克隆載體（cloning vector）：通常采用從病毒、質粒或高等生物細胞中獲取的DNA作為克隆載體，在載體上插入合適大小的外源DNA片段，并注意不能破壞載體的自我復制性質。將重組后的載體引入到宿主細胞中，并在宿主細胞中大量繁殖。對載體的要求：①能在宿主細胞中復制繁殖，而且最好要有較高的自主復制能力。②容易進入宿主細胞，而且進入效率越高越好。③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內切酶位點。④容易從宿主細胞中分離純化出來，這才便于重組操作。⑤有容易被識別篩選的標志，當其進入宿主細胞，或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。

所有的分子克隆載體應具有以下3個基本的結構：①復制起點：可以在生物體中自主復制；②多克隆位點：以供外源DNA插入；③遺傳標記基因：以指示重組DNA分子是否進入宿主細胞。最主要的載體是質粒、噬菌體和病毒，分別應用于原核細胞或真核細胞。從功能來分，有克隆載體（構建基因組文庫或cDNA文庫）、測序載體、表達載體以及能在兩個不同物種中存在的穿梭質粒。隨著生物技術的發展和科學研究的深入，不斷出現具有不同功能的新載體，如可以容納幾百萬堿基的酵母人工染色體。載體的具體種類有：PAC（P1衍生人工染色體）、MAC（哺乳動物人工染色體）。

質粒（plasmids）是細菌內的共生型遺傳因子。作為染色體外小型雙鏈環狀DNA復制子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主（受體菌）某些代謝活動和抗藥表型，是比病毒更簡單的原始生命。質粒由Lederburg發現并于1952年正式命名。由于質粒不僅可以攜帶外源基因進入細菌中進行擴增和表達，而且在添加真核復制信號和啟動子后，構建出能在原核或真核細胞中均可復制的穿梭質粒，使外源基因在真核細胞中得以表達，因而成為基因的運載工具（即載體），在基因工程中具有極廣泛的應用價值。質粒并不是宿主染色體的永久組成部分，而是一種自主復制的遺傳單元。不同質粒DNA的復制，其機制不盡相同，根據質粒拷貝數的不同，分為嚴緊型和松弛型，前者與宿主繁殖結合，致使每個細胞僅有一個或幾個拷貝質粒，而后者卻是由質粒自己編碼的基因合成功能蛋白所調節，因此在宿主染色體復制停止的情況下，質粒可以繼續擴增，因而具有10～200個拷貝數。對于克隆載體，松弛型質粒更為適用。天然質粒不足以用作載體，必須根據基因克隆的要求進行體外修飾改造。因此可以用作載體的質粒需具備一定的基本元件后才有相應的功能。

質粒（載體）具備的基本元件：①復制起始點（ori）：使質粒可以自我復制和擴增。②抗生素抗性基因：一般有兩個，以便為受體菌提供易于檢測的表型性狀的選擇記號，而且在外源基因插入后形成的重組質粒中，至少仍保留一個強選擇記號。常用的抗性有：抗氨芐西林基因 Ampr、抗四環素基因 Tetr、抗卡那霉素基因 Kanr、抗氯霉素基因 Cmlr、抗鏈霉素基因 Strr。③若干限制酶單一識別位點（多克隆位點，polylinker）：滿足各種基因克隆的需要，而且外源基因插入后不影響質粒的復制功能。④較小分子量和較高拷貝數：便于進行分子操作和質粒擴增。

質粒的功能：①運載外源DNA片段：質粒通常用于運載小于15kb的外源基因片段到宿主中。為了便于操作，人們又構建了穿梭質粒（shuttle plasmids）。所謂穿梭質粒是指一類人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和復制的質粒載體。此概念不僅用于不同的微生物菌群之間，也可以推廣到真核生物表達載體的構建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳動物表達載體pMT2和用于植物細胞的Ti質粒。這些穿梭質粒不僅可以在大腸埃希菌中復制擴增，也可以在相應的枯草、酵母、動物或植物細胞中擴增和表達。由于大腸埃希菌的培養、基因重組、擴增、測序等工作易于進行，技術也相當成熟，因此利用穿梭質粒把要表達的基因組裝好后，再轉入相應的細胞中進行表達，這無疑給基因工程操作，特別是以真核細胞為表達體系的工作提供了極大的方便。②篩選重組子：通常以質粒的抗生素抗性基因作為篩選的遺傳標記。當外源基因插入質粒的某一個抗性基因中，就使該抗性基因不能正常表達，致使含有該質粒的細菌丟失抗性。利用抗性的變化，很容易篩選出含有外源基因的重組子。質粒除有抗性基因外，往往還帶有其他明顯的篩選標記，最常用的是藍白斑篩選（β-半乳糖苷酶系統）。此類載體攜帶 lacZ基因，它編碼β-半乳糖苷酶的N末端（α肽），并且處于可被安慰誘導物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結構類似但不能被β-半乳糖苷酶降解）誘導的啟動子調控之下。質粒轉化的宿主菌為LacZ△M15基因型（含有編碼N末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質粒轉化宿主菌后，在IPTG的誘導下，質粒與基因組分別表達缺陷但可以相互補償的兩個肽（即α互補），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，該酶能把培養基中無色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍色的5-溴-4-氯-靛藍。然而當外源DNA插入質粒位于α肽編碼序列中的多克隆位點時，由于破壞了α肽的閱讀框架，因而不能表達出與宿主菌基因組表達的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽發生α互補。由于沒有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重組菌形成白色菌落。由此，可以借助藍白斑很容易篩選出重組子。不過實際操作中發現當插入小片段時，重組子也有形成淺藍斑的情況。據最新報道，大概有30%的假陰性，即藍色菌斑也有可能含外源基因，同時還會出現一定程度的假陽性。盡管藍白斑篩選應用了二十余年，但假陽性和假陰性卻經常出現，促使人們不斷對分子克隆方法提出改進，并思考著建立新的載體和克隆技術。但迄今為止，幾乎沒有一個克隆系統可以保證不會出現假陽性克隆。Slilaty SN和Lebel S研究證明，藍白斑篩選的載體，通常將插入位點放在 LacZ基因的起始密碼子ATG到第7個氨基酸密碼子之間。但如果將插入位置改變到 LacZ基因的第11～36個氨基酸密碼子之間，那么就可以完全消除假陽性和假陰性。Genomics One公司正是利用了他們的研究結果開發出TrueBlue技術，同樣是藍白斑篩選，但準確率可達100%。③DNA測序：為了便于對克隆到質粒中的外源DNA片段進行鑒定，必須進行DNA序列的測定。通常克隆質粒（包括某些表達質粒）中位于多克隆位點兩側含有通用引物，因此無論插入何種DNA片段，均可利用通用引物進行測序，而不必另外設計特異測序引物，如pGEM-T載體，相關的序列位點為：T7 RNA聚合酶轉錄起始位點1；多克隆位點區10～113；SP6 RNA聚合酶啟動子（-17至＋3）124～143；SP6 RNA聚合酶轉錄起始位點126；pUC/M13反向測序引物結合位點161～177； lacZ起始密碼子165； lac操縱子185～201；β內酰胺酶編碼區1322～2182；噬菌體f1區2365～2820； lac操作子序列2821～2981、151～380；pUC/M13正向測序引物結合位點2941～2957；T7 RNA聚合酶啟動子（-17至＋3）2984～3。在該載體多克隆位點兩側有兩對通用引物（SP6 RNA聚合酶啟動子、T7 RNA聚合酶啟動子和pUC/M13反向測序引物、pUC/M13正向測序引物），它們均可以用來對插入的任何片段進行測序。④表達外源基因：許多表達質粒均構建了強啟動子，外源基因可以在該啟動子的控制下實現高表達，獲得大量目的蛋白。

質粒的電泳行為：電泳是分離鑒定生物大分子的常規方法，大分子的電泳行為（遷移率）取決于該分子的大小、空間結構和攜帶的電荷量。利用不同的染料可以用肉眼觀察它們的電泳行為。溴乙錠（ethidium bromide，EB）是一種具有扁平結構的熒光染料，可以嵌入核酸分子中的堿基對之間，在紫外線的激發下發出紅色熒光，同類型核酸的熒光染色強度與核酸濃度成正比，靈敏度可達1～5ng，因此它是常用的核酸染料。

質粒DNA的形態不一，其電泳行為有差異，電泳時在凝膠中表現出的遷移率不同。超螺旋質粒DNA由于結構緊密遷移速度最快；結構松弛的開環（缺口）質粒DNA最慢；而線形DNA位于兩者之間。

利用噬菌體和病毒（bacteriophage and virus）具有感染宿主（受體細胞）的能力，將插入的外源基因帶入宿主中。噬菌體是一類侵害細菌（包括放線菌、真菌和原核生物，即宿主菌）的病毒，又稱細菌病毒（bacterial virus）。它具有其他病毒的共同特性：個體小、可通過除菌濾器、沒有細胞結構、非常專一的寄生性等，為非細胞生物。其結構主要由蛋白質和核酸（DNA 或RNA）組成。在自然界中分布廣泛，土壤、空氣、水中或生物體內都可存在。根據噬菌體與宿主菌的關系可分為烈性噬菌體（virulent phage）和溫和噬菌體（temperate phage）兩類。前者能改變宿主菌的性質，大量產生新的噬菌體，最后導致宿主菌裂解死亡；后者可因生長條件的不同，既可引起宿主菌的裂解死亡（lytic phage），又可將其核酸整合到宿主菌的染色體上，使宿主菌繼續生長繁殖，并被溶源化（lysogeny，即噬菌體的核酸附加于宿主菌的遺傳物質上，隨同宿主菌分裂一起進行復制）。噬菌體的研究歷史，是同分子生物學、分子遺傳學的創立和發展過程密切相關的。DNA復制機制的闡明、轉錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發現、位點特異的重組作用、SOS修復機制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。

分子生物學技術常用的噬菌體有：①λ噬菌體：外形特征類似于蝌蚪，由頭和尾組成，頭部呈等軸的20面體，直徑約54nm，尾部無尾鞘，長150nm，主要由衣殼蛋白組成。其基因組為線狀雙鏈DNA分子，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端（即為左右臂）；中間是非必需區，當它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能。由外源基因取代非必要基因所形成的重組DNA，可以隨寄主大腸埃希菌細胞一起復制和增殖，而且在其溶源周期中，它們的DNA是整合在大腸埃希菌染色體DNA上的，成為大腸埃希菌的一個組成部分，因此改造后可以組建一系列具有不同特點的載體分子。λ噬菌體具有以下特征：λ-DNA可在體外包裝成病毒顆粒，高效地感染大腸埃希菌；可以把25kb長的外源DNA插入λ-DNA，引入受體細胞；重組λ-DNA的篩選和保藏較易。故λ噬菌體常作為分子克隆的載體，而且特別適用于構建真核生物基因文庫。噬菌體在液體培養基中，噬菌現象可使渾濁菌液變為澄清，在固體培養基中，若用適量噬菌體和宿主菌液混合后接種培養，培養基表面可有透亮的溶菌空斑出現。一個空斑是由一個噬菌體復制增殖并裂解細菌后形成的，稱為噬菌斑（plaque）。在基因重組中，噬菌斑是噬菌體重組包裝成功的篩選標志。將噬菌體按一定倍數稀釋，通過噬菌斑計數（滴度），可測知一定體積內的噬菌斑形成單位數目，即噬菌體的數量。②M13噬菌體：是一種獨特的載體系統，為6400bp的單鏈DNA，整個基因組編碼10個基因。它只能侵襲具有 F基因的大腸埃希菌，但不裂解宿主菌。進入宿主菌后成為雙鏈環狀分子，能像質粒一樣自主復制（即復制型，RF），制備方法同質粒。宿主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點突變和制備單鏈核酸探針，同時不存在包裝限制問題。因此作為單鏈DNA載體，它具有其他載體所不具備的優越性。③柯斯（Cos）質粒：是一種人工構建的克隆載體，為克隆真核DNA大片段而專門設計的。它包含了λ噬菌體的 cos基因、用于克隆的限制性內切酶位點、抗藥性標記和質粒的復制原點，因此是有噬菌體DNA黏性末端順序的質粒DNA分子。柯斯質粒能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸埃希菌。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能像一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化宿主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。④腺病毒（adenoviral）載體：腺病毒的形態是特征性的20面體病毒殼體，直徑為60～90nm，沒有囊膜，衣殼由252個殼微粒組成，主要含有三種蛋白：六鄰體（Ⅱ）、五鄰體基底（Ⅲ）和纖突（Ⅳ），還有多種其他的輔助蛋白Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲa和Ⅳa2，其中240個殼微粒是六鄰體（hexon），位于20面體頂端的12個殼微粒是五鄰體（penton），每個五鄰體由基底和伸出表面的一根末端有頂球的纖維組成（圖3-1）。腺病毒基因組是一個線性的雙鏈DNA，其5'端與一種末端蛋白（TP）共價結合，5'端上還具有末端反向重復序列（ITRs）。病毒DNA與核心蛋白Ⅶ和一個稱為mu的小肽緊密結合。另一種蛋白Ⅴ包被在DNA-蛋白復合物上，并且通過蛋白Ⅵ為DNA-蛋白復合物和病毒殼體間提供了結構上的聯系。病毒含有一種病毒自身編碼的蛋白酶，這種蛋白酶對于加工某些結構蛋白從而產生成熟的具有感染性的病毒是必需的。腺病毒顆粒可以轉染各種細胞，具有高感染率、低變異、高表達的特性，拷貝數可控制，插入片段可達8kb，是非常有用的真核細胞的表達載體。⑤昆蟲桿狀病毒（baculoviruses）：是對昆蟲具有專一性的桿狀病毒，對于其他種類的細胞不具感染性。它是一種長桿狀的病毒，長200～400nm，寬40～50nm，染色體DNA長度在80～200kb之間。當病毒成熟時，在病毒鞘外會包裹一層多角體蛋白，包裹完整的桿狀病毒形成包含體，可以保護病毒抗紫外線與抗旱。野生型的桿狀病毒是一種安全的生物殺蟲劑，對其改造后已成為有效的真核表達載體、表面展示系統以及基因治療載體。昆蟲細胞和桿狀病毒組成了一個完整的表達系統，已經被證明是高水平表達哺乳動物全長蛋白的方法。在昆蟲細胞中很多翻譯后修飾類似于哺乳動物細胞，而那些在大腸埃希菌中不能成功表達的蛋白也可以利用桿狀病毒系統在昆蟲細胞中進行表達。因此BES（桿狀病毒表達系統）具備以下優點：具有真核細胞的翻譯后修飾功能；正確的蛋白折疊、二硫鍵形成，使重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；高表達量，最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源基因（～200kb）；具有在同一個感染昆蟲細胞內同時表達多個基因的能力；對脊椎動物是安全的。

所謂人工染色體（artificial chromosomes）是利用染色體片段組成的載體。同質粒一樣，由從染色體分離出來的ARS（autonomous replication sequences，DNA自主復制起始序列）、CEN（centromeric sequences，著絲點序列）和TEL（telomeric sequences，端粒序列）組成。當然作為載體還必須有克隆位點和篩選標記。其最大的特點是能容許100～2000kb大片段的外源DNA的插入，這為進行基因組工程的工作帶來方便，用不多的克隆就可以包含特定的基因組全部序列，這樣可以保證基因組特定序列的完整性。因能包容大而復雜的基因，利用哺乳動物人工染色體，還可以進行功能分析以及基因治療。在人類基因組計劃和其他基因組研究中，人工染色體發揮了不可替代的作用。