造血微環境（niche）是機體的造血干細胞賴以生存的場所。造血微環境主要包括微血管系統、神經成分、基質細胞（成纖維細胞、內皮細胞、脂肪細胞、成骨細胞、巨噬細胞、網狀細胞等）和多種造血生長因子，共同組成了一個高度復雜而有效的調節網絡，對造血干細胞的自我更新和定向分化、增殖及歸巢和定位有重要作用。因此，造血干細胞和造血微環境以及調節造血的細胞因子被形象比喻為“種子”、“土壤”和“肥料”，以表示三者之間的密切關系。

來源于間充質干細胞的成骨細胞、血竇內皮細胞和竇間網狀細胞，以及其細胞外基質共同構成造血微環境的主體。它們通過生成細胞因子、黏附因子和細胞表面受體與造血干細胞相互作用，調節造血干細胞的增殖分化和遷移，以及成熟血細胞釋放。髓腔中血竇與骨內外血管系統的溝通，交感神經纖維與血竇間網狀細胞表面受體的直接接觸與信號傳遞，又形成了造血微環境反映外環境變化的通道。此外，從骨髓腔中央到骨內膜表面逐漸增高的鈣離子梯度和逐漸減低的氧分壓梯度，對造血干細胞歸巢、定位和代謝方式的選擇有至關重要的作用。

骨髓中除造血細胞外還有間充質干細胞及其后代。追憶到19世紀70年代，Friedenstein等首先發現小鼠骨髓中存在的基質細胞具有高增殖能力，它們黏附塑料培養板，通過增殖形成集落CFU-F，在擴散盒培養體系中能自發向骨和軟骨細胞分化，也能向纖維組織分化。這些骨髓基質細胞因有向間充質細胞譜系分化潛能而有間充質干細胞之稱。將包含間充質干細胞的骨髓基質移植到小鼠骨被膜下能形成小骨，小骨中央有骨髓腔和造血細胞，提示間充質干細胞可能是構成造血微環境的主要細胞成分。以后發現間充質干細胞在培養過程中會老化，隨著傳代次數增多而CFU-F數減少，多向分化能力減弱，端粒逐漸變短，提示間充質干細胞并非均一的細胞群體，可能包含不同分化階段細胞。由于間充質干細胞具有臨床應用前景，相關研究日益增多。為了統一對間充質干細胞的認識，2006年由國際細胞治療協會的組織干細胞委員會宣布了間充質干細胞的定義，指出間充質干細胞的表型為CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD105 ⁺ CD45 ^- CD34 ^- CD14 ^- CD116 ^- CD79 ^- CD19 ^-，能黏附塑料培養板，能在體外分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。此后數年來的研究結果更加豐富了人們對間充質干細胞的認識。

我們通過一系列基礎研究，拓展了前期對間充質干細胞的科學認識，在國際上首次提出“間充質干細胞系統”的理論概念，指出間充質干細胞是一個復雜混合的細胞群體，包含了源自胚胎不同發育胚層和整個生長發育過程的多個不同階段及不同組織來源的間充質干細胞。這些細胞均具有自我復制多系分化特性、平衡機體組織微環境與組織代謝及突出的免疫調控功能的三大重要生物學特征。它們通過三胚層多譜系分化、調控組織微環境及代謝平衡、調控免疫三大功能方式來維持組織更新、代謝、損傷修復和免疫平衡。該理論概念為擴展可用于臨床治療的間充質干細胞群體來源范圍、制定分化調控策略和開發干細胞治療難治性疾病關鍵技術提供了理論依據。骨髓中的間充質干細胞具有高度異質性，既體現在細胞等級分化形成不同發育階段細胞方面，也體現在間充質干細胞發育來源方面。構成造血微環境的間充質干細胞可能來自中胚層。小鼠或人胚胎干細胞在ESC/EB培養體系中能產生具有造血分化潛能的細胞集落BL-CFC，也產生具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化潛能的間充質干細胞集落MS-CFC。在MS-CFC生成過程中，細胞相繼表達中內胚層基因Brachyury、MixL1和Eomes，側板中胚層和胚外中胚層基因FOXF1、Gata2和HAND1、HAND2等，提示MS-CFC是胚胎發育過程中由內細胞團向中胚層分化的后代。追查骨髓中間充質干細胞基因表達，的確有中內胚層特征的Brachyur和中胚層特征基因FLK-1。但是也有些間充質干細胞表達神經嵴干細胞標志Nestin，提示它們來自神經外胚層。這些Nestin陽性細胞有間充質干細胞特征，能向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化，在體外培養中也能形成可傳代的球狀集落，移植到體內能形成小骨。人骨髓中的Nestin陽性細胞有明顯的等級分化階段性，其早期分化階段細胞的免疫表型為CD271 ⁺ CD146 ^-，相繼分化為CD271 ⁺CD146 ⁺細胞和CD271 ^- CD146 ⁺細胞。不同分化階段Nestin陽性細胞在骨髓中的定位不同，調節造血的功能也有差別，并隨年齡的增長而老化。青少年人骨髓中的Nestin陽性細胞以早期分化階段為主，CD271 ⁺ CD146 ^-和CD271 ⁺ CD146 ⁺細胞占90%以上，而55歲以上老年人骨髓中很少CD271 ⁺ CD146 ^-細胞。中胚層來源的造血微環境細胞也有等級分化階段性和隨年齡增長而老化的現象。實驗結果證明老化的造血微環境支持造血細胞的功能減弱。造血干細胞在分化過程中產生所有的血細胞，分化過程中也涉及了廣泛的表觀遺傳學調控。最新研究提出了造血干細胞相關DNA甲基化動力學的全基因組參考圖譜。該研究即使用大數據表觀基因組學方法，將DNA甲基化譜結合在許多小細胞池上，并進行單細胞甲基測序，以評估細胞與細胞的異質性。所得數據不僅鑒定了來源于胎兒肝臟、臍帶血、骨髓和外周血的造血干細胞之間的特征差異；還觀察到髓系和淋巴祖細胞、特異性的未成熟多淋巴祖細胞的譜系特異性DNA甲基化，并發現了成熟巨核細胞的進行性DNA甲基化差異。研究將這些基因與基因表達、組蛋白修飾和染色質重塑聯系起來，用機器學習方法從DNA甲基化數據中直接推導出人類造血分化的模型。這些結果有助于更好地了解人類造血干細胞的分化，并為研究血液相關疾病提供了一個指導框架。

造血干細胞自我更新和增殖分化調節一直是血液學領域的核心研究課題。早在1977年Schofield提出了壁龕“niche”假說，認為由骨髓基質細胞構成的壁龕細胞是造血干細胞自我更新的必要結構，只有定位于壁龕內的造血干細胞才能進行不對稱分裂，分裂后的子細胞留在壁龕中能保持未分化狀態，離開壁龕的子細胞則進入增殖分化程序。多年來有大量研究驗證壁龕假說，結果證明壁龕結構有細胞學基礎，由不同間充質干細胞傳代后形成的各種壁龕，其表面分子和分泌因子不同，對造血干細胞自我更新和增殖分化的調節也各有側重。已經發現骨髓中至少有兩種功能不同的壁龕，即由成骨細胞為主要細胞成員的骨內膜壁龕和由血竇內皮細胞為主要成員組成的血管壁龕。

學術界對骨內膜壁龕的認定較早。2003年在 Nature雜志同時發表了兩篇報道，證明由成骨細胞構成的骨內膜壁龕能調節體內造血干細胞池大小。他們用棘基因小鼠分別觀察了骨形成蛋白和副甲狀腺素對骨內膜壁龕數量的影響。結果發現骨形成蛋白通過結合成骨細胞表面的骨形成蛋白受體負性調節造血，減少骨內膜壁龕數量，使造血干細胞減少，重建骨髓造血的功能減弱；副甲狀腺素則通過結合骨細胞表面的副甲狀腺素受體而減少骨內膜壁龕數量，從而增加造血干細胞胞池大小和骨髓造血功能。此后關于骨內膜壁龕的細胞學組成的功能完整性的研究日益增多。有報道指出，骨內膜表面的鈣離子濃度是血清鈣離子濃度的30倍，從骨髓腔中央到骨內膜表面的鈣離子濃度梯度是調節造血干細胞歸巢和定位到骨內膜壁龕的重要因素，只有表達鈣離子敏感受體的造血干細胞才能定位于骨內膜壁龕。有報道指出，骨內膜壁龕的功能完整性還需要CD169陽性巨噬細胞的參與，清除巨噬細胞會減弱骨內膜壁龕的貯留造血干細胞的能力，造成大量造血干細胞遷移出壁龕。定位于骨內膜壁龕的造血干細胞是少數靜止狀態的LT-HSC，骨內膜壁龕的主要功能是保存LT-HSC于靜止狀態。近期對骨內膜壁龕中的骨髓內皮干細胞研究較多。

骨髓內皮干細胞可以促進培養中的造血干細胞長期重建。骨髓竇狀脈管系統對輻射敏感，但在亞致死輻射暴露后3～4周內可恢復和重建。輻射后在骨髓內皮干細胞共培養下可以營救輻射損傷的造血干細胞，且移植后具有多種造血系統重建能力。此外，Chute等人證明，在沒有移植造血細胞的情況下，將自體或異基因小鼠的骨髓內皮干細胞注入致死性輻射小鼠，可以加速骨髓血管和造血再生，顯著提高存活率。Salter等人認為移植的骨髓內皮干細胞不能移植歸巢到骨髓血管系統中，提示再生效應是通過間接作用或由骨髓內皮干細胞衍生的可溶性因子介導發揮的功能。這與臨床研究表明的骨髓脈管系統的重建主要源自宿主骨髓內皮干細胞，而非供者來源的內皮干細胞觀點相一致。

最近研究證據表明骨髓內皮干細胞在造血干細胞再生中發揮必要的作用。采用VEGFR2的基因缺失或抗體介導的血管內皮-cadherin介導的血管生成模型證實了可阻斷輻照小鼠的骨髓血管再生，導致長時間的造血毒性作用和延遲的造血干細胞再生。功能增益模型研究也表明了，骨髓內皮干細胞促進了造血干細胞的維持和更新：Tie2Cre、Bak1 ^2/2、Baxf ^1/2小鼠，與Tie2 ⁺內皮干細胞中保留BAX外源介導細胞的小鼠相比，Tie2 ⁺內皮干細胞中BAK和BAX具有骨髓血管系統和造血系統的輻射保護作用。同樣，人類主要靠骨髓內皮干細胞中Akt-mTOR通路的基因激活發揮增強造血干細胞自我更新能力，而促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）有利于造血干細胞在共培養中的分化。最近研究證實，在表達干細胞因子的小鼠模型中內皮干細胞也發揮了促進脾臟內髓外造血作用。同一研究中也證實，Tcf21 ⁺基質細胞通過分泌CXCL12等在維持脾臟髓外造血中具有必要作用。

血管壁龕主要由VEGFR2 ⁺ VEGFR3 ⁺ VE-Cadherin ⁺Sca-1 ^-血竇內皮細胞組成，血竇外還有a-SMA ⁺周細胞和Nestin ⁺網狀基質細胞外見于內皮細胞單層。造血干細胞遷移出入骨髓腔時要定位于血竇中，因此血管壁龕是造血干細胞歸巢的門戶。有研究報道血竇內皮細胞支持LT-HSC自我更新。作者將永生化的血竇內皮細胞E4ORF1 ⁺ EC單層與Sca-1 ⁺Lin ^-造血干細胞共培育于無血清體系，增補干細胞因子SCF 10ng/ml，每周分離Sca-1 ⁺Lin ^-造血干細胞到新的E40RF1 EC單層，發現4周后仍有Sca-1 ⁺Lin ^-造血干細胞擴增，并向成熟血細胞分化。從培養3周的細胞群中分離1000個造血干細胞移植到致死量輻射小鼠，觀察競爭性嵌合，結果發現在移植后12個月的受者體內有經過培育的細胞；取受者骨髓細胞作二次移植，仍有嵌合的培育細胞，證明血竇內皮細胞能支持造血干細胞自我更新和增殖分化。骨髓中遍布血竇，定位于血管壁龕的造血干細胞遠比定位于骨內壁龕的造血干細胞多，而且也比較活躍地增殖分化，說明血管壁龕是造血干細胞應對外周血需求的場所，而骨內膜壁龕則是靜止狀態造血干細胞的貯留場所。

分布在骨內膜壁龕和血管壁龕之間的nestin陽性網狀細胞被認為是正宗的“niche”細胞，它們為造血干細胞提供龕位。Nestin陽性CD271 ⁺ CD146 ^-網狀細胞靠近骨內膜，表達成骨細胞特異性轉錄因子osterix，具有成骨細胞分化潛能。靠近血竇內皮的nestin陽性網狀細胞多為CD271 ⁺ CD146 ⁺細胞，可表達周細胞特征性分子a-SMA。這些廣泛分布于骨髓腔的nestin陽性網狀細胞都生成大量趨化因子CXCL12和干細胞因子SCF，能吸引和保持大量造血干／祖細胞，調節造血干細胞歸巢和釋放，也調節造血干細胞增殖分化，可視為獨立的壁龕結構，也可作為骨內膜壁龕或血管壁龕的組成部分。Nestin陽性網狀細胞也表達腎上腺能受體β 3-AR，并有交感神經纖維與之直接接觸，傳遞信號減少CXCL12表達，促進造血干細胞釋放出壁龕。因此，nestin陽性網狀細胞也是交感神經系統節律性調節造血干細胞的生物鐘組成部分。

在胚胎內部，造血系統的發育發生在多個不同的部位，包括胚外卵黃囊、胎肝、脾臟，最后是成體骨髓。在發育后期，造血干細胞存在于胎兒肝臟。關于胎兒肝臟血管壁龕仍然存在許多問題，特別是關于出生后造血干細胞從胎兒肝臟向骨髓遷移的過程。最近的一項研究表明，nestin陽性的NG2 ⁺周細胞與門靜脈血管相關，形成了促進造血干細胞擴張的胎兒血管壁龕。在出生后肝臟中造血干細胞的快速丟失與出生后門靜脈血管循環的劇烈變化有關——在出生時確定了臍入口。因為門靜脈血管經歷了從ephrin-B2 ⁺動脈到EphB4 ⁺靜脈表型的轉變，相應的基質細胞丟失，包括nestin陽性的NG2 ⁺周細胞。這表明，出生后血液循環和血流動力學的變化改變了肝臟的脈管系統，并與造血干細胞支持細胞的丟失有關。造血干細胞隨后遷移到骨髓，在這種情況下，長期造血持續到出生后。

大多數哺乳動物造血發生在扁平骨的軸向骨架（即所謂的紅骨髓），如骨盆、胸骨、顱骨、肋骨、椎骨，以及長骨的干骺端和骺端。其他的骨髓，由高脂肪含量（“黃骨髓”）組成，可以在長骨的二聯體（軸）的中空內部找到。動脈通過骨皮質進入，終止于骨內膜（結締組織-位于致密骨內壁的結締組織），并在長骨的干骺端或深部分支。大部分的分支動脈位于干骺端，而中央骨干中幾乎沒有分支動脈。一些遠端在內膜終止于毛細血管，雖然大部分終止點在骨干骺端。在骨頭附近，小動脈打開并與靜脈竇叢吻合。這些靜脈竇通過收集小靜脈排出，并集中到中央縱向靜脈。這些小動脈與內皮細胞聯系更緊密，并被罕見的NG2 ⁺（也被稱為CSPG4 ⁺）、nestin陽性周細胞所包裹，這種細胞與竇狀相關的leptin受體（LepR） ⁺或nestin弱陽性血管周細胞不同。靜脈位于中樞性骨干，在那里它們與干骺端毛細血管相連。靜脈竇是薄壁的，由一層幾乎沒有基底膜的扁平鱗狀上皮細胞組成，覆蓋著周細胞和血管周間質細胞，包括C-X-C motif chemokine ligand 12 （CXCL12）的CAR細胞和Lepr ⁺細胞。骨髓沒有淋巴引流，所有血管都在小梁骨網內。這個解剖建立了一個循環的血液流動模式，從骨髓腔的中心向外周，然后再返回。

骨內膜壁龕的主要功能是保持龕內LT-HSC靜止。實驗結果證明由成骨細胞生成的TPO和Aug-1通過結合LT-HSC表面受體MPL和Tie傳遞信號，上調周期素激酶lyclinD1的抑制分子P21cip1和P57kin2，同時抑制C-Myc，使定位于骨內膜壁龕的LT-HSC退出增殖周期，保持靜止狀態。此外，骨內膜壁龕亦參與Wnt和Notch信號調節造血功能。

血管壁龕的主要功能是調節造血干細胞遷移和增殖。骨髓中的造血干細胞70%以上定位于血管壁龕，黏附于血竇內皮細胞。竇周nestin ⁺網狀細胞和一些nestin受體陽性周細胞生成的趨化因子CXCL1和膜結合型干細胞因子SCF，不但通過結合其相應受體CXCR4和c-kit把造血干細胞定位于龕內，而且調節造血干細胞增殖。實驗結果證明膜結合型干細胞因子是造血干細胞在骨髓內擴增不可缺少的因子。血竇內皮細胞條件性缺失SCF的轉基因小鼠骨髓中造血干細胞明顯減少，骨髓移植后不能重建受者骨髓造血的功能。由血竇周網狀細胞高表達的CXCL12，不但是吸引和貯留造血干細胞的重要分子，也可通過結合造血干細胞表面受體CXCR4傳遞信號，控制造血干細胞的擴增。實驗結果證明CXCL12-CXCR4信號軸能直接促進P57kip2表達，使細胞保持G期，說明血竇周網狀細胞通過CXCL12- CXCR4信號途徑調節造血干細胞的增殖狀態，避免過度擴增而衰竭。骨髓移植后進入血竇周龕位的造血干細胞，經條件缺失CXCR4阻止CXCL12-CXCR4信號途徑，會顯示過度擴增，對5-Fu的殺傷作用十分敏感，乃至失去重建造血的能力。

Wnt基因編碼長度為350～400個氨基酸的分泌型糖蛋白，其特征為含有22～24個保守型半胱氨酸殘基。Wnt蛋白家族作為一種分泌型信號分子，參與胚胎形成、組織器官發育和生殖系統發生。Wnt蛋白、Frizzled（Fzd或Frz）、Dishevelled（Dsh或Dvl）、GSK3、CK1、β-Catenin和TCF/LEF是Wnt信號通路中的重要蛋白。最近研究發現，經典Wnt信號Wnt3a導入OP9基質細胞后，與造血干細胞共培養，則其向B細胞、NK細胞和樹突狀細胞分化和增殖均受阻。能抑制造血祖細胞進入細胞周期，而使其保持靜止狀態。而OP9細胞同時向成骨系分化，其有關間充質干細胞特性的angiopoietin-1、c-Kit配基和VCAM-1細胞因子表達下降。說明經典Wnt信號抑制造血祖細胞的增殖。另有研究發現，N-cadherin ⁺成骨細胞表達非經典Wnt配體，并抑制穩態條件下經典Wnt信號。而在應激條件下，激活的LT-HSC非經典Wnt信號被削弱，同時經典Wnt信號被增強。因此，骨髓微環境中成骨細胞參與了非經典Wnt信號維持LT-HSC靜息狀態的調節。也有報道發現，當成骨細胞過表達可同時阻滯經典及非經典Wnt信號的抑制因子Wlf1時，前者能夠打破造血干細胞的靜止狀態，造成自我更新能力的缺失，促使造血干細胞和祖細胞在骨髓和脾增殖。

Notch通路是在進化上高度保守的信號轉導通路，通過調節細胞-細胞間的相互作用使細胞的分化和自我更新處于平衡狀態進而控制分化過程。幾乎所有組織和器官中都有表達。Notch家族成員共有4個（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）。目前在哺乳動物發現5種Notch配體，分別為Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4（Dl11、Dl13、Dl14）和Jagged1、Jagged2（與果蠅Serrate/Lag 2蛋白同源），亦可被共同稱為DSL（Delta/Serrate/Lag2）。研究發現，Notch信號通過Hes或Hey蛋白抑制Runx2轉錄活性，從而抑制成骨細胞分化而維持骨髓間充質干細胞池。研究表明，Notch信號調節造血干細胞處于未成熟狀態，減少其分化。Notch受體（Notch1～Notch4）以及配體（Delta-like1、Delta-like4和Jagged1）同時表達于造血干細胞和基質細胞，說明Notch信號能夠在造血干細胞或者鄰近造血干細胞或造血微環境中的基質細胞中活化，從而發揮調節造血功能的作用。臨床研究發現，骨髓增殖性疾病發生與骨髓微環境中造血細胞的Notch信號啟動受阻密切相關。