的有機氮源，如酵母粉、玉米漿、尿素等；補加無機氮源氨水或硫酸銨是工業上的常用方法。氨水既可作為無機氮源，又可調節pH，以達到提高氮含量和調節pH的雙重目的；還可補充其他無機氮源，但需根據發酵控制的要求來選擇。
3）磷酸鹽對發酵的影響及其控制：
磷是微生物菌體生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產物所必需的。在發酵過程中，微生物攝取的磷一般以磷酸鹽的形式存在。微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32～300mmol/L，但對次級代謝產物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol/L，提高到10mmol/L就明顯地抑制其合成。因此控制磷酸鹽濃度對微生物次級代謝產物發酵來說是非常重要的。磷酸鹽濃度調節代謝產物合成機制，對于初級代謝產物合成的影響，往往是通過促進菌體生長而間接產生的，對于次級代謝產物來說，機制就比較復雜。
磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎培養基中采用適當的濃度。對于初級代謝來說，要求不如次級代謝那么嚴格。磷酸鹽的最適濃度取決于菌種特性、培養條件、培養基組成和原料來源等因素，并結合具體條件和使用的原材料進行試驗來確定。培養基中的磷含量還可能因為配制方法和滅菌條件不同而有所變化。在發酵過程中，若發現代謝緩慢，耗糖量低，可適當補充磷酸鹽。
4）無機鹽與微量元素：
無機鹽和微量元素是指除碳、氮元素外其他各種重要元素及其供體。其中凡是微生物生長所需濃度在10 -4～10 -3mol/L范圍內的元素，可稱之為大量元素，主要是P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等；凡微生物生長所需濃度在10 -8～10 -6mol/L范圍內的元素，可稱之為微量元素，主要是Cu、Zn、Mn、Mo和Co等。這只是一個大致的劃分，不同的微生物還是存在著一定的差別。無機鹽的用量雖然不如碳源、氮源的用量大，但是對于微生物卻有極其重要的生理作用，如構成菌體成分，作為酶的組成部分或者其激活劑、抑制劑，調節滲透壓、菌體內部pH以及氧化還原電位等。無機鹽尤其是微量元素在低濃度時對微生物的生長和產物的合成一般有促進作用，但是在高濃度時常表現為明顯的抑制作用，有時甚至是毒性作用。而各種不同的微生物及同種微生物在不同的生長階段對這些物質的最適濃度要求均不相同。因此，在生產中要通過試驗預先了解菌體對無機鹽和微量元素的最適宜的需求量，以穩定或提高產量。
無機元素（除氮、氧外）的來源和功能見表4-5。
表4-5 無機元素（除碳、氮外）的來源和功能
除上述主要基質外，還有其他培養基成分影響發酵。如促生長因子、前體、產物促進劑和抑制劑及配制用水等。總之，發酵過程中，控制基質的種類及其用量是非常重要的，是發酵能否成功的關鍵。必須根據生產菌的特性和各個產物合成的要求，進行深入細致的研究，方能取得良好的結果。
（5）接種量的影響及其控制：
接種量是指移入發酵罐中的種子液的體積與培養液體積的比例。它的大小影響發酵的產量和發酵周期。接種量少，延長菌體的延滯期，不利于外源基因的生長與表達；接種量大，由于種子液中含有大量水解酶，有利于對底物的利用，縮短菌體的延滯期，并能使生產菌迅速占領整個培養環境，減少污染概率。但接種量過高又往往會使菌體生長過快，代謝產物積累過多，反而抑制后期菌體的生長。所以接種量的大小取決于生產菌種在發酵中的生產繁殖速度，應通過試驗進行確定。一般在外源蛋白的發酵過程中，接種量一般設計在5%～10%，可縮短延滯期，菌群迅速繁衍，很快進入對數生長期，適于表達外源基因。
（6）誘導時機的影響及其控制：
誘導劑的添加量及誘導時機都會影響到外源蛋白的表達水平。誘導時機的不同會影響到外源基因的表達以及工程菌的穩定性和活性。過早誘導會抑制細胞大量增殖，造成生物質和目的蛋白產量偏低，同時也增加了染菌的機會；而誘導過遲雖可獲得高產量的生物質，但由于細胞生長停滯后，各種酶系統的活力下降，細胞表達外源蛋白的時間則減少，也會影響蛋白表達。選擇誘導劑的添加濃度也非常重要。如誘導劑異丙基-β- D-2硫代半乳糖苷（IPTG）濃度過高，對含質粒工程菌的生長具有抑制作用，并有一定毒副作用，加之IPTG本身價格昂貴，會增加生產成本；誘導劑IPTG濃度過低，則會影響誘導效果，影響目的蛋白的表達量。確定誘導時機和誘導濃度，使得既能獲得較高目的產物的表達量，又可獲得較高的菌體重量，是高水平表達外源蛋白的培養中的重要問題。
Huazc等通過一系列試驗提出可根據動力學模式來確定最佳的誘導時機。在這些動力學方程式中，細胞的生長、外源蛋白的產量、生物濃度以及比生長速率等參數都在考慮之列。試驗結果顯示誘導使攜帶質粒的細胞生長速度顯著降低，而不帶質粒的細胞則不受影響。因此提早誘導造成生物質和目的蛋白產量偏低，同時也增加了染菌的機會，而誘導較晚雖可獲得高產量的生物質，但外源蛋白的表達量較低。在發酵生產中，一般外源蛋白在對數生長中后期進行誘導表達。
（7）補料控制的影響及其控制：
補料方式有很多種情況，有連續流加、不連續流加或多周期流加。每次流加又可分為快速流加、恒速流加、指數速率流加和變速流加。從補加培養基的成分來分，又可分為單組分補料和多組分補料。目前在發酵生產中常用補料分批發酵（fed-batch culture，簡稱FBC），同傳統的分批發酵相比，FBC具有以下的優點：可以解除底物抑制、產物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；可以避免在分批發酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的一切影響，改善發酵液流變學的性質；可以使發酵過程最佳化，使菌種保持在最大生產力的狀態，為自動控制和最優控制提供實驗基礎。同連續發酵相比，FBC不需要嚴格的無菌條件，產生菌也不會產生老化和變異等問題，適用范圍也比連續發酵廣泛。由于FBC有這些優點，現已被廣泛地用于微生物發酵生產和研究中。
（8）泡沫對發酵的影響及其控制 1）泡沫的形成及其對發酵的影響：
在大多數微生物發酵過程中，由于培養基中有蛋白類表面活性劑（具有較高的表面張力）存在，在通氣條件下，培養液中就形成了泡沫。泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系，氣液之間被一層液膜隔開，彼此不相連通。形成的泡沫有兩種類型：一種是發酵液液面上的泡沫，氣相所占的比例特別大，與液體有較明顯的界限，如發酵前期的泡沫；另一種是發酵液中的泡沫，又稱流態泡沫（fluid foam），分散在發酵液中，比較穩定，與液體之間無明顯的界限。
發酵過程產生少量的泡沫是正常的。泡沫的多少一方面與發酵罐攪拌、通風有關；另一方面，與培養基性質有關。蛋白質原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發泡劑，糊精含量多也引起泡沫的形成。發酵過程中，泡沫的形成有一定的規律性。當發酵感染雜菌和噬菌體時，泡沫異常多。
起泡會帶來許多不利因素，如發酵罐的裝料系數減少，液相體積氧傳遞系數減小等。泡沫過多時，影響更為嚴重，造成大量逃液，發酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機會等，嚴重時通氣攪拌也無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導致代謝異常或菌體自溶。所以，控制泡沫是保證正常發酵的基本條件。
2）泡沫的控制：
泡沫的控制，可以采用三種途徑：調整培養基中的成分（如少加或緩加易起泡的原材料）或改變某些物理化學參數（如pH、溫度、通氣和攪拌）或者改變發酵工藝（如采用分次投料）來控制，以減少泡沫形成的機會。但這些方法的效果有一定的限度。可采用機械消泡或消泡劑消泡這兩種方法來消除已形成的泡沫。還可以采用菌種選育的方法，篩選不產生流態泡沫的菌種，來消除起泡的內在因素。對于已形成的泡沫，工業上可以采用機械消泡和化學消泡劑消泡或兩者同時使用。
機械消泡是一種物理消泡的方法，利用機械強烈振動或壓力變化而使泡沫破裂。有罐內消泡和罐外消泡兩種方法。前者是靠罐內消泡漿轉動打碎泡沫；后者是將泡沫引到罐外，通過噴嘴的加速作用或利用離心力來消除泡沫。消泡劑消泡則是利用外界加入消泡劑，使泡沫破裂的方法。消泡劑都是表面活性劑，具有較低的表面張力，或者是降低泡沫液膜的機械強度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有兩者的作用，達到破裂泡沫的目的。常用的消泡劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類及硅酮類等4大類。其中以天然油酯類和聚醚類在生物發酵中最為常用。在生產過程中，消泡的效果除了與消泡劑種類、性質、分子量大小、消泡劑親油親水基等密切相關外，還和消泡劑使用時加入方法、使用濃度、溫度等有很大的關系。消泡劑的選擇和實際使用還有許多問題，應結合生產實際加以注意和解決。
（9）發酵終點判斷：
發酵類型不同，需要達到的目的也不同，對發酵終點的判斷標準也有所不同。無論是初級代謝產物還是次級代謝產物，到了發酵末期，菌體的分泌能力都要下降，產物的生產能力也相應下降或停止，另外染菌概率也大大提高。
微生物發酵終點的判斷，對提高產物的生產能力和經濟效益十分重要。在工業化生產過程中，不能只單純追求提高生產力，而不顧及產品的成本，必須將兩者結合起來，既要有高產量，又要降低成本。
1）考慮經濟因素：
發酵應以最低的綜合成本來獲得最大的生產能力的時間為最適發酵時間。在實際生產中，以縮短發酵周期，提高設備利用率，降低能耗，即使不是最高產量，但綜合成本最低為最適宜放罐時機。
2）產品質量因素：
發酵時間長短對后續工藝和產品質量有很大影響。若發酵時間過短，產物的產量較低且過多未代謝營養物質殘留在發酵液中，這些物質對下游分離純化操作帶來很大困難。但發酵時間過長，菌體會自溶，釋放出菌體蛋白或體內水解酶，顯著改變發酵液的性質，并會使一些不穩定的活性產物遭到破壞。所有這些都可能導致產物的產量及產物中的雜質含量增加，增加后續工段的難度。
3）特殊因素：
在個別發酵情況下，如染菌、代謝異常時，應根據不同情況進行適當處理，以免倒罐。合理的放罐時間是由試驗來確定的，即根據不同的發酵時間所得到的產物量計算出發酵罐的生產能力和產品成本，確定生產力高而成本低的時間作為發酵終點。
(二)哺乳動物細胞表達系統
哺乳動物細胞表達系統因為蛋白合成、加工和分泌的信號能被動物細胞準確而有效地識別，能進行糖基化修飾，并適于表達完整的大分子蛋白，目前已廣泛應用于生產具有重要醫用價值的抗體、生長因子、疫苗及酶等生物制品，其市場份額已占世界生物高技術產品的50%。雖然其培養的原理與微生物基本相同，但哺乳動物細胞的培養成本高，培養條件苛刻，培養周期長，技術要求更高。
1.培養方法
哺乳動物細胞常用的培養方法有懸浮培養（suspension culture）、貼壁培養（anchorage-dependent culture）、貼壁懸浮培養（microcarrier culture）三種方式。
懸浮培養是指細胞在離體培養時不需要附著物，可以自由懸浮于培養基內生長增殖。它適用于非貼壁依賴性細胞株（如雜交瘤細胞），也適用于兼性貼壁細胞。該方法優點是操作簡便，培養過程簡單，傳質和傳氧較好，易擴大培養；該法的缺點是細胞培養密度低，轉化細胞懸浮培養有潛在的致癌危險，培養病毒易失去病毒標記而降低免疫力，只有少數動物細胞適用于懸浮培養。此外，貼壁依賴性動物細胞不能進行懸浮培養。
貼壁培養是指大多數動物細胞在離體培養的條件下，都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體表面生長繁殖的培養方法。它適用于貼壁細胞（如Hela、Vero、CHO、BHK），也適用于兼性貼壁細胞。該方法的優點是適用細胞種類廣，易實現高密度培養，細胞增殖速度快。但操作較麻煩，培養條件均一性差，需要合適的貼附材料和足夠的表面積，傳質和傳氧較差，故放大培養受到一定限制。貼壁培養與懸浮培養主要不同之處是在傳代或擴大培養時，需要用酶（如胰蛋白酶、依地酸二鈉或胰蛋白酶-EDTA聯用等）將細胞消化下來。
貼壁懸浮培養是結合貼壁培養和懸浮培養的，形成的一種理想的、更適用于工業化放大培養的新技術，目前已廣泛應用于動物細胞的規模化生產中。
（1）微載體培養（microcarrier culture）：
是使細胞貼附于微小顆粒載體上，它可以創造相當大的貼附表面積，供細胞附著、延伸和增殖，充分發揮貼壁培養的優點；同時微載體體積小，比重輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由懸浮在培養基內，充分發揮懸浮培養的優點。
理想的微載體應具備以下條件：材料具有無毒害性、惰性，且表面性質與細胞具有良好的相容性，使其較好地附著、生長和增殖；微載體體積小，比重輕，可在低轉速下懸浮，在靜止時易沉降，便于換液和收獲；微載體性質是軟性的，避免在攪拌中由于相互摩擦而損傷細胞；具有良好的光學透明性，適用于在倒置顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況；粒徑要均一，大小在60～250μm（溶脹后）為宜且應耐高壓滅菌，可反復使用；原料來源充足，制作簡便、廉價。常用的商品化的微載體如表4-6所示。
表4-6 常見動物細胞培養用商品化微載體
（2）包埋（entrapment）和微囊（microencapsulation）培養：
包埋培養是將細胞與高聚物或高聚物單體混合，隨凝膠的形成，將細胞包埋進高聚物內部的網格中。此方法操作簡單，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少，抗機械剪切力較強，但存在擴散限制，并非所有細胞都處于最佳基質濃度且大分子基質不能滲透高聚物網格，往往有一些物質被排斥在外。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。
微囊培養是在包埋培養技術上衍生而來的，是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜，囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，微囊直徑控制在200～400μm為宜。此方法可降低剪切力對細胞的影響，能夠實現高密度培養，使產物濃度增加并有利于下游產物的純化。但微囊制作復雜，成功率不高，微囊內死亡的細胞會污染正常產物；產物收集必須破壁，不能實現連續化生產。
2.培養方式
哺乳動物細胞的培養方式有分批式培養、流加式培養、半連續式培養、連續式培養和灌流式培養等。
分批式培養（batch culture）是指將細胞擴大培養后，一次性加入培養器內進行培養和擴增，在培養過程中其體積不變，不添加其他成分，至達到培養終點一次性收獲細胞、產物培養基的一種方式。在培養器內的細胞經歷延遲期、對數生長期、穩定期和衰亡期不同階段。該方法操作簡單，容易掌握，易放大，但不能使細胞處于最優培養條件，細胞產量及產物表達量相對低，設備有效利用率低。
流加式培養（feeding culture）是指先將一定量的培養液加入培養器中，接種細胞并進行培養，隨細胞對營養物質的不斷消耗，不斷補加新鮮的營養物或培養基，使細胞進一步生長代謝，實現高密度培養，整個過程中沒有流出和回收，直至培養終止時取出整個反應體系的方法。該法可以降低底物對細胞生長及產物合成的抑制，并可根據細胞生長情況進行調節，有效提高產量及表達量。但在動物細胞培養過程中，需要補加的營養成分較多，操作過程較為繁瑣。流加的營養成分主要是葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸及維生素等。
半連續式培養（semi-continuous culture）是指在分批培養的基礎上，每間隔一段時間取出部分培養物，再補充同等數量的新鮮培養液，剩余的培養物可作為種子繼續培養，使反應器內的總體積保持不變的一種方法。該法操作簡便，生產效率高，可反復收獲產品，保持產物和細胞在較高的濃度水平，培養過程可延續很長時間，廣泛應用于生產操作中。
連續式培養（continuous culture）是指將細胞種子接種到培養基中進行培養，在細胞達到最大密度之前，一方面以一定流速不斷補加新鮮培養基，另一方面將含有細胞的培養物以相同的流速不斷從反應器中取出，使細胞的培養條件處于一種恒定狀態的方法，理論上該過程可以無限延續下去。該法可使細胞培養狀態達到恒定，有效延長對數生長期，能夠獲得較高的細胞密度和產物濃度，設備利用率高，但由于開放式操作且培養周期長，易造成污染，對儀器設備及培養控制的技術要求高及在長期培養過程中細胞培養特性及分泌產物易變性。
灌流式培養（perfusion culture）是指將細胞接種到培養基內進行培養，在細胞增長和產物形成過程中不斷將部分培養基取出，同時又連續灌注新的培養基的一種方法。它與其他培養方法不同之處是取出部分培養基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內，使細胞處于一種不斷的營養狀態的一種方法。細胞截流系統多采用微孔濾膜過濾、旋轉膜系統或各種形式的沉降系統或透析系統。該法生產效率高，能夠維持較高的細胞濃度，一般可達10 7～10 9/ml，大大提高產品的產量；同時可使細胞處于較好的營養狀態，降低有害產物的積累；同時產物在罐內停留時間短，有利于保持產品的活性，也有助于減少培養細胞污染的機會，是目前新興的較為先進的細胞培養方法。
3.影響因素
影響體外培養的哺乳動物細胞因素與微生物細胞大體相同，只是它對環境更加敏感。主要影響因素包括溫度、pH、溶解氧、培養基的組成、滲透壓、攪拌轉數、葡萄糖、乳酸等。
（1）溫度對細胞培養的影響及控制：
適宜的培養溫度是體外培養細胞的必要條件，不同類型動物細胞的最適溫度要求也不盡相同。一般哺乳類細胞體外培養的適宜溫度是37℃；雞細胞在30～42℃；昆蟲類細胞在25～28℃；魚類細胞在23～25℃。由于細胞的代謝強度與溫度在一定范圍內成正比，溫度過高或過低都會影響到細胞的生長。細胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強，在低溫下，雖影響細胞代謝，速度減緩，但并無傷害作用。而在高溫條件下細胞會受到損傷甚至死亡，一般溫度到43℃以上時細胞多數被殺死。高溫主要引起酶的滅活、類脂質破壞、核分裂的破壞，產生凝固酶使細胞發生凝固，另外使蛋白質變性。因此，動物細胞對溫度波動敏感性強，較其他細胞培養對溫度控制具有更嚴格要求，一般常采用鉑電阻溫度計來檢測，靈敏度為±0.025℃，溫度控制偏差在0.05℃范圍內。
（2）pH對細胞培養的影響及控制：
pH影響細胞存活、生長及代謝，是哺乳動物細胞培養過程中關鍵性參數之一。大多數細胞生長的最適pH范圍為7.2～7.4，有的細胞系生長最適pH略有不同，但其范圍一般不超過6.8～7.6，過高或過低均不利于細胞生長，甚至導致死亡。極個別的細胞系如表皮細胞可在pH 5.5中維持存活。一般原代培養細胞對pH堿性的耐受比對酸性的耐受差，偏酸的環境比偏堿的環境對細胞生長有利。為了維持培養環境恒定的pH，通常采用CO 2、碳酸氫鹽調節緩沖液的pH。磷酸緩沖液中的NaHCO 3可供給CO 2，但CO 2易于逸出，故只適用于封閉式培養。若開放式培養還需置于含有5%CO 2的氣體環境中。還可以通羥乙基哌嗪乙烷磺酸緩沖液維持培養液的pH，它對細胞無毒性，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養或活細胞觀察時能維持較恒定的pH。
（3）滲透壓對細胞培養的影響及控制：
細胞在高滲透或低滲溶液中，可以發生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外細胞培養的重要條件之一。理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為290mmol/L，被視為是體外培養人類細胞的理想滲透壓；哺乳動物細胞的滲透壓一般為290～300mmol/L；人胚肺成纖維細胞為250～325mmol/L；鼠細胞則為310mmol/L左右。在實際應用中，260～320mmol/L的滲透壓可適于大多數細胞。培養體系滲透壓的維持主要與NaCl有關，但不能忽視其他電解質與滲透壓的關系。為此，按一定比例控制培養基中離子平衡，這不僅是為了維持細胞張力，而且與細胞的代謝調節相關，直接影響細胞基本合成系統。
（4）溶解氧對細胞培養的影響及控制：
溶解氧不僅影響細胞的產率，而且直接或間接影響細胞的代謝，是體外培養細胞生存必需的條件之一。氧參加細胞的三羧酸循環，產生能量以供應給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。有些細胞在低氧條件下，可借糖酵解取得能量，但多數細胞低氧時不能生存。氧張力通常維持在略低于大氣狀態，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。不同類型的動物細胞所需最適溶解氧的水平不同，一般控制在20%～50%，可根據需要向培養液中加入空氣、氧氣、二氧化碳或氮氣等控制溶解氧，還可以通過加大通氣流量和適當提高轉數等方法來進行溶解氧的調節。
（5）細胞接種密度對細胞培養的影響及控制：
在體外培養細胞中，適宜的接種密度，可以促使細胞增殖，接種密度太低或太高都不利于細胞的生長增殖。如果培養基與細胞的容積比例大于2000∶1，生長物質彌散到細胞外過多，將使細胞內濃度低于最小限度的濃度，此時細胞不能再增殖，培養基的pH變堿，抑制細胞生長，細胞變圓不能貼壁，甚至引起細胞死亡等。如果接種密度太高，每個細胞周圍培養基的容積降至0.007mm 3以下，由于彌散率降低，細胞內生物質的濃度增加，容易使排出物或其他代謝產物達到飽和，能量來源也很快耗盡，因此也會妨礙細胞的增殖。細胞接種密度因不同細胞系而異，一般來說代謝旺盛、生長速度快的細胞（如腫瘤細胞），接種濃度宜偏低；而正常組織細胞生長較慢，代謝不夠旺盛，接種濃度可偏高。
（6）攪拌轉數對細胞培養的影響及控制：
當懸浮攪拌培養細胞時，攪拌速度既不能太快，也不能太慢。如果太慢，細胞易結團、下沉和貼壁，不利于細胞在懸浮狀態下增殖；如果太快，容易起泡沫，細胞易窒息致死，同時，強烈的攪動易使細胞因機械損傷而破裂。所以選擇適宜的攪拌速度很重要。一般哺乳動物細胞抗剪切力較差且各種細胞的適宜攪拌速度不一致，通常與細胞的特性和質量有關，應予以注意。
（7）基質的影響及其控制 1）氨基酸類：
氨基酸在細胞內有重要的生理作用，氨基酸濃度與細胞生長之間的平衡程度往往會影響細胞的存活和生長率。不同的細胞株自身生長和產物合成對氨基酸的需求不同，因此培養基配方不具有普適性。一般選擇必需氨基酸（即體內不能合成但是體外細胞培養中的必需氨基酸如精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸等）含量較高的培養基；其他非必需氨基酸即可以由細胞通過轉氨作用自己合成，但是在培養基中添加適當濃度的氨基酸可以減輕細胞在合成方面的負擔，提高谷氨酰胺及其他必需氨基酸的利用率，如天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸等。谷氨酰胺是多數細胞所需要的，是細胞的主要氮源，還可以作為細胞生長的能源物質和嘌呤、嘧啶核苷酸的前體，也可以直接作為細胞生長和產物合成中蛋白質和多肽的組成成分。因此，一般培養基中谷氨酰胺的濃度會大大高于其他氨基酸。
2）維生素類：
維生素一般作為輔酶或輔基參與細胞代謝的調控，雖然用量甚微，但卻必不可少，沒有它們的參與，細胞代謝就無法進行。一般維生素多來源于血清，但減少血清用量或采用無血清培養基時，需要在培養基中添加維生素。在細胞培養中起到重要作用的維生素有B族維生素（B 1、B 2、煙酸、生物素、泛酸、葉酸、B 12等）、維生素C、維生素A、維生素E等。不同配方的培養基中維生素的濃度有較大差異，這可能與不同細胞株對維生素耐受性差異相關。
3）無機鹽類：
無機鹽是細胞維持生命活動所不可缺少的營養成分，也是調節培養液滲透壓及酸堿平衡的主要成分，并參與多種重要的生理活動。主要鹽類包括Na ＋、K ＋、Ca 2＋、Mg 2＋、Cl -、 
、 
、 
等，還包括微量元素，它對于細胞生長代謝和產物合成都有促進作用，如鐵、錳、銅、鋅、鈷、鎳、鉻、碘、硒、鉬等。
、 、 等，還包括微量元素，它對于細胞生長代謝和產物合成都有促進作用，如鐵、錳、銅、鋅、鈷、鎳、鉻、碘、硒、鉬等。
4）葡萄糖：
葡萄糖是細胞的主要碳源和能量來源。在葡萄糖濃度高時，細胞更趨于進行糖酵解作用，大量葡萄糖不完全氧化生成乳酸；在葡萄糖水平低時，主要由鈉離子推動的高親和性轉運過程攝取葡萄糖，細胞更趨于進行三羧酸循環，葡萄糖完全氧化生成二氧化碳。
5）其他成分：
胰島素、轉鐵蛋白和牛血清白蛋白是無血清培養中常用的蛋白添加劑；生長因子類如血小板生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（FGFs）、表皮生長因子（EGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等能更好地促進細胞增殖；還有某些脂肪酸如亞油酸和亞麻酸等能更好地促進細胞生長和產物合成。
6）無血清培養基：
目前在哺乳動物細胞培養中普遍使用人工合成培養基，需要補加5%～10%血清，為細胞的生長提供必要的激素、微量元素、酶抑制劑及生長因子等，然而由于血清中的成分復雜，可能含有病毒和支原體及有可能抑制病毒的因素，干擾病毒研究試驗，影響到藥物的研究。無血清培養基（serum free medium，SFM）是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基，已成為動物細胞培養的趨勢。它具有重復性好；避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染及對試驗研究的影響；有利于體外培養細胞的分化；可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化等優勢。但也存在成本高、針對性強、易受某些因素影響等缺點。由于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由于缺乏血清中的各種黏附貼壁因子，細胞往往以懸浮形式生長，因此必須添加相關組分如促貼壁物質（細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等）、促生長因子及激素（胰島素等）、酶抑制劑（大豆胰酶抑制劑等）、結合蛋白和轉運蛋白（常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白）及微量元素（硒等）（表4-7）。
表4-7 無血清培養基常用配方
